COST-EFFECTIVE PRODUCTION OF

BIOTECHNOLOGICALLY IMPORTANT HYDROLYTIC

ENZYMES BY SPOROTRICHUM THERMOPHILE

Resumen:

Producción económica de xilanasa y tres celulasas, endo-b-1,4-

glucanasa (CMCase), exo-b-1,4-
La glucanasa (FPasa), b-glucosidasa (BGL) se estudió en
fermentación sumergida utilizando medio de melaza de caña. Un
enfoque de optimización estadística que involucra el diseño de
Plackett-Burman y la metodología de superficie de respuesta (RSM)
dio como resultado la producción de 72,410, 36,420, 32,420 y 5180
U / l de xilanasa, CMCasa, FPasa y b-glucosidasa, respectivamente.
La optimización resultó en más de cuatro mejoras en la producción
de enzimas xilanolíticas y celulolíticas. La ampliación de la
producción de enzimas en matraces de agitación de volúmenes
variados fue sostenible, lo que sugiere un buen alcance para la
producción de enzimas a gran escala. Adición de micropartículas
con ingeniería de morfología fúngica y producción mejorada de
enzimas. La xilanasa de S. thermophile es una xilanasa neutra que
muestra su actividad óptima a 60 ° C, mientras que todas las
celulasas son óptimamente activas a pH 5.0 y 60 ° C. La eficacia del
cóctel de enzimas en la taza de té residual y la hidrólisis de la paja
de arroz mostró que el rendimiento máximo de azúcar de Después
de 24 h se lograron 578.12 y 421.79 mg / g de sustrato para la taza
de té y la paja de arroz, respectivamente. Por lo tanto, la producción
concomitante de enzimas celulolíticas y xilanolíticas será
beneficiosa para la sacarificación de lignocelulósicos en la
generación de azúcares monoméricos y oligoméricos para
biocombustibles y otras aplicaciones biotecnológicas.
Introducción

La biomasa lignocelulósica es la fuente de carbono más abundante,

inagotable y renovable compuesta por tres biopolímeros principales
de la tierra: celulosa, hemicelulosa y lignina, dispuestas en una
matriz compleja con una alta resistencia mecánica diseñada por la
naturaleza para resistir la hidrólisis [1, 2]. Las biomasas
lignocelulósicas han ganado crecientes intereses de investigación y
una importancia especial debido a su naturaleza renovable [2].
Recientemente, la bioconversión de la biomasa de lignocelulosas a
azúcares fermentables (tanto pentosa como hexosa) por
microorganismos en un solo paso ha atraído una atención
considerable para la producción sostenible de productos limpios y
asequibles de alto valor como el etanol, azúcares, proteínas de una
sola célula, combustibles líquidos y gaseosos [2 , 3]. Las enzimas
lignocelulolíticas tienen un interés sustancial como catalizador en
diversas aplicaciones biotecnológicas debido a la hidrólisis eficiente
de la biomasa a través de la sacarificación enzimática
principalmente por
Las xilanasas y las celulasas. La producción de bioetanol a partir de
residuos lignocelulósicos, un representante típico de los
biocombustibles de segunda generación según una terminología
recientemente aceptada, ha atraído la atención de los investigadores
desde la década de 1970, cuando se desató la crisis mundial del
petróleo [1, 3]. La utilización de lignocelulosa para la producción de
combustibles y productos químicos tiene el potencial de cambiar el
mundo económica, social y ambientalmente [1, 3].

Los hongos filamentosos son los principales productores de

celulasas y hemicelulasas en la industria. Entre los hongos
filamentosos,
Los hongos termofílicos están ganando considerable atención por
parte de los investigadores, ya que las enzimas termoestables
funcionan a temperaturas elevadas, lo que disminuye la demanda de
agregar más enzimas debido a la desnaturalización de las proteínas
[4].

