Laboratorio de Biotecnología Industrial

Escuela de Microbiología, Universidad de Antioquia

Cl. 67 #53 - 108, Medellín, Antioquia

Práctica No. 5

Evaluación de la de polifenoles a partir de alimentos comerciales a base de té

negro y cocoa utilizando isopropanol y etanol como solventes.
Sergio Cavadia 1, Camila Gómez 1, Santiago Erazo 1, Luisa Rojas 2
1
Estudiantes de microbiología industrial y ambiental, Escuela de Microbiología, Universidad de Antioquia.
2
Docente de Bioprocesos, Escuela de Microbiología, Universidad de Antioquia.

RESUMEN

La extracción de compuestos polifenólicos partir de material vegetal se estudia ampliamente debido a sus
propiedades beneficiosas para la salud y al considerarse sustancias de alto valor agregado. Por esta razón,
el objetivo de esta práctica consiste en evaluar la cinética y la eficiencia de extracción sólido-líquido de
compuestos polifenólicos a partir de cocoa en polvo y té negro utilizando isopropanol y etanol en solución
acuosa como solventes orgánicos. Utilizando isopropanol como solvente en la extracción de polifenoles, se
determinó experimentalmente una eficiencia de 7,69 % en el caso de la cocoa y de 4,70 % para el té negro.
La eficiencia de extracción de polifenoles utilizando etanol fue de 9,48 % para la cocoa y de 8,52 % para el
té negro. Se realizó un modelamiento cinético de la extracción de polifenoles aplicando el modelo de Peleg
(1981), y en la extracción con isopropanol, se determinó una velocidad de extracción de 0,0006 min.mL.µg-
1
en cocoa y 0,0008 min.mL.µg-1 en té negro. En la extracción con etanol se determinó una velocidad de
extracción de 0,0005 min.mL.µg-1 en cocoa y 0,0004 min.mL.µg-1 en té negro.

1. INTRODUCCIÓN
En la actualidad, la industria de alimentos se propone
desarrollar productos de consumo diario que, además
de suplir las necesidades energéticas y de nutrición,
contengan complementos que beneficien directamente
la salud de los consumidores [1]. Dentro de los
complementos nutricionales mencionados se
encuentran los compuestos fenólicos procedentes de
fuentes naturales como el té, el chocolate, el café, entre
otros [2]. Los polifenoles extraídos de material vegetal
se estudian ampliamente debido a sus beneficios en la
salud humana, principalmente atribuidos a sus
propiedades antioxidantes [2], [3].
Las sustancias fenólicas o polifenoles se asocian a la
prevención de enfermedades relacionadas con la
presencia de radicales libres (por ejemplo:
insuficiencias cardiovasculares, hipertensión, procesos
inflamatorios, asma, diabetes y Alzheimer) [3], [4].
Por tal razón, es posible considerar la extracción de
polifenoles a partir de materias primas o residuos
vegetales como una estrategia de interés para la
industrial biotecnológica de producción de alimentos.
En términos generales, se busca una obtención
sostenible de compuestos de valor agregado como los
polifenoles a partir de material vegetal, realizando
procedimientos de extracción sólido-líquido utilizando
solventes orgánicos de recuperación sencilla y que
sean inocuos para la salud humana [2], [5].
En este orden de ideas, el objetivo de esta práctica
consiste en evaluar la cinética y la eficiencia de
extracción de compuestos polifenólicos presentes en
dos productos de consumo cotidiano (cocoa en polvo
y té negro) utilizando dos solventes orgánicos, etanol
e isopropanol, en solución acuosa.

