Manual de Bioquímica: Colorimetría y Fotometría

Manual de Praá cticas de Bioquíámica
PRACTICA 2
COLORIMETRIA Y FOTOMETRIA
Muchos experimentos en bioquímica dependen de la absorción de la luz
monocromática, de una solución, en la región visible y ultravioleta del espectro
electromagnético. Muchas moléculas de interés biológico absorben la luz en la longitud de
onda comprendida entre 200 - 800 nm ó 2000 - 8000 Å. Por ejm., purinas, pirimidinas y ácidos
aromáticos, así mismo los ácidos nucleicos y las proteínas. Otros ejm., son las hemoproteínas
(citocromos, hemoglobina y mioglobina) carotenoides y esteroides.
Muchos compuestos, sean o no coloreados, tienen la capacidad de absorber luz de una

determinada longitud de onda; pero en otras casos es necesario transformar la sustancia a un
derivado coloreado, usando un reactivo adecuado.
Tanto el color (colorimetría) como la transmitancia (fotometría) de la luz de una solución

pueden usarse como medida de su concentración.
La colorimetría es un procedimiento por el cual una solución coloreada de un material

de concentración desconocida se compara, mediante el color, con un estándar que contiene
una concentración conocida del mismo material. Hoy se usa poco ésta técnica. La mayor parte
de procedimientos analíticos usan el principio fotométrico, es decir, la medida de potencial
transmisor de luz de una solución coloreada, a una longitud de onda espectral específica.
Muchos aparatos llamados "colorímetros" son realmente fotómetros según la estricta
definición. Si la longitud de onda puede seleccionarse a lo largo de un intervalo continuo,
interponiendo un prisma o una red de dispersión, entre la fuente de luz y la muestra, el
instrumento se denomina "espectrofotómetro".
En fotometría o en espectrofotometría se compara la transmitancia de la luz a través de

una solución que contiene materiales absorbentes con la transmisión de la misma luz a través
de otra solución que solo contiene disolvente. Esta última se denomina solución de referencia
o reactivo blanco o simplemente blanco; debe ser idéntica a la primera excepto en que carece
de los materiales absorbentes de la luz que han de estudiarse. Ambas soluciones deben
medirse bajo idénticas condiciones de longitud de onda, intensidad de luz incidente y anchura
de cubeta (longitud de paso de luz).
1. ENERGIA RADIANTE
Las radiaciones electromagnéticas, conocidas corrientemente como luz, están
compuestas por paquetes de energía llamados fotones o cuantos. De acuerdo a la longitud de
onda, se conocen tres zonas: a) Ultravioleta (UV), comprende radiaciones de 100 a 300 nm de
longitud; b) Luz Visible (color), está constituida por radiaciones electromagnéticas de 390 a
770 nm de longitud de onda y c) El Infrarrojo, entre 2000 a 30000 nm.
Una onda de luz posee campos eléctricos y magnéticos oscilantes que están en fase,
pero son perpendiculares a la dirección de propagación. La longitud de onda, de la luz, se da
en cm y se relaciona con la velocidad de luz en el vacío, en cm/seg, y con la frecuencia, en
ciclos/seg:
Longitud de onda (), es la distancia entre los nudos de dos ondas de radiación
adyacente. Se mide en cm, nm, mm, mm, Å.
La velocidad (c), de propagación en el vacío es de 3 x 1010 cm/seg y algo menor al

atravesar sustancias transparentes.
1
La frecuencia (v), es el número de oscilaciones por segundo. Se expresa en ciclos/seg.

La luz interacciona con la materia principalmente a través del campo eléctrico oscilante.
Para fines de absorción debe tenerse en cuenta que la luz es un paquete de energía o fotón
hv, donde h es la constante de Planck, 6.627 x 10-27 ergios segundo, y v es la frecuencia. De
aquí se desprende que la energía de la luz es directamente proporcional a la frecuencia:
y según la ecuación anterior inversamente proporcional a la longitud de onda.
Hay absorción de luz cuando la energía del fotón, hv, corresponde a la diferencia entre
los niveles de energía de la molécula.
2. LEYES DE ABSORCION
En Química Biológica se emplea la fotometría principalmente para regular o controlar la
concentración de diversas especies en mezclas de reacción. La absorción de luz a una
longitud de onda dada, está relacionada con la concentración de especies absorbentes por
medio de dos leyes.
2.1. Ley de Lambert. Lambert estudió la cantidad de luz monocromática absorbida por un
cuerpo y enunció la ley que dice: "la fracción de luz absorbida es proporcional al espesor del
absorbente x, e independiente e la intensidad de luz", o en otros términos, "la proporción de
luz incidente, absorbida por el medio, es independiente de su intensidad y cada sucesiva capa
unidad de medio, absorbe una fracción igual de la luz que pasa a través de él". Por ejm., si la
luz incidente es 100% y cada capa unidad de espesor x, absorbe el 20% de la luz incidente, la
luz transmitida es el 80%. Para otras capas unidad de espesor x, la luz transmitida disminuirá
como sigue: 64%, 51.2%, etc. que es la secuencia (0.8) 0, (0.8)1, (0.8)2, (0.8)3, etc. Lo que
conduce a la expresión matemática:
Donde:
I0 = Intensidad e la luz incidente
I = Intensidad de la luz transmitida
x = grosor de la capa en cm
α = coeficiente de absorción del medio
En forma logarítmica tenemos:
Al pasar al sistema logarítmico de base 10, el coeficiente de absorción c, se convierte

en coeficiente de extinción molar k
o sea
por tanto
Donde: log I0/I es la densidad óptica (D.O.) o absorbancia (A). A es directamente

proporcional a x.
2.2. Ley de Beer. Beer estudió la influencia de la concentración de la solución de una

sustancia coloreada sobre la transmisión de la luz monocromática y halló la misma relación
21
entre la transmisión y el espesor de la capa atravesada. Teniendo en cuenta que la luz se

