FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE TÉCNOLOGIA MÉDICA

ESPECIALIDAD EN LABORATORIO CLÍNICO Y ANATOMÍA PATOLÓGICA

UNIVERSIDAD CONTINENTAL

Curso: INSTRUMENTACIÓN Y AUTOMATIZACIÓN EN EL LABORATORIO CLÍNICO

Tema: ESPECTROFOTOMETRO

PARESENTADO POR:

Garay Taipe, Rocío Luz

Saldaña Medina, Marieta

Cárdenas Ramos, Jhasmin

Ramirez Salazar Karoline

Villaverde Carhuamaca Giam Pier

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 HUANCAYO PERÚ 2018

INTRODUCCION

Cada compuesto químico absorbe, transmite o refleja luz (radiación electromagnética) a lo largo
de un cierto rango de longitud de onda. La espectrofotometría es una medida de la cantidad que
una sustancia química absorbe o transmite.

Un espectrofotómetro es un instrumento que mide la cantidad de fotones (la intensidad de luz

absorbida después de que pasa a través de una solución de muestra. Con el espectrofotómetro,
la cantidad de una sustancia química conocida (concentraciones) también se puede determinar
mediante la medición de la intensidad de la luz detectada. Dependiendo de la gama de longitud
de onda de la fuente de luz, se puede clasificar diferentes tipos:

En espectrofotometría visible, la absorción o la transmisión de una cierta sustancia se puede

determinar por el color observado. Por ejemplo, una muestra de solución que absorbe la luz en
todos los rangos visibles (es decir, no se transmite ninguna de las longitudes de onda visibles)
aparece negro. Por otro lado, si se transmiten todas las longitudes de onda visibles (es decir no
se absorbe nada), la muestra de solución aparece blanca. Si una muestra de solución absorbe la
luz roja (-700nm), parece ser verde porque el verde es el color complementario del rojo.
Espectrofotómetros visibles, en la práctica, utilizaban un prisma para reducir un cierto rango de
longitud de onda (para filtrar las otras longitudes de onda), de modo que el haz particular de la
luz se hace pasar a través de una muestra de solución.

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 INDICE

INTRODUCCION 2

1.ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN 4

2.PRINCIPIOS ESPECTROFOMETRICOS 5

2.1-Caracteristicas de la luz 5
2.2 .-Caracteristicas de la longitud de onda 5

3.Espectro electromagnético 5

4.ESPECTROFOTÓMETRO 7

4.1 PROPÓSITO DEL EQUIPO 7

4.2 PRINCIPIOS DE OPERACIÓN 7
4.3 COMPONENTES DEL ESPECTROFOTOMETRO 11
4.3.1 FUENTE LUMINOSA 12
4.3.2 PORTADOR DE MUESTRAS 12
4.3.3 SISTEMA DETECTOR 12
4.3.4 SISTEMA DE LECTURA 13

5 MANTENIMIENTO DE EL ESPECTOFOTROMETRO 14

6 BUENAS PRÁCTICAS DE USO DEL ESPECTROFOTÓMETRO 16

7 FENOMENOS QUE AFECTAN LA LEY DE BEER 16

8 CONCLUSION 17

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1. ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN

¿El color de las cosas se mantiene cuando hay oscuridad total? ¿El color es dependiente de una
fuente externa de energía luminosa?

Si observamos una disolución acuosa de Cu2+ a trasluz percibimos un color azulado. Esta
coloración se debe a la interacción de los iones cobre con la radiación lumínica que atraviesa la
disolución. Más concretamente, se debe a la absorción de algunas radiaciones lumínicas que
corresponden al “color complementario” (en este caso el amarillo). Las radiaciones no absorbidas
son las que atraviesan la disolución sin obstáculo alguno y llegan a nuestro ojo. En nuestro
ejemplo, estas radiaciones “transmitidas” corresponden al color azul. Una solución roja absorbe la
luz verde y transmite o refleja la luz roja. En ausencia de luz, las sustancias no tienen color.

Siguiendo con el ejemplo de la solución de cobre, si comparamos el color de dos disoluciones de

Cu2+ con diferente concentración, observamos que a mayor concentración corresponde una
mayor intensidad de color azul de la disolución. Por lo tanto podemos saber la concentración de la
sustancia según la intensidad del color. Esta propiedad de la interacción de la luz con una gran
cantidad de especies químicas nos permitirá identificar y cuantificar analitos, dando lugar a una
rama de la química analítica denominada espectrofotometría.