Marzo 2 de 2019
2. METODOLOGÍA
2.1. Extracción sólido-líquido de polifenoles.
Se evaluó el contenido de polifenoles en dos alimentos
de consumo cotidiano, cocoa en polvo y té negro. Para
esto, se agregó 1,0 g de cada sustrato en 15,0 mL
(6,7×104 µg/mL) de una mezcla de Isopropanol-Agua
(60:40) en un Erlenmeyer de 100,0 mL. De igual
manera, se evaluó la extracción utilizando una mezcla
Etanol-Agua (60:40). Los tratamientos se realizaron
por duplicado (réplica A y réplica B) y se incubaron en
un agitador orbital durante 60 min, a 150 rpm y 10°C.
2.2. Cuantificación de polifenoles extraídos.
A partir de la réplica A de cada sustrato y solvente se
tomaron 50 µL del sobrenadante cada 10 min durante
una hora. La muestra se suspendió en 950 µL de agua
destilada (dH2O) y se almacenaron a temperatura
ambiente hasta finalizar el muestreo.
2.4. Determinación de eficiencia de extracción.
La réplica B de cada tratamiento se realizó para
determinar la extracción total de polifenoles en
función de cada solvente. El contenido de esta muestra
se centrifugó a 5000 rpm durante 5 min y se transfirió
el sobrenadante, de un volumen aproximado de 5,0
mL, a un balón volumétrico de 50,0 mL y se aforó con
dH2O. Se repitió el proceso de cuantificación de
polifenoles descrito en el numeral 2.2.
Considerando los resultados de concentración de
polifenoles (µg GAE/mL) obtenidos al final de la
extracción en la réplica B de cada tratamiento, se
estableció la relación entre producto final con respecto
al sustrato inicial en las soluciones de cocoa y té negro
en isopropanol y etanol.
3. RESULTADOS
3.1. Extracción y cuantificación de polifenoles.

A partir de cada una de las soluciones almacenadas, se
tomaron 100 µL de muestra y se depositaron en
cubetas plásticas de espectrofotómetro, se adicionaron
750 µL de agua destilada y 100 µL de carbonato de
calcio (NaCO3) al 20 % p/v. Esta solución se incubó a
temperatura ambiente durante 5 min.
Tras incubar la muestra durante 60 min, se midió la
absorbancia de las alícuotas tomadas cada 10 min tras
someterlas a la reacción con el reactivo de Folin. Se
consideró la dilución 1:100 realizada a cada muestra
para cuantificar la concentración de polifenoles, los
resultados de absorbancia se observan en la tabla 1.

Posterior a la incubación de las muestras, se agregaron Tabla 1. Densidad óptica de muestras de cocoa y té negro analizadas
con el reactivo de Folin.
50 µL del reactivo de Folin a cada una, se
homogenizaron en un mezclador Vortex Maxi Mix II Absorbancia (760 nm)
e inmediatamente se almacenaron en oscuridad. Se Tiempo
Isopropanol-Agua Etanol-Agua
incubó la solución resultante durante 30 min a (min)
Cocoa Té Negro Cocoa Té Negro
temperatura ambiente.
0 0,225 0,051 0,023 0,041
La cuantificación de polifenoles fue realizada 10 1,113 0,374 0,986 0,994
mediante el método colorimétrico Folin-Ciocalteau 20 1,125 0,450 0,988 0,995
descrito por Botero, Londoño & Rojas (2016) [6] 30 1,134 0,581 0,951 1,188
empleando una curva estándar de concentración de
40 1,140 0,568 0,863 0,880
Ácido Gálico.
50 1,103 0,886 1,115 1,165
60 1,199 1,478 1,125 1,295
2.3. Modelo cinético de extracción de polifenoles. B 0,206* 0,097* 0,271* 0,236*
*Nota: Considerando el tratamiento de la réplica B, se definió una
A partir del modelo cinético propuesto por Peleg dilución de 1:10 para cada muestra.
(1982) se evaluaron las cinéticas de extracción de cada
solvente con respecto a los sustratos evaluados. Se A partir de la ecuación de la recta de concentración
determinaron las constantes cinéticas de extracción K1 estándar de equivalentes de ácido gálico [6] en función
(velocidad de extracción) y K2 (constante de de absorbancia de las muestras (ec. 1), se cuantificó la
capacidad) de los modelos obtenidos.
2
cantidad de polifenoles en las muestras a partir del 3000