absorbe solamente cuando un fotón choca con una molécula, la ley de Beer puede anunciarse
como sigue: "cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un medio absorbente, la
cantidad de luz absorbida o la probabilidad de absorción es proporcional al número de
moléculas c, contenidas en el haz de luz".
donde: c = concentración en mol/l.
Cuando en la ley anterior, la transmitancia disminuye exponencialmente con el número

de moléculas absorbentes. Por ejm., en el caso anterior se hizo variar el espesor de la capa,
ahora si hacemos que el espesor de la capa sea constante, es decir que sea 1 cm y variamos
la concentración de la solución de la sustancia coloreada tenemos que: si consideramos la Io
como 100% y la absorbancia de cada una de las concentraciones c, es 50% de la luz
incidente, la luz transmitida es 50%. Para otras concentraciones c, la luz transmitida disminuirá
como sigue: 25%, 12.5%, 6.25%, 3.13%, etc.
La ley de Beer es exacta sólo para luz monocromática y en muchos casos no se cumple
sobre todo a concentraciones altas.
2.3. Ley de Beer-Lambert. Es evidente que pueden combinarse las leyes de Beer y Lambert,
ya que tanto c como K incluyen un factor de concentración, de donde:
E = coeficiente de extinción molar

c = concentración en moles/litro
De aquí se deduce:
por consiguiente:
La ley combinada de Beer-Lambert nos dice que: "la fracción de luz incidente absorbida
por una disolución, a una determinada longitud de onda, está relacionada con el espesor de la
capa absorbente x, y con la concentración c, de la especie que absorbe". La Ley de Beer -
Lambert supone que la luz incidente es paralela y monocromática, y que las moléculas del
disolvente y del soluto están orientadas al azar.
2.4. Coeficiente de extincion molar. Por definición, el coeficiente de extinción molar E, es la

densidad óptica (log10 I0 / I) de una solución 1 M de la sustancia con un recorrido luminoso de 1
cm y generalmente se escribe E 1cm 1mol/l. La densidad óptica carece de dimensión, por lo que E
se expresa en términos de litros (concentración x longitud). E se expresa en unidades de litros
moles-1cm-1; es decir, en cm2 / mmol y es numéricamente equivalente a la densidad óptica de
una solución milimolar de la sustancia con un recorrido luminoso de 1 cm. Con frecuencia se
utiliza el término E 1cm 1%, que es la extinción de una solución al 1% (1 g/100 ml) cuando el
camino recorrido por la luz es igual a 1 cm.
2.5. Coeficiente de extincion específica. En muchas ocasiones no se conoce el peso

molecular de algunos compuestos tales como proteínas y ácidos nucleicos presentes en una
21
mezcla y entonces se acostumbra expresar la concentración en g/l. En estos casos, se emplea

el coeficiente de extinción específico. Se le define como la densidad óptica de una solución al
10% (10g/l) del compuesto cuando el recorrido de la luz es 1 cm, E 1cm 10g/l.
2.6. Transmitancia (T). Es la capacidad de una solución para transmitir la luz. Se define como
la relación entre la intensidad de la luz que sale de la solución y la intensidad de luz entra a
ella.
Si la solución es absolutamente transparente I = 1, y su transmitancia será 1; este valor

es tanto menor de 1 cuanto mayor sea la luz absorbida por la solución. Se acostumbra,
también, expresar la transmitancia como porcentaje, es decir, porcentaje de luz transmitida:
Por tanto, los valores de T % van de 0 a 100%. Como la transmitancia va de 0 a 100%,

la expresión de Beer - Lambert será:
2.7. Absorbancia (A) o Densidad Óptica (D.O) o Extinción (E). Es la cantidad de luz
absorbida por una solución, equivalente al logaritmo negativo de la transmitancia y se mide en
unidades de 0 a 2 en la escala de absorción; 2 es el logaritmo de 100% de transmitancia. Este
es ó puede también calcularse restando a 2 el logaritmo del
porcentaje de transmitancia;
Si se construye una gráfica de A en función de c, se obtiene una recta, pues la

absorbancia es directamente proporcional a la concentración. La pendiente de la recta es Ex, y
el valor de la ordenada para c = 0 se considera cero.
Ejm. En un espectrofotómetro se ha ajustado al 100% la transmitancia de luz con agua

(blanco); la lectura de una solución de K 2Cr2O7 en el mismo espectrofotómetro indica que T%
= 50 y la absorbancia es 0.301.
Solución: Hemos dicho que -log T ó -log I/I0 se denomina absorbancia. En este ejemplo:
Como:
tenemos:
reemplazando tenemos:
21
Ya que en la práctica, siempre se ajusta la transmitancia a 100% (cuyo log = 2), la

absorbancia se puede calcular a partir de:
2.8. Limitaciones de la Ley de Beer-Lambert. Aunque la ley de Lambert se cumple en todos

casos hasta hoy estudiados, la de Beer tiene algunas alteraciones. Algunas veces la relación
lineal entre la absorbancia y la concentración predicha por la ley de Beer, no se cumple. Los
tres tipos de desviaciones son: a) instrumentales, que pueden ser ópticos, mecánicas o
ambas, b) las relacionadas con las muestras y; c) experiencia del investigador.
2.8.1. Desviaciones Instrumentales. La ley de Beer solo se cumple para luz monocromática.
En la práctica nunca se obtiene luz totalmente monocromática. La monocromaticidad puede
variar cambiando el ancho de la rendija.
Para la región visible del espectro se usan los fotocolorímetros. Difieren de los
espectrofotómetros en que usan filtros para obtener luz monocromática en lugar de un prisma
o red y una rejilla. Los filtros dejan pasar una ancha banda de luz; por ejm., un filtro de 540 nm
deja pasar una luz que oscila entre 525 y 555 nm. Por el contrario las rendijas de los
espectrofotómetros ayudan a seleccionar mejor la longitud de onda a usarse, por lo cual se
puede suponer que con estos aparatos la ley de Beer tiene una menor desviación. También, la
ley de Beer se desvía con la luz no paralela.
2.8.2. Desviaciones Debidas a la Naturaleza de la Muestra. Se deben al cambio en la

