El ayuno prolongado reduce IGF-1 / PKA para promover la

regeneración basada en células madre hematopoyéticas y la

inmunosupresión inversa
Chia-Wei Cheng , 1 Gregor B. Adams , 2 Laura Perin , 3 Min Wei , 1 Xiaoying Zhou , 2 Ben S.
Lam , 2 Stefano Da Sacco , 3 Mario Mirisola , 4 David I. Quinn , 5 Tanya B. Dorff , 5 John J.
Kopchick , 6 y Valter D. Longo 1, *

Información del autor ► Información de derechos de autor y licencia ► Descargo de responsabilidad

La versión final editada de este artículo está disponible en Cell Stem Cell

Consulte el comentario " Decir no a las drogas: el ayuno protege las células madre hematopoyéticas de la

quimioterapia y el envejecimiento " en Cell Stem Cell , volumen 14 en la página 704.

Consulte el comentario " ¿Puede UPR integrar la regeneración de células madre y ayuno? " En Front Chem , volumen

3, 5.

Véase el comentario " El ayuno / realimentación prolongada promueve la regeneración y el rejuvenecimiento de células

madre hematopoyéticas " en Rejuvenation Res , volumen 17 en la página 385.

Este artículo ha sido corregido. Consulte la corrección en el volumen 18 en la página 291.

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RESUMEN
Ir:

INTRODUCCIÓN
El ayuno prolongado (PF) que dura 48-120 horas reduce la señalización pro crecimiento
y activa vías que aumentan la resistencia celular a toxinas y estrés en ratones y humanos
( Fontana et al., 2010b ; Guevara-Aguirre et al., 2011 ; Holzenberger et al. ., 2003 ; Lee
y Longo, 2011 ; Longo et al., 1997 ). Los cambios fisiológicos causados por PF son
mucho más pronunciados que los causados por restricción calórica o rápido durante la
noche, en parte debido a la necesidad de cambiar completamente a un catabolismo
basado en cuerpos grasos y cetónicos después de que se agotan las reservas de
glucógeno durante PF ( Longo y Mattson , 2014) Los estudios en ratones indican que la
FP puede protegerlos de la quimiotoxicidad al reducir el factor de crecimiento insulínico
1 circulante (IGF-1) ( Lee et al., 2010 ; Raffaghello et al., 2008 ). Un estudio preliminar
de series de casos también indica que la PF tiene el potencial de mejorar varios efectos
secundarios causados por la quimioterapia en humanos ( Safdie et al., 2009 ). Uno de
los efectos secundarios, la mielosupresión, es a menudo limitante de la dosis en el
tratamiento de quimioterapia, en parte porque el daño a las células madre / progenitoras
adultas afecta la reparación y regeneración del tejido ( Kofman et al., 2012 ; Mackall et
al., 1994 ; van Tilburg et al. al., 2011 ; Williams et al., 2004) A pesar del creciente
interés en los cambios que dependen de los nutrientes en las poblaciones de células
madre, se sabe poco acerca de cómo las intervenciones dietéticas agudas o periódicas
afectan el sistema hematopoyético.
Las HSPC que residen en la médula ósea del adulto (BM) están contenidas dentro de
la población de células Lin - Sca-1 + c-Kit + (LSK), que incluyen las células madre
hematopoyéticas a largo plazo y auto-renovables (LSK- CD48 - CD150 + , LT - HSC y
LSK - CD48 - CD150 - , ST - HSC) y los progenitores multipotentes (LSKCD48 + ,
MPP) ( Figura S1 ) ( Challen et al., 2009 ; Rathinam et al., 2011;) En conjunto, estas
células son responsables de la regeneración hematopoyética adulta. En las HSC
heterogéneas, se identifican varios subtipos como Lymphoid- (Ly-HSC), HSC
balanceadas (Bala-HSC) y HSC mieloides (My-HSCs) de acuerdo con sus distintas
salidas de células sanguíneas maduras ( Figura S1 ) ( Benz et al. ., 2012 ; Challen et al.,
2010 ; Muller-Sieburg et al., 2004 ). Tanto en ratones como en humanos, estos subtipos
de HSC modulan el potencial de linaje hematopoyético y desempeñan un papel
importante en la homeostasis del linaje durante el envejecimiento ( Beerman et al.,
2010 ; Challen et al., 2010 ; Cho et al., 2008 ; Pang et al. , 2011) Aquí, estudiamos el
papel de múltiples ciclos de PF en la inmunosupresión inducida por la quimioterapia y
dependiente de la edad e investigamos cómo la FP afecta la autorrenovación HSC, los
subtipos Ly-, My- y Bala-HSC, así como sus resultados de reconstitución
hematopoyética.
Ir:

RESULTADOS

Los ciclos de ayuno prolongado (PF) reducen el daño en el tallo de la médula

ósea y las células progenitoras y protegen a los ratones contra la
quimiotoxicidad
Los medicamentos de quimioterapia causan inmunosupresión al inducir daño en el
ADN y muerte celular en sangre periférica (PB) y médula ósea (BM), que a menudo
resulta en deterioro a largo plazo de la hematopoyesis ( Bedford et al., 1984 ; Yahata et
al., 2011 ) . Para probar si PF puede proteger el sistema hematopoyético frente a la
toxicidad inmunosupresora, los ratones fueron ayunados o alimentados con una dieta ad
lib (AL) y luego desafiados con ciclofosfamida (CP) durante ciclos múltiples ( Figura
1A ) ( Adams et al., 2007 ). De acuerdo con nuestros resultados previos con etopósido y
doxorrubicina, observamos un efecto protector significativo de los ciclos de PF de 48
horas contra la mortalidad inducida por PC ( Figura 1B y S1A) ( Raffaghello et al.,
2008 ). Los ciclos de PF también condujeron a una disminución en el daño del ADN
causado por CP en leucocitos y células BM ( Figura 1C y S1B ).
 Abrir en una ventana separada
Figura 1
Los ciclos de ayuno prolongados protegen el sistema hematopoyético y revierten la
supresión hematopoyética inducida por la quimioterapia
(A) Representación diagramática del procedimiento experimental para analizar los efectos del
ayuno prolongado (PF, 48hr) durante 6 ciclos de quimioterapia con ciclofosfamida (CP, 200mg
/ kg, ip).
(B) Curva de supervivencia con líneas punteadas verticales que indican el período de inanición
previa a la quimio; p <0.01, prueba Log-rank (Mantel-Cox); n = 20 (10 hombres y 10 mujeres).
(C) medición del daño en el ADN (momento de la cola de aceituna) en células de la médula
ósea (BM) (día 81, 6ª fase de recuperación).
(D) Medida de apoptosis (ensayo TUNEL) en HSCs y MPP (día 81, 6ª fase de recuperación).
(E) perfil hematológico de ratones. Total de glóbulos blancos (WBC), recuentos de linfocitos y
relación linfoide / mieloide (L / M) en ratones tratados con 6 ciclos de CP (200 mg / kg,
ip). Cada punto representa la media ± sem; las líneas discontinuas horizontales indican los
rangos de los valores de referencia; * P <0,05, ANOVA de dos vías, la comparación de
CP vs . PF + CP durante la fase de recuperación, n = 12 (6 hombres y 6 mujeres); La relación L
/ M de sangre periférica (PB) se define como el número de linfocitos dividido por el número de
células mieloides (es decir, granulocitos y monocitos). Ver también las Figuras suplementarias
S1F y S1G .
(F) Perfil hematológico de sujetos humanos. Recuento de linfocitos y relación linfoide /
mieloide (L / M) en pacientes sometidos a dos ciclos (C1 y C2) de quimioterapia doble basada
en platino en combinación con 24 horas o 72 horas (48 antes y 24 horas después de la
quimioterapia) ayuno prolongado; D1 y D8 indican el día 1 (antes de la quimioterapia) y 8 días
de cada ciclo de quimioterapia; Cada punto representa la media ± sem; ** p <0.01, ANOVA de
dos vías; El tamaño de la muestra se indica entre paréntesis.
(G) Análisis FACS de células madre y progenitoras hematopoyéticas (día 84, final
del 6º ciclo); las líneas punteadas horizontales indican el valor de referencia. (H) Proporción de
células madre hematopoyéticas predispuestas a linfoides (Ly-HSC), equilibradas (Bala-HSC) y
mioides (My-HSC). Los marcadores utilizados son la población del lado inferior de LSK
(SP LSK inferior ) para My-HSC, SP LSK media para Bala-HSC y SP LSK superior para Ly-
HSC. Los paneles inferiores muestran un aumento de la población SP en los paneles superiores.
* P <0.05, ANOVA de una vía que compara con AL.
(I) Las células BM recogidas de ratones tratados con CP o PF + CP se trasplantaron a los
ratones receptores. El quimerismo de las células derivadas de donantes en PB y el de BM se
determinó 16 semanas después del trasplante primario de BM. La relación de linfocitos a células
mieloides (L / M) en la sangre reconstituida también se midió. Para (G e I), n = 6 a 10 por
grupo, * p <0.05, ** p <0.01, t -test que compara el PF con el grupo de control no ayunado
ambos en combinación con el tratamiento con ciclofosfamida.

Para determinar si la protección de HSPC puede estar involucrada en los efectos de la

PF sobre la toxicidad inducida por la quimioterapia, recolectamos células BM al final de
6 ciclos de tratamientos con CP o PF + CP y medimos la apoptosis. Dado que las HSPC
representan una fracción menor de la BM total, examinamos además la apoptosis en las
subpoblaciones de estas células (es decir, LT-HSC, ST-HSC y MPP) realizando un
ensayo de TUNEL. Los resultados indican que sin afectar la celularidad BM, PF
disminuyó la apoptosis inducida por CP en HSPC ( p <0.05, t -test), particularmente en
ST-HSCs y MPP ( Figura 1D , S1C y S1D ). La protección inducida por PF contra la
apoptosis inducida por CP también se confirmó mediante el ensayo de unión a anexina
V para HSPC ( figura S1E ).

Los ciclos de ayuno prolongados promueven la regeneración hematopoyética

equilibrada de linaje
Para evaluar si la protección de HSPC mejora la recuperación hematopoyética,
comparamos los perfiles hematológicos de los ratones CP y PF + CP al inicio (antes de
los tratamientos con CP, después de la PF), en el nadir (2-4 días después de la PC) y
durante la fase de recuperación (8-10 días después de la PC) para cada ciclo de
quimioterapia. Los tratamientos con ciclos múltiples de CP dieron como resultado una
disminución importante en los recuentos de glóbulos blancos (WBC) ( Figura 1E ). En
el grupo de control, la supresión de WBC, especialmente el número de linfocitos,
persistió durante más de 70 días (6 ciclos) ( Figura 1E ). PF redujo los recuentos de
WBC independientemente de la quimioterapia y no evitó la disminución inducida por
CP en el número de glóbulos blancos ( Figura 1E, tiempo 0). Sin embargo, el efecto
beneficioso de PF era evidente a partir del ciclo 4 (día 39) con el regreso de los
linfocitos a los niveles normales después de la 5 ºciclo (día 56) ( Figura 1E ). Al final de
los 6 ciclos de tratamiento, los ratones en el grupo PF también mostraron niveles
normales o casi normales de células linfoides y relaciones normales de células linfoides
y mieloides (L / M) ( Figura 1E , panel derecho). Esta recuperación se observó en
puntos de tiempo similares en 3 experimentos independientes (N = 20).
Para comenzar a determinar si los ciclos de PF pueden potencialmente promover un
efecto similar en humanos, también analizamos los perfiles hematológicos de pacientes
con cáncer de un ensayo clínico de Fase I para la viabilidad y seguridad de un período
de PF de 24-72 horas en combinación con quimioterapia. Aunque se usaron 3
combinaciones de fármacos basadas en platino diferentes (Tabla S1), los resultados de
un ensayo clínico de Fase I indican que 72 pero no 24 horas de PF en combinación con
quimioterapia se relacionaron con recuentos de linfocitos normales y mantenimiento de
un equilibrio de linaje normal en WBC ( Figura 1F ). Estos alentadores resultados
preliminares deberán ampliarse y confirmarse en la fase aleatorizada en fase II en curso
del ensayo clínico.
De acuerdo con el efecto de PF sobre la recuperación en números de WBC y la mejora
en la relación linfoide / mieloide, los resultados de los análisis FACS para poblaciones
de células madre indicaron una mejor conservación de LT-HSC y ST-HSCs y la
resistencia mejorada al sesgo mieloide en el grupo PF después de 6 ciclos de
tratamiento con CP en ratones ( Figura 1G y H ).
Para evaluar si el aumento de HSCs en BM de ratones PF + CP puede mejorar la
regeneración hematopoyética, recolectamos células BM de los ratones tratados con CP o
PF + CP y transplantamos el mismo número de células en los ratones receptores
inmunocomprometidos (irradiados). Los resultados de este ensayo de repoblación
competitivo indican que, en comparación con el grupo control alimentado ad libtum ,
las células BM de ratones expuestos a 6 ciclos de tratamiento con CP precedido por PF
tienen mayor capacidad de regeneración que conduce a una reconstitución sanguínea
eficiente con una relación linfoide / mieloide mejorada ( L / M), como es evidente a
partir del injerto mejorado en sangre y en BM ( Figura 1I y S1G y S1H ).
Los ciclos prolongados de ayuno regulan las poblaciones de células madre
independientemente de la quimioterapia y ayudan a revertir la
inmunosenescencia
Probamos si los ciclos de PF solo también podrían estimular la autorrenovación de
HSC. Los resultados usando ensayos de incorporación de BrdU indicaron un aumento
de aproximadamente 6 veces de HSPC recién generadas (BrdU +) (es decir, LT-HSC,
ST-HSC y MPP) en ratones PF, que representa el 93,7% del aumento total de HSPC
después de ciclos PF ( Figura 2A ). Encontramos que el aumento en el número de
células LSK se debe principalmente a un aumento en LT-HSCs y ST-HSCs ( Figura
2B ). Por el contrario, el número de células BM totales y el de progenitores (es decir,
MPP, progenitores multipotentes, CLP, progenitores linfoides comunes, progenitor
mieloide común, CMP) no se incrementó por PF, y, de hecho, el número de CMP se
redujo ligeramente durante PF ( Figura 2C y S2A ).
 Abrir en una ventana separada
Figura 2
Los ciclos de ayuno prolongados promueven una regeneración hematopoyética
independiente de la quimioterapia
Los ratones en el grupo control se alimentaron ad libitum y los del grupo PF se mantuvieron en
ayunas durante uno o dos ciclos, como se indicó. n = 4 a 12 ratones hembra por grupo.
(A) ensayo de incorporación de BrdU para células LSK. Los ratones sometidos a 24 + 48 horas
de ayuno prolongado se inyectaron (ip) con BrdU (0,1 mg / g, dos veces al día, durante 2 días,
comenzando después de 24 horas de ayuno.
(B) Número de células madre hematopoyéticas a largo plazo (LT-HSC), células madre
hematopoyéticas a corto plazo (ST-HSC) y progenitores multipotentes (MPP).
(C) Número de progenitores linfoides comunes (CLP) y progenitores mieloides (MP)
(D) Análisis del ciclo celular para células BM usando Ki67 y Hoechst33342.
(E) Análisis de apoptosis para células BM utilizando el ensayo TUNEL.
Para (A) a (E), * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.005, t -test que compara los controles
alimentados con AL.
(F) Proporción de células madre hematopoyéticas predispuestas a linfoides (Ly-HSC),
equilibradas (Bala-HSC) y mioides (My-HSC). Los marcadores utilizados son la población del
lado inferior de LSK (SP LSK inferior ) para My-HSC, SP LSK media para Bala-HSC y
SP LSK superior para Ly-HSC.
(G) Número de linfocitos y células mieloides en ratones jóvenes (6 meses, 48 horas de ayuno) y
viejos (18 meses, 8 ciclos de ayuno). Para (F) y (G), * p <0.05, ** p <0.01 y *** p <0.005 ,
ANOVA de una vía.