Concentración (µg GAE/mL)

siguiente modelo de cálculo donde se ejemplifica la 2500

cuantificación en el tiempo 10 de la alícuota de la 2000

1500
réplica A de la extracción utilizando isopropanol-agua
1000
para cocoa, los resultados de concentración de todas 500
las muestras se presentan en la tabla 2. 0
0 10 20 30 40 50 60
Tiempo (min)
𝐴𝑏𝑠760𝑛𝑚 +0,07413
𝑃𝑜𝑙𝑖𝑓𝑒𝑛𝑜𝑙𝑒𝑠 (µ𝑔 𝐺𝐴𝐸/𝑚𝐿) = × 𝐹𝐷 (ec. 1)
0,05463 Cocoa Té Negro

Figura 1. Curva de extracción del contenido de polifenoles en cocoa y

Donde Abs760nm es el resultado de la cuantificación té negro en función del tiempo utilizando una mezcla isopropanol-agua
espectrofotométrica de la muestra y FD es el inverso del factor de (60:40) como solvente.
dilución de la muestra. Entonces:

3000

Concentración (µg GAE/mL)

0,225 + 0,07413
𝑃𝑜𝑙𝑖𝑓𝑒𝑛𝑜𝑙𝑒𝑠 (µ𝑔 𝐺𝐴𝐸/𝑚𝐿) = × 100 2500
0,05463
2000
1500
→ 𝑃𝑜𝑙𝑖𝑓𝑒𝑛𝑜𝑙𝑒𝑠 (µ𝑔 𝐺𝐴𝐸/𝑚𝐿) = 547,56 µ𝑔 𝐺𝐴𝐸/𝑚𝐿 1000
500
0
0 10 20 30 40 50 60
Tabla 1. Concentración de polifenoles cuantificada a partir de la curva Tiempo (min)
de calibración de equivalentes de ácido gálico por mililitro.
Cocoa Té Negro
Concentración (µg GAE/mL)
Tiempo
Isopropanol-Agua Etanol-Agua
(min) Figura 2. Curva de extracción del contenido de polifenoles en cocoa y
Cocoa Té Negro Cocoa Té Negro té negro en función del tiempo utilizando una mezcla etanol-agua (60:40)
0 547,56 229,05 177,80 210,75 como solvente.
10 2173,04 820,30 1940,56 1955,21
3.2. Modelo cinético de extracción de polifenoles.
20 2195,00 959,42 1944,22 1957,04
30 2211,48 1199,21 1876,50 2310,32 Se aplicó el modelo cinético linealizado de Peleg
40 2222,46 1175,42 1715,41 1746,53
(1982) (ec. 2) para definir la cinética de extracción y
determinar las constantes cinéticas asociadas a este
50 2154,73 1757,51 2176,70 2268,22
modelo de la siguiente manera:
60 2330,46 2841,17 2195,00 2506,19
𝑡
B 5127,77 3132,53 6317,59 5676,92 𝐶𝑡 = 𝐶0 + (ec. 2)
𝑘1 +𝑘2 .𝑡
Donde:
Con los datos de concentración de polifenoles en
Ct es la concentración de polifenoles extraídos en función del
función del tiempo de cada proceso de extracción se tiempo (µg GAE/mL).
realizó una curva de extracción para cada solvente. A
C0 l concentración inicial de polifenoles en la muestra (µg
continuación, se presentan las curvas, tanto para cocoa GAE/mL).
como para té negro, obtenidas utilizando la mezcla
t es el tiempo (min).
isopropanol-agua (fig. 1) y etanol-agua (fig. 2).
k1 es velocidad de extracción (min.mL/μg GAE).
k2 es constante de capacidad (mL/μg).

3
Con la ecuación linealizada de Peleg se construyeron Las constantes cinéticas calculadas en cada extracción
gráficas de línea recta de la forma Y = m X + b (ec. 3) se presentan a continuación en la tabla 3.
de la siguiente manera:
Tabla 2. Resumen de parámetros asociados a la velocidad de extracción
𝑡 de polifenoles.
= 𝑘2 . 𝑡 + 𝑘1 (ec. 3)
𝐶𝑡 −𝐶0
Sustrato Isopropanol-Agua Etanol-Agua
Donde: k1 k2 k1 k2
𝑡 Cocoa 0,0008 0,0006 0,0019 0,0005
corresponde a la variable dependiente Y (min.mL/μg GAE).
𝐶𝑡 −𝐶0 Té Negro 0,0095 0,0008 0,0023 0,0004
t es la variable independiente X (min). NOTA: k1 es velocidad de extracción (min.mL/μg GAE) y k2 es
k2 es la pendiente de la recta (mL/μg GAE) constante de capacidad (mL/μg).