concentración efectiva de la especie absorbente o la interferencia debida a los productos de
alguna reacción secundaria.
Muchas especies absorbentes contienen grupos ácidos o básicos. Puesto que los
conjugados del par ácido-base tienen una absorción diferente, si no se controla el pH habrá
desviaciones. De igual modo, si el equilibrio de la especie depende de la temperatura, habría
desviaciones si la temperatura sufre cambios. Si las moléculas del absorbente se absorben a
las paredes de la celda durante el curso de la observación, disminuyen la concentración
efectiva en la disolución y producen desviaciones aparentes de la ley de Beer, Los disolventes
también pueden cambiar las características de absorción. Las soluciones muy concentradas,
que originan un color muy intenso, también originaran desviaciones ya que la ley se cumple
solo hasta cierto límite máximo de concentración, característico para cada sustancia.
2.8.3. Desviaciones Debidas al Investigador. Principalmente se deben a una mala elección

de longitud de onda. La longitud de onda de la luz empleada debe coincidir con el máximo de
absorción de la solución. Esto permite también conseguir la sensibilidad óptima.
3. RANGOS ADECUADOS DE CONCENTRACION

Es muy difícil medir la concentración de las soluciones con exactitud por
espectrofotometría, ya que en algunos casos la intensidad de radiación transmitida I, es muy
pequeña, mientras en otras es muy alta. En la práctica, I debe de estar entre el 10% y el 90%
de Io (es decir, la absorbancia debe de estar entre 1.0 y 0.05), pero las medidas más seguras
se realizan cuando I » 50% de Io (es decir, absorbancia = 0.3). Estas condiciones pueden
conseguirse modificando la concentración del compuesto, el espesor de la célula o cambiando
la longitud de onda de la radiación (es decir, variando E). El primer procedimiento es el que se
realiza con más frecuencia.
4. CALCULO DE LA CONCENTRACION DE UNA MUESTRA PROBLEMA
21
Existen tres formas de cálculo.
4.1. Mediante el factor de calibracion (Fc). Resulta de dividir la concentración del estándar
entre la absorbancia del estándar:
el factor obtenido se multiplica por la lectura o absorbancia del o de los tubos que contienen la
solución problema, obteniéndose así la concentración de la muestra o muestras. Para
expresar la concentración en porcentaje, se toma en cuenta el volumen utilizado 100/V.
Según la Ley de Beer - Lambert tenemos que:
donde:
Ast = absorbancia del estándar o patrón
Am = absorbancia de la muestra problema
Cst = concentración del estándar o patrón
teniendo en cuenta que el espesor X es constante y que la tratarse de soluciones de la misma

sustancia el coeficiente de extinción K, será el mismo. Relacionando las dos expresiones
tenemos:
despejando:
Ya que tanto la lectura del problema como del patrón son equivalentes a la absorbancia,
se tiene:
Nótese que Cst / Ast es un constante y puede usarse como un factor sobre todo cuando
se va a determinar la concentración de una serie de muestras. Por tanto, la ecuación anterior
se puede reducir a :
donde: Fc = factor de calibración (Fc = Cst/Ast); esta expresión referida a porcentaje se

escribe:
v = volumen de la muestra utilizada para la determinación.
4.2. Mediante curvas de calibración. En este caso se utilizan varios patrones de

concentraciones progresivas y un blanco (el blanco contiene todos los componentes de la
muestra menos la sustancia a determinar). Luego se realiza la lectura (de absorbancia)
usando el filtro o la longitud de onda para la cual la sustancia tiene la máxima absorción. Se
registra el valor de absorbancia en una tabla.
Luego se construye una gráfica en un sistema de coordenadas, colocando las lecturas

correspondientes a los patrones en el eje de las "y" (eje de ordenadas) y las concentraciones
de los mismos en el eje de las "x" (eje de abscisas), con lo cual se obtiene una recta, que pasa
21
por cero si la sustancia obedece la ley de Beer-Lambert.
La muestra problema dará una lectura o absorbancia determinada que se busca en el

eje de las ordenadas de la gráfica anterior, luego por este punto se traza una perpendicular a
dicho eje hasta encontrar la curva (trazada con la lectura y concentración de los patrones). En
seguida, por este punto de intersección se traza una paralela al eje de ordenadas hasta tocar
el eje de abscisas (eje de concentración). Por lo tanto, la concentración de la muestra
problema está dada directamente por este punto del eje de abscisas.
En la curva de calibración puede observarse que hay una parte de la curva dentro de la
que se cumple perfectamente la ley de Beer-Lambert, es la parte recta que corresponde a una
función lineal. Sin embargo, puede también aplicarse a valores superiores por extrapolación
siempre que las desviaciones con respecto a la recta no sean muy grandes. Además el uso de
la gráfica elimina los errores que podrían aparecer como consecuencia del uso del cálculo de
proporcionalidad en una región donde no se cumple la ley de Beer-Lambert. Esto último
corrobora la norma general que preconiza el uso de soluciones patrón para las comparaciones
colorimétricas cuyas densidades ópticas sean lo más cercanas posible al valor del problema.
4.3. Mediante la ecuación A = Ecx. Ecuación obtenida de la combinación de las leyes de