La espectrofotometría estudia los fenómenos de interacción de la luz con la materia. En general,

cuando una lámpara ilumina cualquier objeto, pueden suceder algunos fenómenos: La luz puede
ser emitida, reflejada, transmitida o absorbida. Desde que sabemos que la energía no puede ser
destruida, la cantidad total de luz debe ser igual al 100%; por lo tanto, cuando un objeto es
iluminado, se puede medir cuánta radiación ha sido reflejada o transmitida y podemos decir
entonces cuánta fue absorbida, cuál es la cantidad que ha interactuado con el objeto.

La espectroscopia de absorción, está relacionada con el hecho de que una sustancia absorbe la luz,
provocando que los electrones “salten” de un nivel de energía a otro mayor; este fenómeno
permite explicar por qué algunas sustancias son coloreadas como el I2 y el CrO4 2-, mientras que
otras como el agua y el NaCl no.

La espectroscopia ha jugado una parte importante en el desarrollo de la bioquímica. Se ha

utilizado para medir velocidades de reacción catalizadas por enzimas, para medir concentraciones
de compuestos, determinar conformaciones estructurales e interacciones moleculares.

En los años sesentas y setentas esta técnica se volvió muy utilizada que fue una continuación de la
colorimetría. En estas décadas se hacían análisis de sustancias inorgánicas, principalmente metales
a niveles de traza. En combinación con la extracción líquido-líquido, se conseguían
determinaciones de compuestos de interés.

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Las longitudes de onda utilizadas en el laboratorio comprenden a la luz visible y ultravioleta. Para
entender mejor cómo se lleva a cabo el fenómeno de la espectroscopia, es necesario entender lo
que es la radiación electromagnética y la Ley de Lambert-Beer.

2. PRINCIPIOS ESPECTROFOMETRICOS
2.1 -Caracteristicas de la luz

Debido a que la espectrofotometría comprende mediciones con detectores de la radiación

electromagnética que se transmite, es fundamental conocer las principales características de la
ración electromagnética. La luz es una forma visible de radiación electromagnética, o sea, se
comporta como si tuviera campos eléctricos y magnéticos oscilando en planos perpendiculares
entre sí.

2.2 .-Caracteristicas de la longitud de onda

La luz como toda radiación electromagnética, está formada de fotones o paquetes de energía que
viajan en ondas. El espectro electromagnético se describe en términos de longitud de onda (ʎ),
número de onda (𝑐𝑚−1), y electrón volts.

La longitud de onda del espectro electromagnética del espectro electromagnético es la distancia

entre los máximos de ondas sucesivas. En el sistema internacional se mide en nanómetros (nm =
10−9 m).

El número de onda es el reciproco de la longitud de onda. El número de ondas por segundo se

denomina frecuencia. La longitud de onda se relaciona inversamente con la energía. Mientras
mayor es la longitud de onda, menor es el número de fotones que contiene. En otras palabras, la
longitud de onda larga es de baja energía. De manera similar, la longitud de onda corta posee más
energía.

3. Espectro electromagnético

La radiación electromagnética consta de rayos gamma, rayos X, ultravioleta (UV), visible, infrarrojo
(IR), microondas de radio.

-Los rayos gamma tienen mayor energía (longitud de onda corta)

-Las ondas de radio tienen menor energía (longitud de onda larga).

-En espectrofotometría de absorbancia se utilizan en las regiones UV cercana (200-280 nm),

ultravioleta (10-200nm)

-La región visible (380-780 nm).

-La región infrarroja cercana (780-3000 nm), medio (3000-20000 nm), lejano (30000-300000 nm).

En la mayor parte de los instrumentos del laboratorio de química clínica se emplea la radiación
electromagnética UV y visible. Ocasionalmente se utiliza la espectroscopia de infrarrojo en el

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laboratorio de toxicología para identificar y confirmar fármacos o productos químicos tóxicos. Los
rayos gamma se usan en contadores de ensayo radio inmunológico.

