PROCEDIMIENTO- Biotecnología

TÉCNICA DE AISLAMIENTO POR ESTRÍA CRUZADA (Cultivo puro)

1. Etiquetar cada tubo con el nombre de la Cepa bacteriana, grupo y fecha.
2. Realizar una suspensión de la cepa pura en un tubo que contenga 5 mL de solución salina
estéril.
3. Inocular en este orden las pruebas bioquímicas.
4. Incubar a 35° C durante 24 horas e incubar una serie de medios de cultivo sin inocular para
observar las reacciones por cambios de coloración

Esquemas para inocular los diferentes medios de cultivo

Determinación del metabolismo oxidativo/fermentativo en medio Hugf y Leifson
Presencia de la enzima Citocromo- oxidasa.

Presencia de la enzima catalasa

4. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL- Química analítica
4.1. Preparación de la muestra
- Pesar en un vidrio de reloj una muestra aproximada de 0,5 gramos de cemento previamente
triturada y pulverizada.
- Pasar la muestra cuantitativamente a un vaso de precipitados de 50 mL, agregar lentamente
y con mucho cuidado aproximadamente 20 mL de HCl (1:1 (v/v)); medidos con una probeta
y evaporar lentamente hasta sequedad.
Nota: se debe evitar que parte de la solución o del residuo sean proyectados fuera del vaso
durante el proceso de calentamiento. Si esto sucede, se debe iniciar el análisis nuevamente.
Para evitar este hecho se tapa el vaso con un vidrio de reloj.
4.2. Filtración
- Al residuo seco se le agrega 1,5mL de ácido clorhídrico concentrado y luego 20mL de agua
destilada, se agita de tal forma que se moje todo el sólido, luego se añaden 20mL de agua
destilada y se agita; después de 5 minutos de reposo se filtra en papel franja negra y luego se
lava bien con agua caliente unas seis veces o más hasta que el filtrado que se desprende del
embudo no tenga cloruros (comprobar la presencia de cloruros adicionando a unas gotas del
filtrado una gota de una solución de nitrato de plata, la formación de una solución blanca
indica la presencia de cloruros). El filtrado se desecha.
4.3. Calcinación
- Previo a la práctica el personal de laboratorio lavará el crisol y lo secará en una estufa a
250°C durante 3 horas. Al iniciar la práctica, los estudiantes deben apagar la estufa y dejar
enfriar el crisol en un desecador y luego pesarlo.
- Una vez finalizada la filtración sacar el papel de filtro franja negra del embudo, doblar los
extremos para cubrir el precipitado y colocarlo en el crisol de porcelana (previamente
marcado y pesado), calentar el crisol hasta carbonizar el papel, evitando formación de llama.
Tener cerca la tapa del crisol por si fuera necesario su uso.
- Después de carbonizar el papel, colocar el crisol y su contenido en la mufla y calcinar a
900°C durante una hora, esperar hasta que la temperatura baje hasta 200 °C, sacar el crisol y
colocarlo en un desecador, taparlo, dejarlo enfriar y finalmente pesarlo.
- Calcular el porcentaje de SiO 2 en la muestra de cemento dada.
%SiO 2 =peso del precipitado obtenido x 100/peso de la muestra
Nota: El proceso de carbonización y reducción a cenizas del papel filtro se realiza con un
mechero. Cuando se realiza este proceso existe el peligro de que la humedad sea expulsada
tan rápidamente en los momentos iniciales del calentamiento que se produzcan pérdidas
mecánicas del precipitado. Una posibilidad del mismo orden aparece si se deja que el papel
se inflame.
Para minimizar estas dificultades el crisol se coloca como indica la Figura 1. La posición
inclinada del crisol permite el libre acceso de aire. Debe situarse en posición próxima una
tapa de crisol limpia, a punto para usarla si es necesario. Luego se empieza a calentar con
una llama del mechero. Esta se aumenta gradualmente a medida que se desprende la humedad
y el papel se empieza a carbonizar. El humo que se desprende sirve de guía con respecto a la
intensidad de la calefacción que es tolerable. Normalmente, este humo empieza a salir en
tenues volutas. Si el volumen de humo emitido aumenta rápidamente, se tiene que apartar
temporalmente el mechero; pues ello indica que el papel está próximo a inflamarse. Si, a
pesar de las precauciones, aparece una llama, se debe ahogar inmediatamente con la tapa del
crisol. Finalmente, cuando ya no se aprecian más humos, el carbón residual se elimina
haciendo descender el crisol gradualmente hacia el interior de la llama máxima del mechero.