Beer-Lambert (en la que x es un valor constante por ser los tubos uniformes, o por usarse una
sola cubeta para hacer la lectura). Para esto se calcula una E relativa mediante , para
los patrones, (los valores hallados deben ser iguales si la sustancia cumple la ley de Beer).
El coeficiente de extinción debe mantenerse constante para un intervalo de

concentraciones de patrones y problemas. Una vez obtenido un valor E, la concentración de la
muestra se determina mediante la ecuación que sigue:
1. ESPECTROS DE ABSORCION. Se llama espectro de absorción a la gráfica que

representa la absorbancia en función de la longitud de onda. Muchos compuestos
contienen espectros característicos de absorción en la región visible y ultravioleta, lo cual
hace posible la identificación de dichos materiales en una mezcla.
Figura 1.
Espectros de
Absorción del
naftaleno,
antraceno y
tetraceno
21
2. VALORACIONES ESPECTROFOTOMETRICAS. El curso de una reacción química o la

posición de un equilibrio pueden determinarse en forma rápida con un espectrofotómetro si
puede medirse la absorción de uno de los componentes. Como ejemplo tenemos las curvas
de valoración de los indicadores:
donde las formas protonizadas o no protonizadas (o ambas) son coloreadas. Los máximos de
absorción para las dos formas suelen estar separados, por lo que se puede medir la
concentración de cualquiera de las formas. Si se disuelven cantidades iguales del indicador en
tampones de diverso pH y se mide la absorbancia en uno de los máximos de absorción, se
puede calcular el pK. La determinación espectrofotométrica del pK es el mejor método. El pK
se debe determinar a diversas concentraciones para comprobar las desviaciones de la ley de
Beer.
3. ESPECTROFOTOMETRIA Y ENZIMAS. Por las grandes ventajas de comodidad,

sensibilidad, amplio espectro espectral y una selección fina de longitud de onda, el
espectrofotómetro se utiliza en enzimología, principalmente, en tres tipos diferentes de
determinaciones: a) se puede determinar la concentración de un compuesto midiendo la
densidad óptica a una longitud de onda bajo condiciones en que no ocurran cambios y
suponiendo que el coeficiente de extinción del compuesto es conocido; b) se puede seguir
el curso de una reacción en un sistema completo de ensayo, midiendo la velocidad de
formación o desaparición de un compuesto absorbente de luz. Para este tipo de medidas
se dispone de espectrofotómetros que representan gráficamente la densidad óptica frente a
tiempo; c) un tercer tipo de medida interesante para la identificación de compuestos
requiere la determinación de la densidad óptica en función de la longitud de onda. También
este caso se dispone de instrumentos que trazan la curva automáticamente.
PARTE EXPERIMENTAL
EXPERIMENTO N° 1. ESPECTROS DE ABSORCION Y LONGITUD DE MAXIMA

ABSORBANCIA DE ALGUNAS MOLÉCULAS.
OBJETIVO:
 Realizar la curva espectral del rojo de fenol.
 Determinar la longitud de onda de máxima absorbancia del rojo de fenol.
FUNDAMENTO
Si se mantiene constante el espesor (x) y la concentración (c), la absorbancia (A)
dependerá de la longitud de onda (λ); esto permite hallar la curva espectral, así como la
longitud de onda de máxima absorción de las diferentes moléculas.
Puesto que los compuestos coloreados presentan espectros de absorción

característicos, la selección cuidadosa de las longitudes de onda de máxima absorción
permitirá analizar los componentes de las sustancias.
MATERIAL
Espectrofotómetro.
Tubos de ensayo
Gradillas
Pipetas
Solución de rojo de fenol 1 x 10-4 M
21
METODO DE TRABAJO
Calibrar el espectrofotómetro a cero utilizando agua destilada como blanco. Luego,
determinar la extinción de solución problema, usando todo el rango espectral del equipo.
Medir en un tubo de ensayo 1 ml de rojo de fenol adicionarle una gota de NaOH y

mezclar.
Anote las absorbancias para cada longitud de onda y para la solución problema,
teniendo especial cuidado de anotar la longitud de onda de máxima absorbancia
DATOS EXPERIMENTALES
 Rojo de fenol
RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUCIÓN, BIBLIOGRAFÍA

Para obtener los espectros de absorción y la longitud de máxima absorbancia, utilice
papel milimetrado y grafique los valores de absorbancia de la solución (corregidos para la
absorción del disolvente, si se usó otro en vez de agua) en las ordenadas en función de la
longitud de onda que se coloca en las abscisas. Luego unir los puntos con un trazo suave.
Anotar en la gráfica, la longitud de onda de máxima absorbancia para cada solución. Luego
consigne la discusión, la conclusión o conclusiones a las que arriba y la bibliografía
consultada.
EXPERIMENTO N° 2. DEMOSTRACION DE LA LEY DE BEER Y CONSTRUCCION DE

CURVAS DE CALIBRACION
OBJETIVOS
Poner en evidencia la ley de Beer-Lambert haciendo uso de concentraciones
progresivas del rojo de fenol.
FUNDAMENTO
21
Si se mantiene constante la longitud de onda de máxima absorción, la absorbancia

dependerá de la concentración
MATERIALES
Espectrofotómetro.
Tubos de ensayo
Gradillas
Pipetas
Rojo de fenol 1x10-4 M
Buffer borato 0.1 M, pH 9.8
Agua destilada
METODO DE TRABAJO
a) Curva de calibración para el rojo de fenol. Prepare un sistema de tubos como se indica a
continuación y lea a 540 nm:
TUBO N° Bl 1 2 3 4 5 6
Buffer borato 0.1 M, pH 9.8 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0
Rojo de fenol 1 x 10-4 M -- 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
Agua destilada 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 --
Concentración
Tubo
de Rojo de Ab Fc
N°
Fenol (M)
Bl
1
2
3
4
5
6
RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIÓN, BIBLIOGRAFÍA

Para obtener las curvas de calibración, utilice papel milimetrado y grafique los valores
de absorbancia en las ordenadas y la concentración del colorante en las abscisas. Debe tener
en cuenta que el tamaño de los ejes en el plano deben ser del mismo tamaño, independiente
de la escala, para obtener una línea recta de aproximadamente 45°. Determinar el factor de
calibración promedio. Luego consigne la discusión, la conclusión o conclusiones a las que
arriba y la bibliografía consultada.
CUESTIONARIO
1. Un compuesto presenta un máximo de absorción a 660 nm. Para una concentración 0.75
µM se obtuvo una absorbancia de 0.4. Sabiendo que el límite de sensibilidad del método
utilizado es de 0.1 µM a 3 µM, calcule la concentración de este mismo compuesto
correspondiente a una absorbancia de 0.85.
2. El coeficiente de absorción específico de un complejo de glucógeno-iodo a 150 nm es