Los resultados del análisis del ciclo celular indican que el PF solo indujo un aumento
importante de la fase S / G2 / M en LT-HSC, ST-HSC y MPP ( Figura 2D ). La
inducción significativa en la entrada del ciclo celular podría explicar al menos parte del
aumento inducido por PF en las HSCs. Además de la tinción Ki67 / Hoechst33342 para
el análisis del ciclo celular, la proliferación de autorrenovación inducida por PF también
se confirmó mediante análisis usando tinción Pyronin Y / Hoechst33342 ( Figura
S2B ). Por otro lado, los resultados del ensayo TUNEL indican que la apoptosis era
apenas detectable en cualquier subpoblación de HSPCs de ratones alimentados con AL
o PF cuando no se aplicaba tratamiento de quimioterapia. El análisis de apoptosis con
Anexina V y 7AAD indicó resultados similares ( Figura S2C) Aunque PF solo reduce la
tasa de apoptosis en ST-HSCs significativamente, la pequeña reducción (de 1.57% a
0.72%) en la muerte celular / apoptosis solo podría contribuir a una porción muy
pequeña del aumento inducido por PF en HSC y MPP ( Figura 2E). ) Sin embargo,
como los estudios de HSC han demostrado que la inducción de la proliferación a veces
puede ir acompañada de un aumento de la apoptosis ( Nakada et al., 2010 ; Tothova et
al., 2007 ), es importante señalar que esto no se observó en PF- proliferación de
autorrenovación inducida.
Además del aumento en el número de HSCs y MPP, también observamos una alteración
dependiente de PF de la relación HSC linfoide, mieloide-sesgada y equilibrada ( Figura
2F , S2D y S2E ). Mientras que la mayoría de las HSC de ratones jóvenes están
equilibradas en linfopoyesis y mielopoyesis, la mayoría de las HSC de ratones ancianos
son sesgadas mieloides ( Beerman et al., 2010 ; Challen et al., 2010 ; Cho et al.,
2008 ; Dykstra et al. 2007 ; Morita et al., 2010 ; Muller-Sieburg et al., 2004 ; Pang et
al., 2011) Por lo tanto, investigamos si los ciclos de PF pueden corregir este sesgo en
ratones viejos. Los resultados de ratones de 18 meses indican que 8 ciclos de FP podrían
revertir el sesgo mieloide dependiente de la edad en subtipos de HSC y revertir el efecto
del envejecimiento en el número de WBC en sangre total ( Figura 2F y 2G ), similar a
los cambios observados en ratones y posiblemente pacientes PF en combinación con
quimioterapia ( Figura 1E, 1F y 1H ). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren
que los ciclos de PF también pueden estimular las HSC de una manera independiente de
la quimioterapia que conduce a una regeneración hematopoyética equilibrada de linaje.