Además, el aumento de la velocidad de reacción, la viscosidad

reducida y la menor contaminación son una ventaja adicional de las
enzimas termoestables de los moldes termofílicos [4, 5]. Entre
varios moldes termófilos, Sporotrichum thermophile syn.
Myceliphthora thermophila es conocida como un potente productor
de celulasas y hemicelulasas [1, 4].
El análisis del genoma y los datos experimentales también
sugirieron que Sporotrichum thermophile es capaz de hidrolizar
todos los polisacáridos principales encontrados en la biomasa y un
potente productor de todas las enzimas biotecnológicas importantes,
incluidas las celulasas y las xilanasas [4]. El costo de producción de
la enzima está determinado en gran medida por la materia prima
utilizada para la producción.
Para aplicaciones industriales, el costo de las enzimas es uno de los
principales factores que determinan la economía de un proceso. El
uso de diseños estadísticos en procesos biotecnológicos ha adquirido
una importancia inmensa en la optimización de la producción de
enzimas [6-10]. Esta investigación describe la formulación de un
medio de melaza de caña rentable para la producción concomitante
de celulasas y xilanasa por el molde termofílico S. thermophile
BJAMDU5 y su aplicabilidad en la hidrólisis de papel de taza de té
de desecho y paja de arroz.

materiales y métodos
Microorganismo y condiciones de cultivo.
El molde termofílico, Sporotrichum thermophile
BJAMDU5 se aisló de una muestra de compost obtenida de Rohtak,
Haryana, India y se cultivó de forma rutinaria en medio de agar
YpSs [11] de Emerson [g / l Almidón (15.0), Extracto de levadura
(4.0), K2HPO4 (1.0), MgSO4.7H2O (0.5 ), pH
7,0 ± 0,2)] a 45ºC y se conserva a 4ºC y también a -20ºC en glicerol.
Identificación molecular del molde El hongo aislado se cultivó en
medio líquido de Emerson YpSs a 45ºC durante 3 días a 200 rpm. El
ADN genómico se extrajo según lo descrito por Sharma et al. [12].
La amplificación por PCR de 18SrDNA de hongos se realizó
utilizando el cebador directo NS1 (50-
GTAGTCATATGCTTGTCTC-30) y reve.

Efectos de los surfactantes en la producción de enzimas celulolíticas

y xilanolíticas Para estudiar el efecto de diferentes surfactantes en la
producción de enzimas, el medio optimizado (g / l melaza de caña 8,
extracto de levadura 5.0, MgSO4 1.0, paja de arroz 15, K2HPO4
1.0, Tween 80 15.0) se complementó con Tween 20, Tween 60,
Triton X-100 y SDS a una concentración similar a Tween 80. El
medio sin Tween 80 sirvió como control. Validación del proceso y
producción de enzimas a gran escala.

La viabilidad de la producción de enzimas se probó en matraces de

agitación de volúmenes variados (0,25 a 1,0 l), en condiciones
optimizadas. Los matraces Erlenmeyer que contenían medio
optimizado se incubaron a 45ºC y 200 rpm. La fermentación se llevó
a cabo durante 72 hy los filtrados de cultivo se utilizaron para los
ensayos enzimáticos.
Efectos de las micropartículas en la morfología y producción de
enzimas por S. thermophile en medio optimizado.

El efecto de las micropartículas (polvo de talco y óxido de aluminio)

sobre la producción de enzimas se verificó a diferentes
concentraciones en el medio optimizado. Las micropartículas se
autoclavaron por separado y se mezclaron con el medio de forma
aséptica durante la inoculación. La fermentación se llevó a cabo
durante 72 hy los filtrados de cultivo se utilizaron para los ensayos
enzimáticos. La morfología del hongo se observó bajo microscopio
compuesto. Caracterización físico-química de enzimas hidrolíticas.

El efecto del pH en las actividades de las enzimas se investigó

incubando las mezclas de reacción a 60ºC utilizando soluciones de
sustratos a diferentes valores de pH. Estas soluciones se prepararon
utilizando los siguientes tampones (0.1 M) glicina - HCl (pH 2.0–
3.0), acetato de sodio (pH 4.0–6.0) y tris-HCl (pH 7.0–9.0). Las
actividades enzimáticas también se determinaron incubando las
mezclas de reacción a varias temperaturas que oscilan entre 40 y
80ºC a un pH óptimo. Los efectos de la glucosa y el etanol sobre la
enzima b-glucosidasa se evaluaron con la adición de glucosa (25–
100 mM) o etanol (5–40%) a la mezcla de reacción (Pereira et al.
2015). Los ensayos enzimáticos se llevaron a cabo en tampón de
acetato de sodio 0,1 M, pH 5,0, a 60ºC.