0,20. Calcular la concentración de glucógeno en una disolución del complejo yodado que
tiene una absorción de 0.38 en una cubeta de 3 cm de espesor.
3. Un enzima puro que contiene molibdemo tiene un coeficiente de absorción específico de
21
1.5 en una cubeta de 1 cm de espesor. Una disolución concentrada de la proteína se vio

que contenía 10,56 mg de Mo/ml. La misma disolución diluida 1:50 tenía un valor de
absorbancia a 280 nm igual a 0.375. Calcular el peso molecular mínimo de la enzima. El
peso atómico del Mo es 95.94.
21
PRACTICA N° 3
CARACTERIZACION DE AMINOACIDOS
Los aminoácidos son los sillares de construcción de las proteínas. El número de

aminoácidos comunes se reduce a 20. Todos con excepción de la prolina, tiene un grupo
carboxilo libre y un grupo amino libre no sustituido unido al carbono a. Difieren unos de otros
en la estructura de su cadena lateral que se denomina grupo R. Siendo su estructura general:
Los aminoácidos son importantes en la alimentación humana. En forma de proteínas los

aminoácidos realizan una multitud de funciones estructurales, hormonales y catalíticas
esenciales para la vida. Por lo tanto, no sorprende que defectos genéticos en el metabolismo
de los aminoácidos pueden conducir a transtornos graves como el retraso mental y muerte
temprana. Además de sus actividades como proteínas, los L-aminoácidos y sus derivados
participan en funciones intracelulares tan diversas como transmisión nerviosa, regulación del
desarrollo celular y en la biosíntesis de porfirinas, purinas y pirimidinas así como urea.
REACCIONES QUIMICAS DE LOS AMINOACIDOS

Los aminoácidos presentan reacciones de significación biológica que evidencian su
capacidad de interactuar covalentemente entre sí mediante el grupo -carboxilo de una
molécula y el -amino de otra molécula para formar un enlace peptídico.
Los aminoácidos participan además en una gran variedad de reacciones químicas que
incluyen la alquilación, arilación y acilación del grupo amino, la formación de ésteres y
anhídridos que implican al grupo carboxilo y reacciones similares en las que interviene los
grupos reactivos de las cadenas laterales. El conocimiento de estas reacciones es útil en
varios aspectos importantes de la química proteica:
a. Para identificar y analizar los aminoácidos en un hidrolizado proteico.
b. Para identificar la secuencia de los aminoácidos en las proteínas.
c. Para la identificación de los residuos específicos de aminoácidos requeridos para la función
biológica de las proteínas.
d. Para producir cambios en la actividad biológica de la proteína mediante modificaciones
químicas de los residuos de los aminoácidos constituyentes.
e. Para la síntesis química de los polipéptidos.
Dentro de las principales reacciones podemos mencionar:

1. REACCION CON ACIDO NITROSO.- El ácido nitroso reacciona con los grupos amino
primarios alifáticos con liberación de nitrógeno para formar alcoholes. Esta reacción puede ser
usada para estimar cuantitativamente los aminoácidos midiendo la cantidad de nitrógeno
liberado.
21
2. REACCION CON NINHIDRINA.- Usada para la determinación cuantitativa de los

aminoácidos y péptidos. Los aminoácidos reaccionan con la ninhidrina para dar un
característico color azul violáceo llamado azul de Ruheman con una absorción máxima a 540
nm a excepción de la prolina e hidroxiprolina que dan un color amarillo, con una absorción
máxima a 440 nm. La ninhidrina es reducida y el aminoácido es desaminado y descarboxilado.
La determinación cuantitativa puede hacerse también midiendo el CO 2 desprendido.
3. REACCION CON EL DINITROFLUOROBENCENO (DNB).- El grupo amino reacciona con

el DNB en condiciones alcalinas para formar un derivado amarillo. Esta reacción es importante
en la determinación del grupo amino terminal en proteínas, lo que permite identificar el
aminoácido iniciador de la cadena polipeptídica. Ya que al realizar la hidrólisis ácida de la
proteína se libera el aminoácido N-terminal arilado; pudiendo ser identificado por
cromatografía en papel o capa fina.
4. REACCION CON CLORURO DE DANSILO.- Un grupo amino libre reacciona con el cloruro
de dansilo para formar un compuesto fluorescente que puede detectarse y medirse en
cantidades pequeñas, mediante métodos fluorimétricos.
21
5. REACCION CON FENILISOTIOCIANATO.- Es la reacción de Edman para determinar el N-

terminal de una cadena polipeptídica. El fenilisotiocianato reacciona con los -aminoácidos
para dar los ácidos feniltiohidantóicos correspondientes. Estos ácidos al ser tratados con
solventes no hidroxilados, como el nitrometano; se ciclan para dar las feniltiohidantoínas; las
cuales son reconocidas por cromatografía de gas-líquido, de papel o de capa fina.
6. REACCION CON CLORURO DE TRIOFLUOROACETILO.- Se utiliza en la cromatografía

de gas-líquido. Los derivados trifluoroacéticos se volatilizan fácilmente sin descomponerse
para separarse por cromatografía gas-líquido mientras que los aminoácidos libres se
descomponen.
Las reacciones antes señaladas son comunes a todos los aminoácidos. Pero los
aminoácidos presentan reacciones que dan color y dependen de su cadena lateral y por lo
tanto, son más específicas en la identificación de aminoácidos. Entre las reacciones químicas
que se usan para la detección o estimación de algunos aminoácidos específicos tenemos:
reacción xantoproteica, reacción de millon, reacción del acetato de plomo, reacción de
sakaguchi, etc. Cuyo fundamento se explica en la parte experimental.
21
DETERMINACION DEL PUNTO ISOELECTRICO EN LOS AMINOACIDOS