Imitando los efectos del ayuno prolongado por deficiencia en la señalización de

GH / IGF-1 promueve la recuperación hematopoyética
Anteriormente mostramos que la FP reduce los niveles circulantes de IGF-1 y que la
deficiencia de IGF-I es suficiente para proteger a los ratones contra la toxicidad de la
quimioterapia ( Lee et al., 2010 ). Para determinar si la regeneración hematopoyética
mejorada causada por PF en ratones puede replicarse por deficiencia de IGF-1, se
estudió el sistema hematopoyético en ratones knockout del receptor de la hormona del
crecimiento (GHRKO), que tienen niveles circulantes y BM IGF-1 muy bajos ( Al-
Regaiey et al., 2005 ) ( Figura 3A , S3A y Tabla S2 ). Encontramos que CP-inducida
por daño en el ADN medido por el ensayo cometa en PB y células BM de ratones
GHRKO se redujo significativamente en comparación con la de las células de camada
de tipo salvaje ( Figura 3B) Similar a lo que se observó en ratones sometidos a ciclos de
PF pre-quimio, ST-HSCs de los ratones GHRKO se protegieron de la apoptosis
inducida por CP ( Figura 3C ). Además, el número de HSCs (es decir, LT-HSCs y ST-
HSCs) preservadas en el BM de ratones GHRKO fue mayor que el de los compañeros
de camada de tipo salvaje ( Figura 3D ). Una mejora en la recuperación hematopoyética
análoga a la causada por PF, también se observó en ratones GHRKO ( Figura 3E ).
 Abrir en una ventana separada
figura 3
La deficiencia en la señalización de GHR / IGF-1 promueve la regeneración
hematopoyética tanto en ratones tratados con quimioterapia como en ratones no tratados
Las mediciones se realizaron en GHRKO y sus compañeros de camada de la misma edad, con o
sin tratamiento con 6 ciclos de CP (200 mg / kg, ip). n = 4 a 8 ratones hembra por grupo.
(A) Nivel de BM IGF-1 en ratones GHRKO y ratones PF en comparación con ratones de tipo
salvaje alimentados ad libitum (WT-AL), * p <0,05, ** p <0,01, ANOVA de una vía.
(B) medición del daño en el ADN (momento de la cola de aceituna) en células BM y células
mononucleares de sangre periférica (PB) de GHRKO y sus compañeros de camada (WT) (día
81, 6ª fase de recuperación).
(C) Medición de apoptosis (ensayo TUNEL) en células madre y progenitoras hematopoyéticas
(día 81, 6ª fase de recuperación).
(D) Número de células madre y progenitoras hematopoyéticas (día 84, final del 6º ciclo); las
líneas de trazos horizontales indican el valor de línea base libre de quimioterapia.
(E) Glóbulos blancos totales (WBC) y recuentos de linfocitos en PB de ratones GHRKO y sus
compañeros de camada (WT); cada punto representa la media ± sem; las líneas punteadas
verticales indican tratamientos CP; las líneas horizontales discontinuas indican el valor de
referencia; * p <0.05 , ANOVA de dos vías para las fases de recuperación; relación linfoide /
mieloide (L / M) después de 6 ciclos de tratamientos de CP. La relación PB L / M se define
como el número de linfocitos dividido por el número de células mieloides (es decir, granulocitos
y monocitos). (F) Número de células madre hematopoyéticas a largo plazo (LT-HSC) y células
madre hematopoyéticas a corto plazo (ST-HSC). (G) Análisis del ciclo celular usando Ki67 y
Hoechst33342.
(H) Número de linfocitos y células mieloides en ratones jóvenes (de 6 meses de edad) y
ancianos (de 18 meses de edad).
Para (B a D) y (F a I) * p <0.05, ** p <0.01; t -test en comparación con el control de tipo
salvaje.

Descubrimos que la deficiencia de IGF-1 también causaba los efectos protectores y los
efectos regenerativos independientemente de la quimiotoxicidad. A diferencia de los
ratones PF, los ratones GHRKO no tenían una frecuencia más alta de HSPC totales
( Figura S3B ). Sin embargo, de manera similar a lo que observamos después de los
ciclos de PF, la frecuencia de HSCs (es decir, LT-HSCs más ST-HSCs) fue
significativamente mayor en ratones GHRKO en comparación con aquellos en la misma
edad y sexo compañeros de camada, con mayor entrada en el ciclo celular pero no
detectable diferencias en la apoptosis ( Figura 3F, 3G , S3C a S3E ). Además, el sesgo
mieloide dependiente de la edad no se observó en los ratones GHRKO ( Figura
3H) Estos datos sugieren que la señalización de IGF-1 periódicamente reducida causada
por ciclos de PF puede jugar un papel crucial en la regeneración hematopoyética
observada en ratones PF.

El ayuno prolongado promueve la regeneración hematopoyética de manera

dependiente de IGF-1 / PKA
Para comprender el mecanismo molecular por el cual el PF y la deficiencia de GHR /
IGF-1 promueven la recuperación / regeneración hematopoyética, volvimos a analizar
dos de los conjuntos de datos de microarrays publicados anteriormente y buscamos
genes cuya expresión cambió significativamente en respuesta a PF con un enfoque en
genes similarmente afectado por la exposición de las células epiteliales al suero
deficiente en IGF-1 ( Guevara-Aguirre et al., 2011 ; Kim y Volsky, 2005 ; Kirschner et
al., 2009 ; Lee et al., 2012).) En ratones hambrientos, la expresión de la subunidad
catalítica PKA alfa (PKACα) se redujo significativamente en todos los tejidos probados
(Tabla S3). Del mismo modo, IGF-1 en suero deficiente de la hormona del crecimiento
al receptor de la deficiente (GHRD) sujetos humanos causó cambios en la expresión de
ambos reguladores positivos y negativos de la PKA consistentes con una inhibición de
su actividad quinasa (Tabla S4).
Como PKA fosforila el factor de transcripción de unión al elemento de respuesta de
cAMP (CREB) en Ser133, p-CREB se usa comúnmente como un indicador de actividad
de PKA intracelular ( González y Montminy, 1989 ). Usando fibroblastos embrionarios
de ratón desprovistos del receptor de IGF-1 endógeno (células R) y aquellos que
sobreexpresan el IGF1R humano (célula R +) mostramos que la fosforilación de CREB
está regulada positivamente por IGF-1 / IGF-1R de una manera dependiente de PKA,
confirmando el enlace entre la señalización de IGF-1 y PKA / CREB en células de
mamífero ( Figura 4A ). La expresión del receptor de IGF-1 (IGF-1R), que era más alta
en células progenitoras en comparación con LT-HSCs ( Venkatraman et al., 2013 ), no
se vio afectada por PF ( Figura S4A ). Tomados en conjunto, nuestroin vivo resultados
indican que PF reduce la señalización de PKA en células BM al menos en parte a través
de la reducción de los niveles de IGF-1 y la actividad de PKA, pero sin afectar a la
expresión de IGF-1R ( Figura 4B ).
 Abrir en una ventana separada
Figura 4
El ayuno prolongado promueve la regeneración hematopoyética dependiente de IGF-1 /
PKA
(A) la fosforilación de PKA dependiente de CREB visualizado por ICC en fibroblastos
embrionarios de ratón (MEFs) desprovisto de IGF1R endógena (células R-) o la sobreexpresión
de IGF1R humana (R + células). Las células R + se trataron con IGF-1 y se compararon con
células transfectadas con PKACα siARN.
(B) El ayuno prolongado (PF) reduce tanto los niveles circulantes de IGF-1 como la actividad
PKA en células BM en ratones.
La inyección de IGF-1 atenuó la reducción inducida por PF (C) de PKA / pCREB, (D) aumentó
en células madre hematopoyéticas, (EH) El quimerismo de células derivadas de donantes en PB
y el de la MO se determinó 16 semanas después de la primaria y trasplante de BM secundario. n
= 4 a 8 ratones hembra por grupo, * p <0.05, ** p <0.01 y *** p <0.005 , ANOVA de una vía.

