INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS

BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
“DR. GUILLERMO CARVAJAL SANDOVAL”
ACADEMIA DE METODOS DE ANÁLISIS

“DETERMINACIÒN DE CAFEÌNA EN
REFRESCOS DE COLA POR HPLC”

PROFESOR: GUILLERMINA ROSAS SANDOVAL

ALUMNO: RODRÍGUEZ CRUZ DANIEL
GRUPO: 5QM1 SECCIÓN: 2
RESULTADOS:

Tabla 1 TIEMPOS DE RETENCIÒN Y ÁREAS BAJO LA CURVA EN MUESTRAS Y SUSTANCIAS DE REFERENCIA

Tr Área bajo mg/100

Muestra Promedio % Der
(min) la curva mL
Sustancia de 2.467 696 641
referencia 701 111 0.901 10.4
2.467 705 581
cafeína
2.467 1 176 473
Pepsi kick 2.467 1 175 175 1 173 349 0.369 17.4
2.467 1 168 460
2.467 715 971
Dr Pepper 2.467 710 768 714 451 0.448 10.6
2.467 716 614
2.467 520 838
0.203
Red Cola 2.467 519 730 519 763 7.7
5
2.467 518 723
DISCUSION:

Tras conocer y realizar la ejecución de la técnica de cromatografía de alta resolución se

obtuvieron los resultados de las diferentes muestras evaluadas, los cuales pueden
apreciarse en la tabla 1 donde podemos observar que el contenido de cafeína
presentes en las diferentes muestras varía y que de las tres muestras evaluadas la que
mayor contenido de cafeína posee es la de Pepsi kick seguido de la de Dr Pepper y
finalmente la de Red Cola con base a los estudios realizados y a la consulta de la
bibliografía de la NORMA Oficial Mexicana NOM-218-SSA1-2011, Productos y
servicios. Bebidas saborizadas no alcohólicas, sus congelados, productos
concentrados para prepararlas y bebidas adicionadas con cafeína. Especificaciones y
disposiciones sanitarias.

Límite máximo en el producto

Aditivo Productos
listo para consumo mg/L
Bebidas, congelados, polvos,
Cafeína jarabes, concentrados y 200
concentrados de manufactura

Encontramos que los valores que contienen el producto están dentro de los límites de
referencia según lo establecido en la norma oficial, aunque la muestra de Pepsi kick
posee más cantidad de cafeína esto puede demostrarse porque dicha muestra está
elaborada con una variante donde debe contener más cafeína para poder eliminar la
sensación de sueño.