Los aminoácidos presentan propiedades eléctricas por lo que son considerados como
anfolitos, puesto que poseen un grupo ácido y un grupo básico. En solución existen como
moléculas cargadas. En su punto isoeléctrico, existen en forma de zwitterion o ion dipolar (sal);
a pH menor que el punto isoeléctrico existen como cationes, que actúan como ácidos; y a un
pH mayor, existe como un anión, que actúa como base. Estas formas no tienen una acción
buffer buena o total y la adición de pequeñas cantidades de H + ó OH- alteran rápidamente el
pH de la solución . Cuando el aminoácido existe como una mezcla de la sal y la forma ácida o
básica en concentraciones aproximadamente equimolares (en la región de sus valores de pK),
el sistema actúa como un buffer estable.
Como se mencionó anteriormente el punto isoeléctrico es el pH al que el aminoácido no

lleva carga neta; es en esta forma que los aminoácidos no poseen acción buffer. La acción
tamponante es más grande cuando la concentración de la forma de la sal iguala a la
concentración de la forma ácido o de la forma de base.
Considere la reacción:
El pK = pH cuando la [sal] = [ácido]. Esto en el rango de pH ácido para la mayor

capacidad tamponante.
Similarmente para la reacción:
El pKb = pH cuando la [base] = [sal]. Esto en el rango de pH alcalino para la mayor

capacidad tamponante.
En el punto isoeléctrico la concentración de ácido iguala a la concentración de base:
Por lo tanto:
21
Si disponemos de una solución que contiene 1 mol de un aminoácido monocarboxílico y

monoaminado a un pH de 0 y le agregamos progresivamente alícuotas de una solución de
NaOH con el objeto de hacer variar el pH de la solución, se podrá obtener una gráfica como la
que muestra la Fig. 1.
12
10
pKb
8
pH
6 Punto
isoeléctrico
4 pKa
Fig.1.
ml deCurva
ácido de titulación
0 de la ml
glicina.
de álcali
Se puede notar dos sectores en donde la curva tiende a la horizontalidad, es decir en

donde ocurren las menores variaciones en el pH, no obstante que la cantidad de NaOH
añadida, es la misma que para otros sectores de la curva. Si reparamos en que pH ocurren
estos sectores de casi horizontalidad de la curva, notaremos que están muy próximos a 2.3 y
9.6; lo que quiere decir que en las proximidades del pK de sus grupos ionizables, el
aminoácido tendrá una mayor acción amortiguadora del pH. Esto nos permite anotar que de
los diferentes aminoácidos, la histidina (por su núcleo imidazol) es el más importante en el
control del pH de los líquidos extracelulares, que como se sabe es de aproximadamente 7.4.
En el punto isoeléctrico los aminoácidos son menos solubles en agua y no migran a

ningún electrodo bajo la influencia de una corriente eléctrica.
AISLAMIENTO Y SEPARACION DE AMINOACIDOS

Los aminoácidos pueden ser separados por Cromatografía de intercambio iónico, en
este procedimiento las moléculas de las soluciones son separadas por diferencias en sus
propiedades ácido-base. Para tal fin, se usan columnas con resinas sintéticas, la cual tiene
grupos químicos con una carga determinada. Una de las más usadas corresponde al
poliestireno, con grupos de ácido sulfónico (SO 3-) unidos coovalentemente a los anillos
bencénicos. Esta resina, por intermedio de sus grupos sulfónicos puede captar cationes e
21
intercambiarlos con otros cationes (resina de intercambio catiónico).
En virtud de la propiedad de los aminoácidos de adoptar determinada forma eléctrica

según el pH del medio en que se encuentren, los aminoácidos pueden ser separados
fácilmente por Electroforesis. La técnica consiste en suspender a los aminoácidos en un medio
de pH determinado y colocar la solución sobre un soporte, que puede ser simplemente papel y
someterlo a la acción de un campo eléctrico. Según la intensidad de carga y secundariamente
según su tamaño, los aminoácidos migrarán a uno u otro polo y con mayor o menor velocidad.
Existe otro método muy usado para la separación de aminoácidos y que no está basado
en sus propiedades eléctricas sino en la diferente solubilidad que tienen en una mezcla de
solventes no miscibles.
Cuando un aminoácido se disuelve en una mezcla de solvente no miscible se reparte

entre ellos de acuerdo a su grado de solubilidad, que en la práctica corresponde a su
coeficiente de partición o de reparto. Este principio se aplica en la técnica denominada
Cromatografía de Papel y Cromatografía de Capa Fina.
PARTE EXPERIMENTAL
EXPERIMENTO N° 1. REACCION CON NINHIDRINA
FUNDAMENTO
Los aminoácidos reaccionan con la ninhidrina dando un color azul violáceo. En esta
reacción la ninhidrina es reducida y el aminoácido es desaminado y descarboxilado.
MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Baño maría
Solución de aminoácidos 0.1 M (glicina, metionina, cisteína, histidina, arginina, tirosina,
triptofano y cistina)
Caseína 1%
Ovoalbúmina 0.1% (o Clara de Huevo 5%)
Ninhidrina 0.1% en etanol de 95%
METODO DE TRABAJO
Prepare el siguiente sistema de tubos:
Tubo N° 1 2 3 4
Aminoácidos 0.1 M 0.5 - -
Caseína 1% - 0.5 -
Ovoalbúmina 0.1% - - 0.5 -
Agua destilada - - - 05
Ninhidrina 0.1% 1.5 1.5 1.5 1.5
Mezclar mediante agitación suave y llevar a baño de agua hirviente por 10 minutos.
Retire y enfríe.
Anote sus observaciones. Indique si la reacción es positiva o negativa según
corresponda.
21
REACCIÓN
Caseína
Ovoalbúmina
Agua destilada
Presente fotos de la reacción y explique los resultados.
EXPERIMENTO N° 2. REACCION XANTOPROTEICA
FUNDAMENTO
Es una prueba positiva para aminoácidos aromáticos (tirosina, fenilalanina y triptófano).
Se basa en la nitración del núcleo de benceno (anillo aromático) dando derivados amarillos,
cuando se calientan con ácido nítrico concentrado; estos derivados se tornan anaranjados por
adición de NaOH (se forman sales).
MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Baño maría
Solución de aminoácidos 0.1 M (glicina, tirosina y triptofano)
Caseína 1%
Acido nítrico concentrado
NaOH 1 N
METODO DE TRABAJO
Tubo N° 1 2 3 4
Aminoácidos 0.1 M 1.0 - - -
Caseína 1% - 1.0 - -
Agua destilada - - - 1.0
Ácido Nítrico 1.0 1.0 1.0 1.0
Agite suavemente y lleve a baño maría por 10 minutos. Retire y enfríe. Adicione 1.0 ml de
NaOH.
corresponda.
REACCIÓN
Caseína
Ovoalbúmina
Agua destilada