Para demostrar que IGF-1 es un mediador de los efectos dependientes de PF en HSCs,

probamos si IGF-1 exógeno puede atenuar el efecto de PF sobre el número de HSC y la
actividad de PKA. Los ratones en ayunas fueron inyectados con IGF-1 (200ug / kg) para
revertir la reducción de IGF-1 durante la PF. Los resultados indican que la
administración de IGF-1 atenúa significativamente la reducción de PKA / pCREB
inducida por PF en la población de LSK, particularmente en HSCs ( Figura
4C ). También mitigó el aumento inducido por PF en las HSC, pero no en los MPP
( Figura 4D y Tabla S4) Además investigamos si la inducción en HSCs puede conducir
a un injerto mejorado y si este efecto depende de IGF-1 / PKA. Los resultados de los
ensayos de repoblación competitiva indican que la PF mejoró la reconstitución
hematopoyética en PB y en BM. Este efecto fue bloqueado por IGF-1 exógena ( Figura
4E, 4F y S4B y S4C). Los resultados del trasplante secundario confirmaron aún más los
efectos en la capacidad de repoblación a largo plazo ( Figura 4G y H ). En general, estos
resultados apoyan firmemente un papel para IGF-1 menor y la consiguiente actividad
reducida de PKA en la estimulación dependiente de PF de auto-renovación de HSC y la
mejora en las capacidades de repoblación hematopoyética a corto y largo plazo ( Figura
4E a 4H) .
Como IGF-1R de señalización y IGF-1 de expresión fueron ambos reducen en las
células de nicho estromales de BM, (Lin - CD45 - ) de ratones en ayunas ( Figura 5A ),
se investigó si el nicho del estroma podría desempeñar un papel en la promoción de la
auto HSC inducida-PF -renovación mediante la reducción de los niveles de IGF-1 en el
microambiente (como se muestra previamente en la Figura 3A ). Para probar esto, LT-
HSC se purificaron (CD45 + LSK CD150 + CD48 - ) de los ratones en ambos PF o la
dieta de control y, a continuación expuestos transversal a las células de nicho estromal
(CD45 - Lin - fracción) de los ratones en ambos PF o la dieta ad lib utilizando sistemas
de cocultivo ( Figura 5B)) En particular, las LT-HSCs no pueden sobrevivir en ausencia
de nicho de células, por lo que las LT-HSCs aisladas no se estudiaron solas. Los
resultados indican que el efecto de PF en LT-HSC es suficiente para promover la auto-
renovación de LT-HSC y su capacidad para generar ST-HSC y no-LSK progenitores
(Lin-no-LSK) ( Figura 5C , comparando A con B, C a D). Además, las células de nicho
tratadas con PF podrían aumentar la generación de ST-HSCs a partir de LT-HSCs de
dieta libre (comparando de A a C) y aumentar más el número de ST-HSC generado por
LT-HSCs tratadas con PF (comparando B a D ) Estos resultados confirman el papel de
LT-HSCs en la mediación de la regeneración hematopoyética dependiente de PF, pero
también indican que las células de nicho expuestas a PF pueden contribuir al
componente ST-HSC de esta regeneración in vitro .
Figura 5
El papel del nicho estromal en la auto-renovación HSC inducida por PF
(A) Niveles de las proteínas indicadas en células de nicho estromal BM (Lin-CD45-).
(B) Representación diagramática del experimento de cocultivo.
(C) Número de progenies CD45 + generadas por LT-HSCs purificadas expuestas a las células
de nicho indicadas.
* p <0.05, ** p <0.01 y *** p <0.005, prueba t para (A) y ANOVA de una vía para (C).

La reducción de la señalización de IGF-1 o PKA promueve la autorrenovación

de HSC
PKA ha conservado papeles pro-envejecimiento en levaduras y mamíferos ( Fabrizio et
al., 2001 ; Rinaldi et al., 2010 ). En levadura, la integración de una copia adicional de la
subunidad reguladora e inhibitoria de PKA, BCY1 , ( BCY1 oe) aumentó mientras que
las mutaciones en BCY1 que activan PKA disminuyeron, la resistencia celular al estrés
oxidativo inducido por H 2 O 2 ( Figura 6A ) de acuerdo con nuestros resultados previos
con RAS2 - y mutantes deficientes en adenilato ciclasa ( Fabrizio et al., 2003 ; Fabrizio
et al., 2001) En las células de mamíferos, nosotros y otros confirmamos que la
interrupción de la señalización de PKA protege contra el estrés ( Figuras S5A a S5C )
( Yan et al., 2007 ).
Figura 6
La reducción de la señalización de IGF-1-PKA promueve la autorrenovación de células
madre hematopoyéticas
(A) Las células de levadura (fondo DBY746) que sobreexpresan BCY1 (BCY1oe), que reduce
la actividad de PKA, o células que portan mutaciones que activan la actividad de PKA
(bcy1CA1 y bcy1CA2) fueron cultivadas en SDC durante 3 días y se trató con H 2 O 2 (50 o 100
mM) durante 30 min a 30 ° C. Las células se diluyeron en serie y se sembraron en placas YPD.
(B) Vías de autorrenovación reguladas por PKA en ratones PF. Los niveles de fosforilación o
expresión de proteínas intracelulares en las poblaciones celulares indicadas y la expresión de
genes indicados en células BM totales. Se recogieron células BM de ratones con o sin inanición
48 h (AL y PF). n = 4 ratones hembra por grupo, ** p <0.01, * p <0.05, t-test .
(C) Número de células madre hematopoyéticas (por 5 × 10 5 total de BM) y células progenitoras
(LT-HSC, ST-HSC y MPP) bajo los tratamientos indicados. * p <0.05, ** p <0.01 y *** p
<0.005 , ANOVA de una vía. Ver también la Figura S7F y S7G.
Las células BM tratadas con PKA siARN, IGF-1R ARNsi o IGF-1 (frente a células no tratadas)
se trasplantaron en ratones receptores inmunocomprometidos.
(D) El injerto en PB se midió en el punto de tiempo indicado después del trasplante primario y
se midió el injerto en la MO al final de las 16 semanas posteriores al trasplante primario. n = 4 a
8 ratones hembras por grupo, * p <0.05 ** p <0.01 y *** p <0.005 , ANOVA de una vía.