El conjunto de radiaciones electromagnéticas se llama espectro electromagnético y es conveniente

agruparlas en regiones para poder conocer sus propiedades. En la figura se muestran las zonas del
espectro según la clasificación más aceptada. Como se puede observar la zona del visible
(radiaciones percibidas por nuestro ojo) es muy pequeña en comparación con la gran amplitud del
espectro. Aunque hablamos de una radiación determinada (λ), físicamente es imposible aislar
dicha radiación. Siempre podremos obtener un rango de radiaciones pequeño según la exactitud
del dispositivo de selección (difractares de radiación y filtros), pero nunca una sola. De la misma
manera que no podemos obtener o aislar un punto de una recta, sino un trozo pequeño (un
conjunto de puntos).

Fig. 2. Espectro de radiaciones electromagnéticas

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4. ESPECTROFOTÓMETRO

La palabra espectrofotómetro se deriva de la palabra latina spectrum, que significa imagen, y de la

palabra griega phos o photos, que significa luz. El espectrofotómetro, construido mediante
procesos avanzados de fabricación, es uno de los principales instrumentos diagnósticos y de
investigación desarrollados por el ser humano. Utiliza las propiedades de la luz y su interacción
con otras sustancias, para determinar la naturaleza de las mismas. En general, la luz de una
lámpara de características especiales es guiada a través de un dispositivo que selecciona y separa
luz de una determinada longitud de onda y la hace pasar por una muestra. La intensidad de la luz
que sale de la muestra es captada y comparada con la intensidad de la luz que incidió en la
muestra y a partir de esto se calcula la transmitancia de la muestra, que depende de factores
como la concentración de la sustancia.

Un espectrofotómetro es un instrumento utilizado para determinar a qué longitud de onda la

muestra absorbe la luz y la intensidad de la absorción. Aunque varían en el diseño, todos los
espectrofotómetros consisten de una fuente de luz, un selector de longitud de onda, un
contenedor transparente en el cual se deposita la muestra, un detector de luz y el medidor.

Las aplicaciones de la espectrofotometría son amplias y variadas. En este trabajo se revisarán los
conceptos ya enumerados con más detalle.

4.1 PROPÓSITO DEL EQUIPO

El espectrofotómetro se usa en el laboratorio con el fin de determinar la concentración de una

sustancia en una solución, permitiendo así la realización de análisis cuantitativos.

4.2 PRINCIPIOS DE OPERACIÓN

Como principio básico se considera que la luz es una forma de energía electromagnética, que en el
vacío tiene una velocidad constante [C] y universal de aproximadamente 3 x 108 m/s. En cualquier
otro medio (transparente) por el que pase la luz, su velocidad será ligeramente inferior y podrá
calcularse mediante la siguiente ecuación:

v0 =C
n

Dónde:

v = velocidad a través del medio por el que pasa la luz

n = índice de refracción del medio, cuyo valor oscila, por lo general, entre 1,0 y 2,5

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La luz, al pasar o interactuar con diversos medios, presenta una serie de fenómenos, entre los que
destacan la reflexión, refracción, difracción, absorción, difusión, polarización y otros que son
utilizados en diversos instrumentos y dispositivos. La siguiente tabla muestra los rangos de
longitud de onda en donde se utiliza el espectro luminoso para realizar pruebas de
espectrofotometría.
Con respecto a la interacción de la luz con la materia, el siguiente esquema ayuda a entender la
complejidad de los fenómenos que ocurren:

El esquema muestra que la radiación incidente [Io] sufre una serie de transformaciones. Parte de
la misma se refleja [Ir], parte se transmite [It], parte se difunde [Id] y parte se absorbe e incide
directamente en fenómenos como la fluorescencia [If]. Los fenómenos en los que se basa la
espectrofotometría son principalmente la absorción y la transmisión. Para entender cómo se
utilizan, es necesario adicionalmente tener en cuenta la ley de Beer Lambert.

Ley de Beer Lambert. Se conoce también como ley de Beer o de Beer Lambert Bouguer e identifica
la relación existente entre la concentración de la muestra y la intensidad de la luz transmitida a
través de la misma. Con relación a la ley en mención hay implícitos dos conceptos: transmitancia
[T] y absorbancia [A].