EXPERIMENTO N° 3. REACCION DE MILLON
21
FUNDAMENTO
Esta prueba para ser positiva requiere la presencia de un radical hidroxibenceno, y por
lo tanto, es específica para tirosina y sus derivados ya sea que estén libres o en una proteína
o en sus productos de hidrólisis. Esta reacción también se emplea en la cuantificación de
tirosina.
El reactivo de Millon es una solución de nitratos mercuriosos y mercúricos, conteniendo

ácido nítrico. Las proteínas del tipo de las albúminas de huevo, que precipitan por ácidos
minerales fuertes, producen un precipitado blanco que se va volviendo rojo a medida que se
calienta. Otras proteínas como las proteosas y peptonas solo producen una coloración roja en
las mismas condiciones, debido a que las soluciones contienen sales inorgánicas (Cl -) en gran
cantidad, precipitando el reactivo de Millon, este método no se emplea para determinar
proteínas en la orina
MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Baño maría
Solución de aminoácidos 0.1 M (tirosina)
Caseína 1%
Reactivo de Millon
METODO DE TRABAJO
Tubo N° 1 2 3 4
Caseína 1% - 1.0 - -
Reactivo de Millon 1.0 1.0 1.0 1.0
Mezclar y llevar a baño de agua hirviente por 5 minutos. Retire y enfríe.
corresponda.
REACCIÓN
Caseína
Ovoalbúmina
Agua destilada

EXPERIMENTO N° 4. REACCION CON ACETATO DE PLOMO
FUNDAMENTO
Cuando un compuesto orgánico que contiene azufre, es tratado con una solución fuerte
de NaOH, este se hidroliza según:
21
Este sulfuro inorgánico es altamente ionizable y como resultado de esto se puede

obtener algún test de precipitación para el ion sulfuro. Uno de los más comunes es la
precipitación por el plomo. En efecto, la adición de acetato de plomo causa la formación de
sulfuro de plomo (negro o pardo).
El azufre de la cisteína reacciona fácilmente con el acetato de plomo en cambio el

azufre de la metionina a causa de su gran estabilidad no ennegrese con el plomo. La mayor
parte de las proteínas contienen azufre formando parte de la metionina. Son excepciones las
queratinas, insulina y ciertas seroalbúminas que contienen azufre en forma de cistina o
cisteína. La fibroína de la seda y algunas protaminas no contienen azufre. La ergotioneina
también contiene azufre y puede dar esta reacción.
MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Baño maría
Solución de aminoácidos 0.1 M (cisteína, cistina y metionina)
NaOH 40%
Acetato de Plomo 0.5 M
METODO DE TRABAJO
Tubo N° 1 2 3 4
Caseína 1% - 2.0 - -
NaOH 40% 1.0 1.0 1.0 1.0
Acetato de plomo 0.5 M 0.5 0.5 0.5 0.5
Mezclar y llevar a baño de agua hirviente por 3 minutos. Retire y enfríe.
corresponda.
REACCIÓN
Caseína
Ovoalbúmina
Agua destilada

EXPERIMENTO N° 5. REACCION McCARTHY-SULLIVAN
FUNDAMENTO
21
Sirven para identificar la presencia de metionina. Para tal efecto se utiliza nitroprusiato
de sodio (Na2NOFe(CN)5) desarrollándose una coloración roja en presencia de dicho
aminoácido.
MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Baño maría
Solución de aminoácidos 0.1 M (glicina, metionina)
NaOH 6 N
Nitroprusiato de sodio (20 g/L. Prepárese fresco).
HCl 2 M
METODO DE TRABAJO
Tubo N° 1 2 3 4
Caseína 1% - 1.0 - -
NaOH 6 N 1.0 1.0 1.0 1.0
Nitroprusiato de sodio 0.5 0.5 0.5 0.5
Lleve los tubos a baño maría a temperatura no mayor de 40°C durante 10 minutos.
Luego enfríe y por las paredes del tubo deslice 1.0 ml de HCl.
corresponda.
REACCIÓN
Caseína
Ovoalbúmina
Agua destilada
Luego agite los tubos y observe otra vez

EXPERIMENTO N° 6. REACCION DE HOPKINS-COLE
FUNDAMENTO
Esta prueba es positiva para aminoácidos que poseen un anillo indol como el triptofano.
El grupo indol del triptofano reacciona con el ácido glioxílico (CHO-COOH) del reactivo en
presencia del ácido sulfúrico dando un color púrpura o violeta en la interfase de los dos
líquidos.
MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
21
Gradillas
Baño maría
Solución de aminoácidos 0.1 M (glicina, triptofano)
Caseína 1%
Acido sulfúrico concentrado
Reactivo de Hopkins-Cole
METODO DE TRABAJO
Color
Tubo N° 1 2 3 4
observado
Caseína 1% - 1.0 - -
Reactivo Hopkins-Cole 0.5 0.5 0.5 0.5
Después de añadir el reactivo de Hopkins-Cole agite y agregue a cada tubo, deslizando

por las paredes, 1.0 ml de ácido sulfúrico concentrado, luego lleve al baño de agua hirviente
por 3 minutos. Retire y enfríe.
corresponda.
REACCIÓN
Caseína
Ovoalbúmina
Agua destilada