Hidrólisis de los residuos de papel de la taza de té y paja de arroz

por enzimas.
La hidrólisis enzimática se llevó a cabo utilizando 5 g de sustrato
(paja de arroz y papel de taza de té de desecho) en 50 ml de tampón
de acetato de sodio (pH 5.0) y se incubó con 1 ml de muestra de
enzima a 60 ° C en un agitador de incubadora a 150 rpm.

Las muestras se extrajeron después de intervalos regulares y se

analizaron para reducir el azúcar como se describe anteriormente.
Los controles de sustrato y enzima se realizaron por separado y sus
valores se restaron de los valores de prueba.
Todos los experimentos se realizaron por triplicado y se presentan
sus valores promedio junto con la desviación estándar.

Resultados

Identificación molecular del hongo.

El amplicón de la región de ADNr 18S de los aislados de hongo
tenía un tamaño de aproximadamente 1,7 Kb. La secuenciación del
amplicón dio como resultado una secuencia larga de 900 bases que
se realizó con la base de datos del banco de genes en NCBI. La
secuencia conocida más cercana que mostró la máxima homología
con la secuencia de consulta fue Myceliophthora thermophila ATCC
42464 cromosoma 7 con un 97% de homología. Myceliophthora
thermophila es el sinónimo de Sporotrichum thermophile.

La secuencia de nucleótidos se envía en la base de datos con el

número de acceso KP752044. Optimización de componentes medios
para mejorar la producción de enzimas utilizando diseño estadístico
Sporotrichum thermophile BJAMDU5 produjo xilanasa
(16.900 U / l) y celulasa (9160.10 U / l) simultáneamente en el
medio basal de melaza de caña optimizado por el enfoque de "una
variable a la vez" a pH 5.0, 45 C y 200 rpm después de 72 h (Fig.
1a). Con el fin de mejorar las enzimas xilanolíticas y celulolíticas,
los componentes del medio se optimizaron aún más mediante el uso
de enfoques estadísticos. La Tabla 1 presenta el diseño de Plackett-
Burman para 11 variables seleccionadas y la respuesta
correspondiente, es decir, la producción de enzimas xilanolíticas y
celulolíticas. El gráfico de Pareto se utilizó para mostrar el efecto de
todas las variables en la producción de enzimas (Fig. 1b).
A partir del análisis, se encontró que la producción de enzimas se
vio significativamente afectada por la paja de arroz, Tween-80 y
K2HPO4. Estas variables (paja de arroz, Tween-80 y
K2HPO4) mostró efectos más grandes en comparación con otras
variables y, por lo tanto, se consideró que era altamente significativo
para la producción de enzimas celulolíticas y xilanolíticas por S.
thermophile BJAMDU5. Por lo tanto, estas variables fueron
optimizadas aún más por RSM. Los resultados obtenidos para las
enzimas xilanolíticas y celulolíticas se analizaron utilizando el
análisis de varianza (ANOVA) según sea apropiado para el diseño
experimental utilizado. La ecuación de regresión calculada para la
optimización de los componentes del medio mostró la producción de
enzimas (Y) en función de estas variables. Al aplicar el análisis de
regresión múltiple en los datos experimentales, se encontraron las
siguientes ecuaciones para explicar la producción de enzimas:
Producción de xilanasa (U / l):
Los niveles de producción de enzimas xilanolíticas y celulolíticas se
muestran en la Tabla 3. La calidad del modelo se puede verificar
utilizando varios criterios, como el coeficiente de determinación (R2
ajustado), el coeficiente de correlación (R2 predicho), la precisión
adecuada, los valores de P [ El valor de F y Model F se proporciona
en la Tabla 4. Todos estos valores explican la buena variabilidad y la
importancia del modelo utilizado para la optimización de estas
enzimas. Del resultado se concluyó que para la producción de
xilanasa B, C, A2, B2,
C2, AB, AC, A3, C3, ABC; para CMCase A, B, C, A2, B2,
C2, AB, AC, BC, A3, B3, C3, ABC; para FPase C, B2, AC y para b-
glucosidasa A, B, C, A2, B2, C2, AB, AC, A3, B3,
C3, ABC son términos significativos del modelo.
Las gráficas de contorno y las gráficas tridimensionales de las
interacciones entre las variables mostraron un aumento en la
producción de enzimas, ya que la concentración de cada variable
aumentó a un nivel óptimo, después de lo cual la producción de
enzimas disminuyó (Fig. 2a-d). El gráfico de superficie de respuesta
que muestra la interacción entre K2HPO4 y Tween 80 para las
enzimas xilanasa reveló que la producción de enzimas aumentó con
el aumento en Tween 80 y K2HPO4 hasta
1,5% (v / v) y 0,1 (% p / v), respectivamente, seguidos de