La transmitancia [T] es la fracción de la luz incidente que a una determinada longitud de onda pasa
a través de la muestra. Se define por la siguiente relación:

T = It
Io

Dónde:
It = intensidad de la radiación transmitida
Io = intensidad de la radiación incidente
El porcentaje de transmitancia [%T] puede expresarse por la siguiente ecuación:
A = x l x c
Dónde:

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A = absorbancia medida
ε = coeficiente de absortividad molar [litros/moles/cm]
l = distancia de la trayectoria recorrida por la luz dentro de la muestra
c = concentración de la muestra [moles/litros]

La absorbancia [A] se relaciona con la transmitancia [T] mediante la siguiente ecuación:

El siguiente esquema explica el fenómeno de la absorbancia A:

Fenómeno de Absorbancia

Las curvas que se presentan a continuación muestran cómo varía la absorbancia [A] y la
transmitancia [T] en función de la concentración [C], de acuerdo con la ley de Beer Lambert, en la
que se basa la espectrofotometría.

Grafica de transmitancia

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Grafica de Absorbancia

Como conclusión puede inferirse que, a medida que aumenta la concentración de una sustancia, la
tramitación disminuye y que, al aumentar la concentración de la sustancia, aumenta la
absorbancia.

La linealidad de la ley de Beer Lambert se ve afectada, si se presentan las siguientes condiciones:

1.- Corrimientos en el equilibrio químico de la muestra cono una función de concentración.

2.-Desviaciones en los coeficiente de absortividad, concentraciones mayores de 0.01 M debido a

la interacción electrostática entre moléculas cercanas.

3.-Cambios en el índice de refracción a altas concentraciones de analito.

4.-Difusion de la luz debido a partículas en la muestra.

5.-Fluorescencia o fosforescencia de la muestra.

6.-Radiacion monocromática.

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4.3 COMPONENTES DEL ESPECTROFOTOMETRO

El esquema que se presenta a continuación describe la interrelación de los diversos componentes

de un espectrofotómetro.

Se muestra un espectrofotómetro con detector simple y con un simple rayo. Un filtro del
monocromador selecciona un rango de longitudes de onda de la fuente de radiación para ser
enviada a la muestra en el mismo compartimento. La radiación trasmitida es detectada con un
fotodiodo y convertido a una señal por un procesador de señales.

Los componentes más importantes son:

1.-Fuente Luminosa

2.-El Monocromador

3.-El Portador de Muestras

4.-El sistema detector

5.-El sistema de lectura

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4.3.1 FUENTE LUMINOSA

Dependiendo del tipo de espectrofotometría, la fuente luminosa puede ser una lámpara con
filamento de tungsteno para luz visible, o una lámpara de arco de deuterio para luz ultravioleta.

Algunos fabricantes han diseñado espectrofotómetros con lámparas intermitentes de xenón de

alta duración que emiten luz en el rango de la luz visible y ultravioleta. La lámpara o lámparas
vienen montadas de fábrica en una base que permite asegurar una determinada posición, para
que se mantengan las condiciones de ajuste óptico y enfoque cuando está en operación o se
requiere reemplazarla. La energía radiante típica que emite una lámpara de tungsteno está entre
los 2 600 y los 3 000 °K (grados Kelvin).

4.3.2 MONOCROMADOR

Está compuesto por un conjunto de elementos. En general, dispone de una rendija o ranura de
entrada que limita la radiación lumínica producida por la fuente y la confina en un área
determinada, un conjunto de espejos para pasar la luz a través del sistema óptico, un elemento
para separar las longitudes de onda de la radiación lumínica, que puede ser un prisma o una rejilla
de difracción, y una rendija de salida para seleccionar la longitud de onda con la cual se desea
iluminar la muestra. Las rejillas de difracción tienen la ventaja de eliminar la dispersión no lineal y
son insensibles a los cambios de temperatura.

4.3.3 PORTADOR DE MUESTRAS

Está diseñado para sostener la muestra que se quiere analizar dentro del rayo de luz de longitud
de onda determinada por el monocromador. El elemento que contiene la muestra es una celda o
cubeta se fabrican de vidrio, si se requieren efectuar estudios en el rango de los 340 a los 1000nm
y de sílice, si el análisis está en el rango comprendido entre los 220 y 340 nm. También hay celdas
de materiales plásticos como estireno o poliestireno. El portador de muestras lo diseñan los
fabricantes de acuerdo al tipo de espectrofotómetro y de muestra a analizar, por ello se
encuentran portadores de muestra con microceldas, aunque también tubos de ensayo y otras
variantes como las celdas de flujo continuo.