El papel de PKA en la regeneración hematopoyética, sin embargo, es poco conocido. Se

sabe que la PKA regula negativamente a Foxo1 y regula positivamente CREB y G9a
( Chen et al., 2008 ; Gonzalez y Montminy, 1989 ; Lee et al., 2011 ; Yamamizu et al.,
2012a ). Los FoxOs mantienen la resistencia al estrés hematopoyético, la
autorrenovación y la homeostasis del linaje ( Tothova et al., 2007 ), mientras que CREB
y G9a promueven el linaje hematopoyético: compromiso y diferenciación ( Chen et al.,
2012 ; Yamamizu et al., 2012b ). Encontramos que en ratones PF, la reducción de la
señalización de IGF-1 / pAkt y PKA / pCREB se asoció con una inducción de la
expresión de Foxo1 y una reducción de G9a (Figura 6B y Figura S5E ), pero no afectó
las expresiones de Foxo3a y Foxo4 ( Figura S5F a S5H ). Además, los resultados
indicaron que los números de ST-HSC y MPP aumentaron significativamente después
del tratamiento con ARNip de PKA, así como después del tratamiento con ARNsi de
IGF-1 (Figura 6C , Figura S5D y Tabla S5 ), de acuerdo con el hallazgo de que la
inhibición de G9a aumenta las HSCs primitivas ( Chen et al., 2012 ).
Dado que la inhibición de mTOR, otro efector clave de la señalización de nutrientes,
mejora la autorenovación y el mantenimiento de HSC de forma autónoma y no
autónoma, examinamos la diafonía entre mTOR y PKA en HSC y MPP ( Chen et al.,
2009 ; Huang et al., 2012 ). El tratamiento con rapamicina ex vivo (un inhibidor de
mTOR) por sí solo no causó una inducción en el número de HSCs como se esperaba
basándose en estudios previos con tratamientos in vivo ( Figura 6C ) ( Nakada et al.,
2010 ; Yilmaz et al., 2012 ). Esto podría deberse a la necesidad de un período más largo
de inhibición de mTor para lograr la inducción de HSC ( Nakada et al., 2010) De hecho,
cuando se co-trató con ARNip de PKA, la rapamicina causó una inducción adicional en
ST-HSC y MPP, en comparación con la causada por PKA-knockdown solo, lo que
sugiere que la disminución de la señalización de PKA promueve la inducción de HSC,
que puede ser potenciada por mTor inhibición en ciertas subpoblaciones de células
madre y progenitoras ( Figura 6C ). Notablemente, la inhibición doble de PKA y mTOR
dio como resultado la inducción sinérgica en ST-HSC y MPP, pero mitigó la inducción
en LT-HSC causada por PKA knock-down solo, que es similar a lo causado por IGF-R
knock-down ( Figura 6C ), y de acuerdo con el posible papel de IGF-1 en la regulación
de PKA y mTOR en HSC ( Fontana et al., 2010a ; Longo y Fabrizio, 2002 ).
Las células BM tratadas con ARNsi de IGF-1R o siARN de PKA ex vivo (exBM) se
trasplantaron adicionalmente en los ratones receptores irradiados para examinar su
capacidad de reconstitución hematopoyética. De acuerdo con los efectos observados en
ratones PF, las células de BM deficientes en PKA o IGF-1R causaron una mejora
significativa en el injerto en PB y en BM en comparación con células de BM no tratadas
(Std) ( Figura 6D ). La capacidad de repoblación a largo plazo también se confirmó
mediante un trasplante secundario ( Figura S5I ).
Ir:

DISCUSIÓN
Al considerar los cambios en la expresión génica y el metabolismo, así como los niveles
de varias hormonas, la FP promueve efectos coordinados que serían difíciles de lograr
con cualquier intervención farmacológica o dietética. En la levadura, los cambios clave
responsables de estos efectos protectores de la inanición son la regulación negativa de
Ras / adenilato ciclasa / PKA sensible a la glucosa y de las vías Tor / Sch9 sensibles a
aminoácidos (S6K) ( Figura 7A ) ( Fontana et al. al., 2010b ). Cuando las mutaciones en
ambas vías se combinan, las células son extremadamente resistentes a una amplia
variedad de toxinas y pueden vivir hasta 5 veces más de lo normal ( Fabrizio et al.,
2001 ; Kaeberlein et al., 2005 ; Kenyon, 2001 ; Longo and Finch, 2003; Wei et al.,
2009 ). En mamíferos, las mutaciones que causan deficiencia en el eje GHR / IGF-1
promueven un rango de fenotipos que se superponen con aquellos en la levadura
altamente protegida con deficiencias en las vías de señalización de nutrientes que
incluyen enanismo, resistencia al estrés y prolongación de la longevidad ( Figura 7A )
( Lee y Longo, 2011 ). De hecho, las células de ratones deficientes en GHR / IGF-1
están protegidas de múltiples formas de estrés ( Brown-Borg et al., 2009 ; Salmon et al.,
2005 ) y los ratones deficientes en IGF-1 (LID), con un exceso 70% de reducción en
IGF-1 circulante, son resistentes a varios medicamentos de quimioterapia ( Lee et al.,
2010) Aquí conectamos las rutas pro-envejecimiento GHR-IGF-1 y PKA mostrando
que las funciones PKA corriente abajo de IGF-1 sensibilizan las células BM de acuerdo
con los resultados en levadura y con la conexión previamente establecida entre IGF-1 y
PKA en mamíferos células neuronales ( Subramaniam et al., 2005 ).
 Abrir en una ventana separada
Figura 7
PF reduce IGF-1 / PKA para promover la regeneración hematopoyética equilibrada del
linaje
(A) Un modelo simplificado para una ruta de PKA de señalización de nutrientes parcialmente
conservada en levaduras y células de mamíferos. Las flechas muestran acciones de promoción y
las barras horizontales indican acciones inhibitorias. GH, hormona del crecimiento; AC,
adenilato ciclasa; PKA, proteína quinasa A; CREB, proteína de unión al elemento de respuesta
cAMP; Foxo1, proteína de caja de Forkhead O1; G9a, H3 Lys-9 methyltransferase.
(B) Un modelo simplificado para efectos inducidos por PF en WBC y HSCs. El ayuno causa
una reducción importante en los leucocitos, seguido de su reabastecimiento después de la re-
alimentación, en base a los efectos sobre la autorrenovación de las HSC que resulta en un
aumento de células progenitoras e inmunes. Estos efectos de la PF pueden dar como resultado la
reversión de la inmunosupresión basada en la quimioterapia, pero también en el
rejuvenecimiento del perfil de la célula inmune en ratones viejos.