k1 es el intercepto de la recta (min.mL/μg GAE) 3.3. Determinación de eficiencia de extracción de

Entonces, se definieron las cinéticas de extracción para
cada solvente. A continuación, se presentan las curvas,
para la extracción de polifenoles a partir de cocoa y té
negro, obtenidas utilizando la mezcla isopropanol-
agua (fig. 3) y etanol-agua (fig. 4).
0.06
t/Ct-C0 (min.mL/µg)
polifenoles.
El porcentaje de eficiencia de extracción (ec. 4) se
calculó considerando la cantidad final de polifenoles
extraídos en la réplica B a partir de la cantidad de
material vegetal utilizado. A continuación, se presenta
el modelo de cálculo para la eficiencia en la extracción
de polifenoles a partir de cocoa en polvo utilizando
isopropanol-agua. Los resultados de eficiencia de

0.05 todas las muestras se presentan en la tabla 4.

0.04
0.03
0.02
µ𝑔 𝐺𝐴𝐸/𝑚𝐿
0.01 %𝐸𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 𝐸𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑐𝑖ó𝑛 = × 100 (ec. 4)
µ𝑔 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎/𝑚𝐿
0.00
10 20 30 40 50 60
Tiempo (min)
Cocoa Té Negro
t/(Ct-C0) = 0,0006t + 0,0008 t/(Ct-C0) = 0,0008t + 0,0095 Se conoce que la concentración inicial de muestra en
R² = 0,9909 R² = 0,9663 los tratamientos de extracción fue de 6,7×104 µg/mL
Figura 3. Gráfica ajustada de relación entre concentración de polifenoles (1g/15mL) y se cuantificó una extracción final de
en función del tiempo en la extracción con isopropanol-agua (60:40). polifenoles de 5127,77 µg GAE/mL a partir de cocoa
utilizando isopropanol-agua. Entonces:

0.04
5127,77 µ𝑔 𝐺𝐴𝐸/𝑚𝐿
t/Ct-C0 (min.mL/µg)

0.03 %𝐸𝑓. 𝐸𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑐𝑖ó𝑛 = × 100

6,7 × 104 µ𝑔 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎/𝑚𝐿
0.02

0.01
→ %𝐸𝑓. 𝐸𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑐𝑖ó𝑛 = 7,69%
0.00
10 20 30 40 50 60
Tiempo (min)
Cocoa Té Negro
Tabla 4. Porcentaje de eficiencia de extracción de polifenoles.
t/(Ct-C0) = 0,0005t + 0,0019 t/(Ct-C0) = 0,0004t + 0,0023
R² = 0,9899 R² = 0,9862 Eficiencia Extracción (%)
Sustrato
Isopropanol-Agua Etanol-Agua
Figura 4. Gráfica ajustada de relación entre concentración de polifenoles Cocoa 7,69 9,48
en función del tiempo en la extracción con etanol-agua (60:40). Té Negro 4,70 8,52