4.3.4 SISTEMA DETECTOR

El sistema de detección puede estar diseñado con fotoceldas, fototubos, fotodiodos o

fotomultiplicadores. Esto depende de los rangos de longitud de onda, de la sensibilidad y de la
velocidad de respuesta requeridas. El sistema de detección recibe la energía lumínica proveniente
de la muestra y la convierte en señal eléctrica proporcional a la energía recibida. La señal eléctrica
puede ser procesada y amplificada, para que pueda interpretarse a través del sistema de lectura.

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Tabla de ventajas y desventajas de dispositivos de deteccion

4.3.5 SISTEMA DE LECTURA

La señal que sale del detector recibe diversas transformaciones. Se amplifica y se transforma para
que su intensidad resulte proporcional al porcentaje de transmitancia/absorbancia. Existen
sistemas de lectura de tipo análogo (muestra la magnitud leída sobre una escala de lectura) o
digital (muestra la magnitud leída en una pantalla).

Los indicadores de tipo análogo reciben tradicionalmente el nombre de metros. Su exactitud

depende, entre otros factores, de la longitud de la escala y del número de divisiones que tenga.
(Mientras más divisiones, más exacto). Su principal desventaja es que pueden ser mal leídos, por la
fatiga de los operadores o errores, cuando disponen de varias escalas, al tratar de identificar las
escalas sobre las que deben realizar las lectura.Los indicadores digitales usualmente presentan los
resultados en una pantalla, en forma de caracteres alfanuméricos luminosos. Esto los hace menos
propensos a que se cometen errores de lectura.

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5 MANTENIMIENTO DE EL ESPECTOFOTROMETRO

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6 BUENAS PRÁCTICAS DE USO DEL ESPECTROFOTÓMETRO

 Realizar la calibración del espectrofotómetro, cada vez que se realiza el análisis de un

grupo de muestras.
 Mantener cerrada la tapa del portamuestras durante el proceso de medición, para
asegurar una lectura adecuada.
 No reutilizar las cubetas desechables.
 Utilizar únicamente cubetas de cuarzo, para efectuar análisis por debajo de los 310 nm.
 Evitar el uso de cubetas plásticas, si se utilizan solventes orgánicos.
 Utilizar cristalería de boro silicato de alta calidad para preparar los estándares. Evitar el
uso de cristalería de sodio –óxido de sodio– siempre que sea posible, debido a que el
contacto prolongado con los estándares puede permearla y, en consecuencia, producir
resultados erróneos.
 Limpiar cuidadosamente las cubetas de vidrio después de utilizarlas. Desechar aquellas
que presenten rayones en la superficie pulida.
 Utilizar en lo posible reactivos de alta calidad.
 Reactivos de baja calidad pueden causar contaminación incluso en concentraciones muy
bajas.
 Los diluyentes utilizados–agua o solventes– deberán estar libres de impurezas.
 Verificar que las muestras o estándares no se han desgastado dentro de las cubetas.
 Este fenómeno produce burbujas sobre la superficie interna de las cubetas y errores en las
lecturas.
 Tener en cuenta, cuando se pretenda utilizar nuevos procedimientos, que no todas las
sustancias cumplen con la ley de Beer.
 Efectuar pruebas de linealidad sobre el rango de concentraciones a ser utilizadas.
 Se recomienda preparar un grupo de soluciones fuertes –conocidas– y verificar los
resultados.
7 FENOMENOS QUE AFECTAN LA LEY DE BEER :
 Las altas concentraciones de asociación molecular de especies iónicas.
 Variaciones en la hidratación de bajas concentraciones dan cambios a la naturaleza de los
iones.
 Absorciones que no obedecen, lo que indica la gráfica de estándares conocidos lo que
indica lectura versus concentración.

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8 CONCLUSION:

Se ha llegado a la conclusión de que la espectrofotometría es un método analítico indirecto

porque se basa en la medición de la absorbancia o transmitancia de las radiaciones; es de gran
utilidad en la actualidad para la identificación de un analito en una muestra problema.

La espectrofotometría es el método más usado, debido a que es sencillo, específico y sensible.-

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