Descenso posterior (fig. 2a). Las concentraciones óptimas de Tween

80 y K2HPO4 para la producción de FPasa fueron similares a las de
la xilanasa (Fig. 2b). Los títulos altos de la b-glucosidasa se
alcanzaron en las condiciones en que todas las variables estaban
presentes en sus niveles óptimos (Fig. 2c, d).
Los valores óptimos para la producción de enzimas obtenidos a
partir de los gráficos de contorno y tridimensionales fueron casi
iguales a los resultados obtenidos por las ecuaciones de regresión.
(3-6). Los valores reales para la producción de xilanasa, CMCasa,
FPasa y BGL se registraron como 70,412, 36,428, 36,408 y 11,187U
/ l, respectivamente, mientras que sus respectivos valores previstos
fueron 72107.11, 36550.27, 36550.27 y 11284.75 U / l,
respectivamente. Se encontró que el valor experimental estaba muy
cerca del valor predicho y, por lo tanto, el modelo se validó
exitosamente. Hubo una mejora de más de 4.0 veces en la
producción de enzimas xialonilíticas y celulolíticas por S.
thermophile en melaza de caña.
Validación del proceso y producción de enzimas a gran escala.
El proceso se validó mediante la repetición del experimento en
condiciones optimizadas que condujeron a títulos de enzimas
sostenibles
de 70,102, 36,201, 36,001, 11,208 U / l para xilanasa, CMCasa,
FPasa y b-glucosidasa, respectivamente, y así, demostrando la
validez del proceso y el modelo. Los títulos de enzimas también
fueron sostenibles en matraces Erlenmeyer de volúmenes variados
(0,25–1,0 l) (Tabla 5). Efecto de los surfactantes y micropartículas
en la producción de enzimas Entre los diferentes surfactantes, se
registró una alta producción de enzimas en un medio que contiene
Tween 80 en comparación con otros surfactantes (Fig. 3). Los títulos
de enzimas de todas las enzimas fueron altos en el medio que
contiene Tween 80 (70,120, 40,760, 40,670, 11,800 U / l para
xilanasa, CMCase, FPase, bglucosidase, respectivamente) seguido
de Tween 60 y Tween 20. Mientras que Triton X-100 un detergente
no iónico, y SDS, un detergente aniónico inhibió la producción de
enzimas.
La adición de óxido de aluminio en el medio de melaza de caña
mejoró la producción de enzimas por el termófilo de molde
termófilo S. en comparación con el polvo de talco y el control
(Tabla 6). Sin embargo, la morfología del molde también se vio muy
afectada por ambas micropartículas. El diámetro y el tamaño de los
gránulos miceliales se redujeron significativamente mediante
micropartículas en comparación con el control (datos no mostrados).
Caracterización físico-química de hidrolíticos.
Enzimas La xilanasa de S. thermophile es una xilanasa neutra que
muestra su actividad óptima a pH 7.0 (Fig. 4a). Hubo más del 80%
de actividad, se mantuvo a pH 5.0 y 6.0. Sin embargo, hubo una
actividad muy baja (10-20%) en condiciones alcalinas. En contraste,
todas las celulasas (CMCasa, FPasa, b-glucosidasa) mostraron una
actividad óptima a pH 5.0 (Fig. 4a). Todas las enzimas mostraron
sus actividades óptimas a 60 ° C (Fig. 4b). Hubo más de 60 y se
observaron 25% de actividades a 70 y 80 C, respectivamente. La b-
glucosidasa de S. thermophile mostró una tolerancia potencial a la
glucosa y al etanol incluso en concentraciones más altas (Fig. 5a).
Esta enzima también mostró una buena actividad en presencia de
etanol, reteniendo el 25% de su actividad original incluso a la mayor
concentración de etanol (Fig. 5b).
Aplicaciones de las enzimas en la hidrólisis de los desechos del
papel de la taza de té y la paja de arroz La eficacia de las enzimas
crudas de S. thermophile
Se evaluó BJAMDU5 en papel de taza de té residual e hidrólisis de
paja de arroz. Hubo un aumento continuo en la liberación de
azúcares reductores con el aumento del tiempo de sacarificación
(Fig. 6). El rendimiento máximo de azúcar de 578.12 y 421.79 mg /
g de sustrato para el papel de taza de té y la paja de arroz,
respectivamente, se obtuvieron después de 24 h de hidrólisis.
Discusión
La melaza de caña apoya la producción concomitante de celulasas y
xilanasa por el molde termofílico S. thermophile
BJAMDU5. La melaza de caña, un subproducto de la industria
azucarera, es una de las fuentes más baratas de azúcar que consiste
en aproximadamente 50% (p / p) de azúcares totales (principalmente
sacarosa, glucosa y fructosa), agua, proteínas y grasas crudas,
metales pesados, Las vitaminas y otros nutrientes tienen el potencial
como una fuente de carbono rentable que podría servir como medio
para

