Agar TSI

El Agar-hierro-triple azúcar es un medio de cultivo. Gracias a su composición es uno de

los medios de cultivo más empleados para la diferenciación de enterobacterias según:

1. Fermenten o no glucosa.
2. Fermenten o no lactosa o sacarosa.
3. Produzcan o no ácido sulfhídrico.
4. Produzcan o no gas.

Correspondientemente las reacciones sobre agar TSI son:

1. Si la bacteria problema fermenta la glucosa, acidificará el medio haciendo virar a

amarillo el indicador en el fondo del tubo, mientras que si no es fermentadora de
glucosa, el medio permanecerá de color rojo.
2. Si la bacteria problema fermenta lactosa o sacarosa, acidifica el medio en su
superficie volviéndolo de color amarillo, mientras que si no lo es, la superficie del
medio continuará de color rojo.
3. Si produce ácido sulfhídrico (debido a la reducción de las sales de hierro), se
presentará un ennegrecimiento del tubo. La producción de sulfhídrico y el
consiguiente ennegrecimiento pueden impedir ver la fermentación de la glucosa
(fondo amarillo), pero este hecho implica directamente que la bacteria es
fermentadora de glucosa.
4. Si aparece rotura o desplazamiento del medio, significa que la bacteria es
productora de gas.

Peptona 159 g
Extracto de levadura 3 9.9g
Extracto de carne 3g
Sacarosa 10 g
Sulfato de hierro 0,20 g
Cloruro sódico 5g
Tiosulfato de sodio 0,30 g
Rojo fenol 0,024 g

Agar LIA
La prueba consiste básicamente en demostrar la presencia de la enzima lisina descarboxilasa,
capaz de reaccionar con el grupo carboxilo del aminoácido L-lisina. También puede ocurrir una
desaminación del aminoácido por la presencia de la enzima lisina desaminasa.

Adicionalmente, la composición del medio permite evidenciar la capacidad de algunos géneros

bacterianos de producir sulfuro de hidrógeno. Finalmente, también es posible observar la
generación o no de gas en el medio.

Fundamento

Peptonas y extracto de levadura

Como la mayoría de los medios de cultivos, el agar hierro lisina contiene componentes que
proporcionan la fuente de nutrientes necesarias para el crecimiento bacteriano. Estos
componentes están representados por las peptonas y el extracto de levadura.

Glucosa

Así mismo, este agar contiene como carbohidrato fermentable la glucosa. Se sabe que todas las
bacterias de la familia Enterobacteriaceae fermentan la glucosa. Este paso es crucial, porque se
encargará de acidificar el medio, condición indispensable para que la enzima lisina descarboxilasa -
si está presente- actúe sobre su sustrato. En algunos géneros bacterianos se puede observar la
producción de gas debido a la fermentación de la glucosa. El gas se evidencia cuando ocurre un
desplazamiento del agar en el tubo, quedando un espacio vacío en el fondo del mismo, o por
fractura del medio en dos o más porciones.

L-lisina

Una vez descarboxilada la lisina, se forma una diamina (cadaverina) y anhídrido carbónico. La
descarboxilación se da en presencia de la coenzima fosfato de piridoxal. Esta reacción es
irreversible.

Indicador de pH (púrpura de bromocresol)

Todos los cambios de pH ocurridos en el medio por las diversas reacciones, son detectados por el
indicador de pH púrpura de bromocresol. En este sentido, cuando hay acidificación el medio se
torna amarillo, y cuando hay alcalinización el medio regresa al color morado o púrpura original.
Esto se debe a que durante el proceso de desaminación se forma el ácido alfa-ceto-carbónico, que
reacciona con el citrato de amonio en presencia de oxígeno, lo que origina el color mencionado.

Citrato férrico de amonio y tiosulfato sódico

Por otra parte, las bacterias que producen sulfuro de hidrógeno quedarán en evidencia por la
presencia del tiosulfato sódico (fuente de sulfuro) y del citrato férrico de amonio, que es el
revelador del H2S.