Sin embargo, los estudios de levadura y ratones deficientes en crecimiento no pudieron

haber predicho el notable efecto de los ciclos de FP en la promoción de la regeneración
del sistema hematopoyético basada en células madre. Inicialmente, se demostró que la
ingesta de calorías afecta el equilibrio de la autorrenovación y diferenciación de las
células madre, que es importante para el mantenimiento somático y la supervivencia a
largo plazo ( Bondolfi et al., 2004 ; Chen et al., 2003 ; Ertl et al., 2008). ; Jasper y
Jones, 2010 ; Rafalski y Brunet, 2011 ; Rando y Chang, 2012) En ratones, la restricción
calórica (RC) promueve la autorrenovación de células madre intestinales, injerto de
células madre musculares y regeneración neuronal, preserva la capacidad regenerativa a
largo plazo de HSC y previene la disminución del número de HSC durante el
envejecimiento en ciertas cepas de ratones ( Bondolfi et al., 2004 ; Cerletti et al.,
2012 ; Chen et al., 2003 ; Ertl et al., 2008 ; Rafalski y Brunet, 2011 ; Yilmaz et al.,
2012 ). La reducción de la señalización de mTOR ha sido implicada como uno de los
principales mecanismos moleculares responsables de los efectos de la CR sobre la
función mejorada de las células madre ( Huang et al., 2012 ; Rafalski y Brunet,
2011 ;Yilmaz et al., 2012 ). Sin embargo, ni la RC ni otras intervenciones dietéticas
habían demostrado previamente promover un efecto coordinado que condujera a la
regeneración y / o rejuvenecimiento de una parte importante de un sistema u órgano.
Debido a que durante el PF los organismos mamíferos minimizan el gasto de energía en
parte al reducir rápidamente el tamaño de una amplia gama de tejidos, órganos y
poblaciones celulares, incluidas las células sanguíneas, la reversión de este efecto
durante la regeneración representa una de las estrategias más potentes para regenerar el
hematopoyético y posiblemente otros sistemas y órganos de forma coordinada. Aquí
mostramos que PF causa una reducción importante en el número de WBC, seguido,
durante la re-alimentación, por un proceso coordinado capaz de regenerar esta
deficiencia del sistema inmune por cambios que comienzan durante el período de
ayuno, que incluyen un aumento importante en LT-HSC y ST -HSC y redirección de la
frecuencia de Ly-HSC / Bala-HSC / My-HSC que conduce a un modo equilibrado de
linaje. De hecho, mostramos que el PF solo causa un descenso del 28% en el número de
WBC, que se invierte por completo después de volver a alimentarlo (Fig. 7b ). Incluso
después de que los WBC son suprimidos o dañados severamente como consecuencia de
la quimioterapia o el envejecimiento, los ciclos de PF pueden restablecer el número
normal de WBC y el equilibrio del linaje, lo que sugiere que el organismo puede
explotar su capacidad de regenerar el sistema hematopoyético después de períodos de
inanición, independientemente de la causa de la deficiencia (Figura 7B ).
De acuerdo con nuestros resultados, la inanición protege las células madre germinales
(GSC) y extiende la longevidad reproductiva en C. elegans a través de un cambio de
energía adaptativo hacia las células menos comprometidas ( Angelo y Van Gilst,
2009 ). Por el contrario, el ayuno a corto plazo (≤ 24 h) en Drosophila promueve la
diferenciación de los progenitores hematopoyéticos en células sanguíneas maduras
( Shim et al., 2012 ). Será importante determinar si los cambios regenerativos
coordinados observados durante la FP y la reabsorción pueden parecerse, al menos en
parte, al sofisticado programa responsable de la generación del sistema hematopoyético
durante el desarrollo.
Estudios recientes revelaron que las HSC dependen en gran medida de los programas
metabólicos que evitan que el metabolismo aeróbico mantenga su estado quiescente y la
capacidad de autorrenovación ( Ito et al., 2012 ; Takubo et al., 2013 ; Yu et al.,
2013 ). En el caso de PF, el metabolismo energético cambia progresivamente de un
catabolismo basado en carbohidratos a un cuerpo graso y cetona, que podría contribuir a
la autorrenovación de HSC, de acuerdo con los hallazgos de que la oxidación de ácidos
grasos promueve la HSC asimétrica autorrenovación sobre el compromiso simétrico
( Ito et al., 2012 ).
Se sabe que PKA promueve la especificación de linaje de HSC a través de CREB y G9a
( Chen et al., 2012 ; Yamamizu et al., 2012b ). Como la inhibición de G9a ha sido una
estrategia clave para promover la reprogramación ( Huangfu et al., 2008 ; Shi et al.,
2008 ), la baja regulación inducida por PF de G9a que se muestra aquí puede redirigir el
destino celular a través de un proceso similar que causa la inducción en HSC,
análogamente a la causada por la inhibición de G9a ( Figura 5B ) ( Chen et al.,
2012 ). Estudios recientes también indican que la PKA puede fosforilar directamente y
regular negativamente a FoxO1 ( Chen et al., 2008 ; Lee et al., 2011;), que tiene un
papel importante en la resistencia al estrés de las células madre, la autorrenovación y el
mantenimiento de la pluripotencia ( Tothova et al., 2007 ; Zhang et al., 2011 ). Mientras
que la PKA está implicada en la diferenciación de células madre, nuestro estudio
sugiere que los ciclos de PF regulan por disminución el IGF-1 y la PKA para promover
la autorrenovación de las células madre.
Un reto terapéutico de la regeneración hematopoyética es estimular la producción de
células madre para la reparación inmediata de los tejidos, al tiempo que se evita el
agotamiento de las células madre bajo estrés ( Pang et al., 2011 ). Nuestros resultados
indican que los ciclos de una intervención dietética extrema representan una poderosa
media para modular reguladores clave de la protección celular y regeneración tisular,
pero también proporcionan una terapia potencial para revertir o aliviar la
inmunosupresión o inmunosenescencia causada por el tratamiento de quimioterapia y el
envejecimiento, respectivamente, y posiblemente por una variedad de enfermedades que
afectan el sistema hematopoyético y otros sistemas y órganos. Los datos clínicos que se
muestran aquí brindan resultados preliminares que respaldan la posibilidad de que estos
efectos también se puedan traducir en aplicaciones clínicas efectivas.
Ir:

PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES
Ratones
Ratones C57BL / 6J (laboratorio Jackson) se utilizaron en este estudio. Los ratones son
ayunados durante 48 horas o alimentados ad libitum antes del tratamiento de
quimioterapia. La ciclofosfamida (CP) se administró por vía intraperitoneal (ip) a la
dosis de 200 mg / kg cada 12-14 días (6 ciclos en total). Se inyectó IGF-1 (ip) a la dosis
de 100 μg / kg, dos veces al día. Se utilizaron ratones B6.SJL de 6 a 8 semanas de edad
(Taconic) como ratones receptores en el ensayo de repoblación competitivo. El
genotipado para ratones GHRKO se realizó como se muestra en la Figura S3A . Todos
los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con el Comité Institucional de
Cuidado y Uso de Animales de la USC y las pautas de los NIH.