Microorganismos industriales productores de enzimas,

especialmente hongos filamentosos [8, 9, 17, 18]. Recientemente He
et al. [18] informaron sobre la producción de celulasa y xilanasa por
un moho mesófilo Trichoderma reesei en melaza de caña. A
temperatura de 45 C y pH 5.0, el molde mostró la producción
máxima cuando se optimizó la condición por una variable en un
enfoque de tiempo según lo informado anteriormente por Singh y
Satyanarayana [8]. El diseño de Plackett-Burman es un diseño
estadístico bien establecido y ampliamente utilizado para la
selección de los componentes del medio [16]. Las variables (paja de
arroz, Tween-80 y K2HPO4) mostraron efectos mayores en
comparación con otras variables y, por lo tanto, se consideraron
altamente significativas para la producción de enzimas celulolíticas
y xilanolíticas por S. thermophile BJAMDU5.
Por lo tanto, estas variables fueron optimizadas aún más por RSM.
Se ha logrado una mejora general de más de 4.0 veces como
resultado de la optimización en la producción de enzimas
xialonlíticas y celulolíticas por S. thermophile en melaza de caña.
De manera similar, las melazas de caña soportaron altos títulos de
enzimas lignolíticas [18] y fitasa [8, 9] por T. reesei y S.
thermophile, respectivamente. Narendhirakannan y Manivannan [2]
también informaron una mejora de 4.0 veces en la producción de
enzimas celulóticas y xilanolíticas de Trichoderma reesei
NRRL3652 debido a la optimización estadística. Del mismo modo,
la optimización estadística.

dio como resultado una producción mejorada de xilanasa 1,44 veces

por Thermomyces lanuginosus SDYKY-1 [10], FPasa 3,0 veces por
Aspergillus niger HN1 [6], fitasa 2,0 veces por S. thermophile [8] y
xilanasa 2,0 veces por A. fischeri fxn 1
[7].
Los títulos de enzimas fueron sostenibles en matraces de agitación
de diversos tamaños (0,25–1,0 l), lo que hizo la viabilidad del
proceso para la producción a gran escala. Hubo pocas mejoras en los
títulos de enzimas cuando se incrementó la proporción de volumen
medio a matraz según lo informado para la producción de xilanasa
por Bacillus licheniformis [19] y la producción de fitasa por S.
thermophile [8, 9] La mejora en la producción de enzimas puede
deberse a una mayor cantidad de nutrientes