Las bacterias que posean la enzima tiosulfato reductasa tienen la capacidad de actuar reduciendo
el tiosulfato de sodio presente, formando sulfito y sulfuro de hidrógeno (H2S). Este último es un
gas incoloro, pero al reaccionar con la sal de hierro forma sulfuro ferroso metálico, que es un
compuesto insoluble (precipitado negro visible). Sin embargo, la capacidad de formación de H2S
con este medio no es muy confiable, debido a que algunas bacterias lisina descarboxilasa
negativas capaces de producir H2S no formarán el precipitado negro, pues la acidez del medio
interfiere. Por ello se recomienda corroborar con otros medios que contengan hierro.

Interpretación de la prueba

Descarboxilación de la lisina

Los tubos deben leerse después de culminadas las 24 horas de incubación, de lo contrario se corre
el riesgo de malinterpretar la reacción, reportando falsos negativos. Hay que recordar que la
primera reacción que ocurrirá será la fermentación de la glucosa, por tanto todos los tubos al cabo
de 10 a 12 horas virarán a color amarillo. Si al finalizar el tiempo de incubación (24 horas) se
observa un fondo amarillo con una superficie morada o púrpura, la reacción es negativa. El color
púrpura de la superficie corresponde a la alcalinización del medio por el uso de las peptonas. Una
reacción positiva es aquella en donde el fondo y la superficie del tubo son completamente
púrpuras, es decir, vuelve al color original. Por tanto, quien determina la positividad de la prueba
es la base o fondo del medio. Si se tiene duda sobre el color se puede comparar con un tubo de LIA
no inoculado.

Desaminación de la lisina

Un tubo que evidencia la desaminación de la lisina tendrá una superficie color rojiza granate y un
fondo amarillo (ácido), o todo el tubo color rojizo granate. Esta reacción se interpreta como
negativa para la descarboxilación de la lisina, pero positiva para desaminación de la lisina. Esta
reacción se define e interpreta en el bisel.

Producción de sulfuro de hidrógeno (H2S)

Una reacción positiva se observa por la aparición de un precipitado negro en todo el medio o parte
de él. Generalmente entre el límite del bisel y la base. Si el precipitado se da en todo el tubo no
dejará ver las otras reacciones que ocurren en el medio.

Agar MIO

El significado de sus siglas (MIO) describe cada uno de los parámetros que se pueden observar en
este medio; motilidad, indol y ornitina. La motilidad es la capacidad del microorganismo de
moverse por la presencia de flagelos. Para que esta propiedad pueda ser observada la consistencia
del medio debe ser semisólida, por lo que la preparación lleva menos cantidad de agar.
Finalmente, la ornitina determina si la bacteria es capaz de descarboxilar el aminoácido, es decir, si
cuenta con la enzima orinitina descarboxilasa. la tripteína es una fuente de triptófano para
evidenciar la presencia de la enzima triptofanasa, que degrada el triptófano por una desaminación
reductiva liberando indol, ácido pirúvico, amoníaco y energía. El indol es incoloro, por tanto su
presencia se revela al agregar cinco gotas del reactivo de Ehrlich o de Kovacs, ambos con p-
dimetilaminobenzaldehído. El grupo aldehído de este compuesto reacciona con el indol,
generando un producto de color rojo fucsia en forma de anillo en la superficie del agar.

Cualquier vestigio de color se debe considerar como una prueba positiva. La prueba debe leerse
inmediatamente, pues pasado el tiempo el color se degrada.

Interpretación

Prueba positiva: formación de un anillo de color rojo fucsia al agregar las gotas del reactivo de
Kovacs.

Prueba negativa: no hay formación de anillo.

Motilidad

La capacidad de la bacteria de moverse se evidenciará si se observa un medio turbio o si hay una

línea gruesa de crecimiento que se expande alrededor de la inoculación inicial.

Una prueba de motilidad negativa se evidenciará al observar una línea delgada de crecimiento, y
todo alrededor estará sin crecimiento.

Es importante que la motilidad se lea antes de revelar el indol, ya que el agregado del reactivo
enturbia todo el medio. En bacterias móviles pero de lento crecimiento es difícil demostrar su
motilidad con este medio. En este caso se recomienda usar otras pruebas o métodos, como el
medio motilidad o del método gota pendiente.