El funcionamiento del equipo consta de un software en el cual nosotros

podremos manipular el equipo a modo de ajustarlo a nuestra necesidades, la
importancia de estos equipos radica en su alta resolución para poder identificar
muestras, estos equipos utilizan sustancias de alta pureza, generalmente se le conocen
como sustancia grado HPLC en donde todas ellas se encuentran libres de iones,
macromoléculas y gases que pueden interferir con la cromatografía, es importante
recalcar los componentes y el funcionamiento del equipo para HPLC utilizado, donde el
primer componente de este equipo son los reservorios para fase móvil, que son frascos
de vidrio con paredes homogéneas que nos permitan observar el interior de éstos, en
los cuales colocamos las fases móvil, las fases móviles se encuentran separadas, una
en cada frasco de vidrio, en donde el equipo se encarga de tomar la cantidad exacta de
estas para poder realizar la mezcla y poder llevar acabo la cromatografía. Por medio de
una bomba binaria reciprocante, es decir que realiza el bombeo mediante pistones, la
fase móvil es impulsada a través de todo el sistema cromatográfico en la proporción
que se haya elegido (en nuestro caso 35:65) llegando a los inyectores, los cuales nos
permiten introducir la muestra al sistema, dicho inyector cuenta con “loop” que retiene
una cantidad constante de muestra (20 µL) independientemente del volumen que sea
inyectado, sin embargo, es necesario inyectar como mínimo el triple del volumen
retenido. Continuando con lo anterior la muestra pasa a la columna C18 (que es una
columna con baja polaridad) que tiene una longitud de 150 mm, la longitud de la
columna dependerá delo que se busca separar, ya que a mayor longitud será mayor el
paso de fase móvil y por tanto se aumentará la capacidad para realizar la separación,
pero también es importante considerar el tamaño de partícula, pues al disminuir el
tamaño se aumenta la superficie de contacto y así mismo la eficiencia de separación,
cabe destacar que generalmente el soporte es generalmente un metal que es
inoxidable, como el fierro y existen otro tipo de columnas con C8 que harán otro tipo de
separaciones. Finalmente, la muestra es detectada por un detector de UV-Vis a una
longitud de onda de 273 nm, ya que es a 273 nm donde se observa el máximo de
absorción de la cafeína. Una vez que ya fue inyectada la muestra se comienza la
lectura en el registrador y se requiere de una línea base estable por al menos 10
minutos aproximadamente, si esta no fuera estable sería indicio de que el sistema no
se lavó de manera adecuada y tendrá que comenzar de nuevo.
Cuando el sistema se encuentre en perfectas condiciones de uso se puede continuar
con la corrida analítica, en la cual utilizamos un estándar de cafeína con el objetivo de
realizar una comparación del tiempo de retención del estándar (que se define como el
tiempo que transcurre desde la inyección de la muestra (tiempo 0) hasta la aparición
del máximo de un pico) con las diferentes muestras que fueron analizadas por el
equipo de HPLC, donde se inyecto por duplicado dicho estándar y se obtuvo un tiempo
de retención de 2.467 minutos (ver tabla 1), después inyectamos la muestra de los
refrescos , Pepsi Kick , Dr. Pepper ® y Red Cola ® una vez obtenido el tiempo de
retención se pudo confirmar que las muestras contenían el susodicho en donde los
tiempos de retención oscilan en los 2.467 minutos, ver tabla 1, lo cual hace referencia
que dichas bebidas contienen el mismo analito, la cafeína, pues los tiempos de
retención son los mismos o con una pequeña diferencia. Debido a que el estándar y las
muestras se inyectaron por triplicado respectivamente, fue necesario determinar la
desviación estándar relativa (%DER) para verificar que existiera producibilidad en las
determinaciones, dichos %DER fueron en su mayoría mayores al 1.5%, establecido por
el manual, cabe destacar que este % toma muestra por triplicado, este porcentaje varía
dependiendo el analito que se desee analizar, este parámetro es muy parecido al
coeficiente de varianza lo cual indica que no hay reproducibilidad en la mayor parte del
trabajo, por otro lado, para la cuantificación de la cafeína presente en los refrescos de
cola es necesario comparar el área bajo la curva de las muestras con la del estándar,
cabe destacar que las muestras se diluyeron 1:10 y cada una fue desgasificada,
sometiéndola a un sonicador por 5 minutos donde los resultados se pueden observar
en la tabla 1.
.
 ¿Cuál es la importancia de desgasificar la fase móvil y filtrar la fase móvil y la
muestra?

Es de suma importancia el desgasificar las muestras empleadas en el equipo de HPLC

ya que éstas, al introducirse al sistema si poseen contenido gaseoso puede interferir de
manera negativa en el comportamiento del equipo Esto debido a la obstrucción de la
frita de la columna, contaminación, empaquetamiento tapado, fuga o un flujo
incorrecto derivado de la presencia del gas que provoca interacciones en las
presiones que afectan de gran manera a la columna empleada, es por ello la
importancia de desgasificar adecuadamente las muestras a evaluar y así evitar falsos
en los resultados o más importante aún averías en el funcionamiento del equipo.

 Mencionar métodos de desgasificación utilizados en HPLC

 SONIFICAZION

Se usa un baño de ultrasonido a [sonicate] los solventes en consecuencia de esto

convierten gases disueltos en burbujas diminutas que flotan a la superficie del solvente
y se eliminan. Este método es utilizado en vigor de quitar los gases pero el grado de
eliminación depende del tiempo de sonificación, tamaño del baño de ultrasonido, tipo
de solvente procesado, y volumen de solvente. Estas variables pueden conducir a
veces a situaciones donde el solvente es sólo parcialmente desgasificado causando
problemas en el sistema de HPLC. A menudo es difícil saber cuándo el solvente está
completamente desgasificado.