Comet assay
El daño al ADN (incluidas las roturas de ssDNA y dsDNA) en células recién extraídas
de sangre y médula ósea (BM) fue evaluado por CometAssay (Trevigen, Inc,
Gaithersburg, MD) con un microscopio fluorescente Nikon Eclipse TE300 y analizado
con Comet Score (TriTek Corp. , ver1.5). Se calificaron 100-200 células por muestra
experimental.

Hemograma completo (CBC)

Se recogió sangre periférica (PB) a través de extracciones de sangre de la cola en tubos
capilares de microhematocrito heparinizados (FisherScitific) y se analizó usando el
analizador de hematología automático BC-2800 (Mindray). Los perfiles de CBC del
ensayo clínico se obtuvieron del ensayo clínico de fase
I NCT00936364 ( http://clinicaltrials.gov/show/ NCT00936364 ).

Ensayo de repoblación competitivo

La extracción de BM y el trasplante se realizaron como se describió previamente
( Adams et al., 2007 ). Brevemente, se recogieron células BM de ratones (C57B / 6J)
tratados con CP de 6 ciclos. 2,5 × 10 5 células BM de ratones tratados con CP se
mezclaron con un número igual de los de un ratón competidor de tipo salvaje (B6.SJL),
y se inyectaron en el receptor B6.SJL, irradiados letalmente 24 h previamente con 10
Gy de radiación . La contribución relativa del injerto de las diferentes fuentes celulares
se evaluó mediante citometría de flujo del PB con antígenos CD45.2 (C57B / 6) y
CD45.1 (B6.SJL).

Análisis FACS
Los análisis FACS para LT-HSC (LSK-CD48 - CD150 + ), ST-HSC (LSK-CD48 -
CD150 - ) y MPP (LSK CD48 + CD150 - ) en BM se realizaron como se describió
previamente ( Figura S1 ) ( Adams et al. ., 2007 ; Challen et al., 2010;). Las células BM
recién cosechadas se tiñeron con marcadores de linaje, tallo y progenitores, seguido de
tinción con Anexina-V / 7-AAD y ensayo TUNEL para el análisis de apoptosis o se
tiñeron con PY / Hoechst33342 o Ki67 / Hoechst33342 para el análisis del ciclo
celular. Para el análisis de repoblación competitivo, se recogió PB de la vena de la
cola. Se diluyeron 50-100 ul de sangre 1: 1 con PBS y se incubaron con anticuerpos
anti-CD45.1, anti-CD45.2 y anti-CD11b (BD Biosciences). El análisis se realizó con
BD FACS diva en LSR II.
Incorporación de BrdU
Para detectar la génesis celular, se inyectó a los ratones (ip) con el filtro esterilizado
BrdU 2,0% solución (Sigma) a 0,1 mg / g de peso corporal en PBS, dos veces al día,
durante 2 días, comenzando después de 24 horas de ayuno prolongado (ratones PF)
. Las células BM se recogieron y tiñeron con anti-BrdU combinándose con los
anticuerpos marcadores de la membrana plasmática como se menciona anteriormente y
se analizaron en diva BD FACS en un LSR II, de acuerdo con el protocolo del
fabricante (BD Biosciences).

Ensayo de estrés oxidativo para levadura

Las células del día 3 se diluyeron hasta una OD 600 de 1 en tampón K-fosfato (pH 6) y se
trataron con peróxido de hidrógeno 50 o 100 mM durante 30 minutos. Las diluciones
seriadas de células no tratadas y tratadas se detectaron en placas YPD y se incubaron a
30 ° C durante 2-3 días.

Cultivo celular y tratamientos

Las líneas celulares y células primarias utilizadas en este estudio se cultivaron a 37 ° C
y 5% de CO 2 . Fibroblastos embrionarios de ratón con IGF1R humano sobreexpresado
( células R + ) se derivaron de ratones IGF1R knockout (obtenidos del Dr. Baserga) y se
cultivaron en DMEM / F12 suplementado con 10% de FBS. Las células se sembraron al
80% (R +células) o 50% (exBM o hAFSCs) confluencia para IGF-1R y PKACα ARNsi
transfección (100nM, con 1% de reactivos de transfección X-tremeGENE, Roche) y / o
tratamiento con rapamicina (5nM) y las eficiencias de inhibición del objetivo las
proteínas se mostraron como la Tabla SThe inducción de IGF-1 (10 nM, 15 min) se
realizó a las 24 h después de la incubación estándar. La fosforilación de CREB se midió
mediante inmunocitoquímica (ICC) con el anticuerpo pCREB-AF488 (señalización
celular, 1: 200, durante la noche a 4 ° C). Se incubaron células BM, células HSC
aisladas y células del estroma BM con alfa-MEM + 10% de SFB. Los contenidos
celulares se analizaron mediante FACS como se describió anteriormente.

análisis estadístico
La importancia de las diferencias en las curvas de supervivencia del ratón se determinó
mediante Log-rank (Mantel-Cox). A menos que se indique lo contrario en las leyendas
de la Figura, los datos se presentan como medias ± sem. Se usaron pruebas t de Student
para dos grupos y ANOVA para grupos múltiples para evaluar la significación
estadística (* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.005).
1.
Reflejos

 El ayuno prolongado regula negativamente una nueva vía de IGF-1 / PKA en

células madre
 Prolongar el ayuno protege a las células hematopoyéticas de la quimiotoxicidad
 Los ciclos de ayuno prolongados promueven la autorrenovación del HSC para
revertir la inmunosupresión
 La inhibición de la señalización de IGF-1 o PKA imita los efectos del ayuno
prolongado
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Material suplementario
01
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EXPRESIONES DE GRATITUD
Agradecemos al Dr. Lora Barsky (USC Flow Cytometry Core Facility) por su asistencia
en el análisis FACS, y al Dr. R. Baserga (Thomas Jefferson University) por
proporcionar células R + y R-. Este estudio fue financiado en parte por NIH / NIA
otorga AG20642, AG025135 y P01 AG034906. VDL tiene participación accionaria en
L-Nutra, una compañía que desarrolla alimentos médicos.
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Notas a pie de página

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ha sido aceptado para su publicación. Como servicio a nuestros clientes, ofrecemos esta primera
versión del manuscrito. El manuscrito se someterá a correcciones, composición tipográfica y revisión
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durante el proceso de producción se pueden descubrir errores que podrían afectar el contenido, y
todas las exenciones de responsabilidad legales que se aplican a la revista pertenecen.

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REFERENCIAS

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