CUESTIONARIO
1. Calcular el punto isoeléctrico de los siguientes aminoácidos: a) glicina, b) ácido glutámico
y c) lisina. Desarrolle las reacciones de disociación
2. Cuáles son las movilidades electroforéticas relativas a pH 5.68 de alanina, arginina, ácido
glutámico, serina y triptófano.
3. Una solución que contiene ácido aspártico (pI=2.98), glicina (pI=5.97), leucina (pI=5.98) y
lisina (pI=9.74) en tampón citrato pH=3 es aplicada a una columna cambiadora de cationes
equilibrada con el mismo tampón. En qué orden eluirán los aminoácidos de la columna?
4. Un determinado péptido fue tratado con el reactivo de Sanger y al realizar la hidrólisis se

observó que el 1-fluoro, 2,4-dinitrobenceno (DNFB) no reaccionó con ningún aminoácido,
Cómo explica?
21

Manual de Bioquímica: Colorimetría y Fotometría

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Manual de Bioquímica: Colorimetría y Fotometría

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Manual de Praá cticas de Bioquíámica

Muchos compuestos, sean o no coloreados, tienen la capacidad de absorber luz de una

Tanto el color (colorimetría) como la transmitancia (fotometría) de la luz de una solución

La colorimetría es un procedimiento por el cual una solución coloreada de un material

En fotometría o en espectrofotometría se compara la transmitancia de la luz a través de

La velocidad (c), de propagación en el vacío es de 3 x 1010 cm/seg y algo menor al

La frecuencia (v), es el número de oscilaciones por segundo. Se expresa en ciclos/seg.

y según la ecuación anterior inversamente proporcional a la longitud de onda.

En forma logarítmica tenemos:

Al pasar al sistema logarítmico de base 10, el coeficiente de absorción c, se convierte

Donde: log I0/I es la densidad óptica (D.O.) o absorbancia (A). A es directamente

2.2. Ley de Beer. Beer estudió la influencia de la concentración de la solución de una

entre la transmisión y el espesor de la capa atravesada. Teniendo en cuenta que la luz se

donde: c = concentración en mol/l.

Cuando en la ley anterior, la transmitancia disminuye exponencialmente con el número

E = coeficiente de extinción molar

2.4. Coeficiente de extincion molar. Por definición, el coeficiente de extinción molar E, es la

2.5. Coeficiente de extincion específica. En muchas ocasiones no se conoce el peso

mezcla y entonces se acostumbra expresar la concentración en g/l. En estos casos, se emplea

Si la solución es absolutamente transparente I = 1, y su transmitancia será 1; este valor

Por tanto, los valores de T % van de 0 a 100%. Como la transmitancia va de 0 a 100%,

Si se construye una gráfica de A en función de c, se obtiene una recta, pues la

Ejm. En un espectrofotómetro se ha ajustado al 100% la transmitancia de luz con agua

Ya que en la práctica, siempre se ajusta la transmitancia a 100% (cuyo log = 2), la

2.8. Limitaciones de la Ley de Beer-Lambert. Aunque la ley de Lambert se cumple en todos

2.8.2. Desviaciones Debidas a la Naturaleza de la Muestra. Se deben al cambio en la

2.8.3. Desviaciones Debidas al Investigador. Principalmente se deben a una mala elección

3. RANGOS ADECUADOS DE CONCENTRACION

4. CALCULO DE LA CONCENTRACION DE UNA MUESTRA PROBLEMA

Existen tres formas de cálculo.

Según la Ley de Beer - Lambert tenemos que:

teniendo en cuenta que el espesor X es constante y que la tratarse de soluciones de la misma

donde: Fc = factor de calibración (Fc = Cst/Ast); esta expresión referida a porcentaje se

v = volumen de la muestra utilizada para la determinación.

4.2. Mediante curvas de calibración. En este caso se utilizan varios patrones de

Luego se construye una gráfica en un sistema de coordenadas, colocando las lecturas

por cero si la sustancia obedece la ley de Beer-Lambert.

La muestra problema dará una lectura o absorbancia determinada que se busca en el

4.3. Mediante la ecuación A = Ecx. Ecuación obtenida de la combinación de las leyes de

El coeficiente de extinción debe mantenerse constante para un intervalo de

1. ESPECTROS DE ABSORCION. Se llama espectro de absorción a la gráfica que

2. VALORACIONES ESPECTROFOTOMETRICAS. El curso de una reacción química o la

3. ESPECTROFOTOMETRIA Y ENZIMAS. Por las grandes ventajas de comodidad,

EXPERIMENTO N° 1. ESPECTROS DE ABSORCION Y LONGITUD DE MAXIMA

 Determinar la longitud de onda de máxima absorbancia del rojo de fenol.

Puesto que los compuestos coloreados presentan espectros de absorción

Medir en un tubo de ensayo 1 ml de rojo de fenol adicionarle una gota de NaOH y

RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUCIÓN, BIBLIOGRAFÍA

EXPERIMENTO N° 2. DEMOSTRACION DE LA LEY DE BEER Y CONSTRUCCION DE

Si se mantiene constante la longitud de onda de máxima absorción, la absorbancia

RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIÓN, BIBLIOGRAFÍA

2. El coeficiente de absorción específico de un complejo de glucógeno-iodo a 150 nm es

3. Un enzima puro que contiene molibdemo tiene un coeficiente de absorción específico de

1.5 en una cubeta de 1 cm de espesor. Una disolución concentrada de la proteína se vio

Los aminoácidos son los sillares de construcción de las proteínas. El número de

Los aminoácidos son importantes en la alimentación humana. En forma de proteínas los

REACCIONES QUIMICAS DE LOS AMINOACIDOS

Dentro de las principales reacciones podemos mencionar:

2. REACCION CON NINHIDRINA.- Usada para la determinación cuantitativa de los

3. REACCION CON EL DINITROFLUOROBENCENO (DNB).- El grupo amino reacciona con

5. REACCION CON FENILISOTIOCIANATO.- Es la reacción de Edman para determinar el N-

6. REACCION CON CLORURO DE TRIOFLUOROACETILO.- Se utiliza en la cromatografía

DETERMINACION DEL PUNTO ISOELECTRICO EN LOS AMINOACIDOS