 HELIO SPARGING

En este método se hace burbujear gas de helio de alta pureza en el depósito solvente.
El helio desplaza los gases disueltos que están emitidos en el espacio de la cabeza del
depósito del solvente, donde se dispersan en la atmósfera. Este método puede ser
muy efectivo en la desgasificación de las muestras y solventes en HPLC pero si se usa
contínuamente puede ocasionar frecuentes reemplazos de los cilindros del helio. Estos
reemplazos son complicados y caros. Burbujear gas de helio en algunas mezclas
solventes puede causar evaporación selectiva de los solventes más volátiles.

 DEGASIFICACION ELECTRONICA EN LINEA DEL FLUJO

Es el método más nuevo disponible para desgasificar solventes en HPLC. Se situa la

unidad de desgasificación entre el depósito solvente y la entrada a la bomba de HPLC.
Como los flujos del solvente del depósito solvente embotellan a la bomba, entra en
contacto con una membrana fluoropolímerica que deja difundir los gases disueltos por
la membrana en una cámara al vacío. Este método es muy conveniente y ofrece una
desgasificación contínua del solvente cuando entra a la bomba. La eficacia de la
desgasificación con este método no es tan alta como con algunos otros métodos sobre
todo a altas velocidades de flujo (alrededor de 1ml por minuto).

 ¿En qué difiere la cromatografía de fase normal de la cromatografía de fase

reversa con respecto a la fase estacionaria, fase móvil y orden de elución?

En la cromatografía de fase normal encontraremos que la fase estacionaria presenta

puntos activos de alta polaridad y las interacciones que se producen con el soluto son
específicas del grupo activo. La fase estacionaria puede ser un sólido adsorbente
(sílice o alúmina), o bien, un soporte al que se unen químicamente moléculas orgánicas
que presentan grupos funcionales de alta polaridad.

Así bien:

 En este caso la fase estacionaria es polar y la móvil apolar.

 La retención tiene lugar en la capa liquida depositada en la fase estacionaria (polar)
y en la fase móvil (apolar)
 El analito menos polar será el primero en eluir y el más polar el ultimo en eluir

Mientras tantos en la cromatografía de fase reversa la fase estacionaria posee una

naturaleza apolar y las interacciones que se producen son de tipo inespecífico
conocidas como efecto solvófobo, así bien el mecanismo de separación depende de
interacciones hidrofóbicas entre las moléculas de soluto en la fase móvil y el ligando
hidrofóbico inmovilizado en la fase estacionaria. La naturaleza actual de las
interacciones de unión hidrofóbica asume que la interacción de unión es el resultado de
un efecto entrópico favorable. Las condiciones iniciales de unión de la fase móvil
usadas en la cromatografía de fase reversa son acuosas lo cual indica un grado alto de
estructuras de agua organizadas alrededor de las moléculas de soluto y el ligando
inmovilizado. A medida que el soluto se une al ligando hidrofóbico inmovilizado
disminuye el área hidrofóbica expuesta hacia el disolvente. Así, el grado de
organización de la estructura de agua disminuye con un favorable aumento de entropía
en el sistema

 Si se cambiara la composición de la fase móvil agua metanol (35:65) a (25:75),

¿qué sucedería en cuanto al tiempo de retención y por qué?

El tiempo de retención varía de acuerdo a las cantidades de las diversas

composiciones que se utilizan, lo que al cambiar la composición de la muestra
aumentaría el tiempo de retención por la adición del disolvente polar a la fase móvil y
disminuiría con la introducción de disolventes más hidrofóbicos ya que se modificaría el
coeficiente de partición de tal manera que el compuesto se movería por la columna y el
eluyente.

CONCLUSIONES:

 Se conoció la manera en qué operan los equipos HPLC

 Se verificó el funcionamiento de un equipo HPLC y así mismo se conoció
el software operativo de dicho sistema.
 Se validó la cantidad de cafeína presentes en las distintas muestras.
 Se corroboró según la NOM la cantidad de cafeína presente en dichas
muestras.