4
4. DISCUSIÓN
La extracción de polifenoles a partir de matrices
alimentarias de consumo diario en esta práctica se
desarrolló con éxito. No obstante, en una comparación
con los resultados reportados en la literatura, la
recuperación de polifenoles a partir de té negro fue
menor (Jiménez y col. (2017) reportan un contendido
de polifenoles de 400 µg/g en infusiones de té negro
comercial [7]), esta variación se atribuye,
probablemente, a la diferencia en la producción y
especies de té utilizadas en las casas comerciales
productoras de este alimento. En el caso de la cocoa en
polvo, se debe considerar que este producto es un
modificador de leche derivado del cacao, y los
procesos necesarios para su elaboración podrían
reducir considerablemente algunas propiedades
nutricionales originales en la planta, por tal razón, no
fue posible realizar una comparación directa en los
contenidos de polifenoles entre cocoa en polvo y la
semilla de cacao. Se resalta que el proceso de
extracción realizado en esta práctica fue efectivo en las
dos matrices evaluadas y en consideración a lo
reportado por Guntero y col. (2015) para un análisis
robusto de una extracción de polifenoles se debe
examinar que la capacidad de extracción depende del
disolvente, la naturaleza y preparación de material a
extraer, temperatura, tiempo de extracción, relación
sólido-líquido, método de extracción empleado y la
posible presencia de sustancias de interferencia [8], así
que de esta manera, para elevar los rendimientos de
obtención de polifenoles es posible evaluar un
tratamiento de homogenización y molienda de las
muestras y la evaluación experimental de otros
solventes y temperaturas para la extracción.
Con base en la cinética de extracción en función de los
dos solventes utilizados, es posible inferir que la
velocidad de extracción de polifenoles es mayor
utilizando la mezcla isopropanol-agua, sin embargo, el
porcentaje de recuperación de polifenoles en ambas
muestras fue mayor en la extracción con etanol-agua.
Es necesario examinar detalladamente las diferencias
en las metodologías de cuantificación de polifenoles
para la cinética de extracción y para determinar la
eficiencia de extracción; es decir, la réplica A no se
sometió a un tratamiento de recuperación y
purificación riguroso como fue el caso de la réplica B,
por la tanto, la cuantificación de polifenoles es
difícilmente comparable entre ambos tratamientos.
De igual manera se considera que el contenido de
polifenoles en la muestra B fue filtrado y diluido en un
proceso posterior a la extracción, la dilución de esta
muestra se realizó con una aproximación volumétrica
y no se determinó exactamente la dilución realizada.
Observando las curvas de extracción (fig. 1 y fig. 2) se
determina que la cantidad de polifenoles extraídos a
partir de la cocoa se estabiliza a partir de 10 min de
extracción con los dos solventes evaluados. Por otra
parte, la extracción de polifenoles a partir de té negro,
aparentemente, no presentó una estabilización en el
tiempo evaluado, es decir, la cantidad de polifenoles
extraídos desde el té negro podría ser directamente
proporcional al tiempo de exposición al solvente. La
mezcla isopropanol-agua se considera como el
solvente evaluado en esta práctica que presentó las
constantes cinéticas de mayor magnitud debido a que,
tanto la velocidad de extracción como la contante de
capacidad, fueron mayores utilizando esta mezcla para
los dos productos alimenticios evaluados. No obstante,
la cantidad de polifenoles recuperados fue mayor
utilizando etanol-agua. A partir de las cinéticas de
extracción definidas se puede predecir la eficiencia de
extracción en función del tiempo, sin embargo, como
perspectiva se propone una evaluación intensiva,
aplicando un mayor número de réplicas y
homogenizando las muestras previamente, para las
extracciones realizadas en esta práctica para
determinar de manera robusta y estadísticamente
significativa las constantes cinéticas para generar un
modelo preciso para cada solvente y material vegetal.
En términos de eficiencia, se determinó
experimentalmente que la mezcla etanol-agua generó
mayor extracción de polifenoles en comparación con
la mezcla-isopropanol agua para las dos matrices
evaluadas. A partir de este resultado se infiere que el
etanol posee mayor afinidad y capacidad de extracción
de los polifenoles presentes en el té negro y la cocoa
en polvo. Como se mencionó previamente, el
rendimiento de la extracción depende parcialmente de
las características fisicoquímicas de la materia prima y
a afinidad del solvente por los compuestos a extraer
[7], [8], la especificidad de los solventes por los
compuestos de interés define en términos generales a
un proceso de extracción. Por ejemplo, en el caso de
requerir un extracto sólido derivado de material
5
vegetal se utilizaría un solvente que contenga afinidad
por los compuestos indeseados de la materia prima o
si se requiere purificar, hasta un grado farmacéutico,
los polifenoles extraídos a partir del té o la cocoa en
esta práctica, es necesario la implementación de
operaciones unitarias de secado, destilación y
concentración del producto con el objetivo de obtener
una cantidad considerable de polifenoles y de
recuperar el solvente para su reutilización.
Finalmente, se estima que la extracción de polifenoles
utilizando soluciones acuosas de etanol e isopropanol
podría ser efectiva en otras matrices afines a los
productos evaluados en esta práctica. Se plantea que es
posible realizar la extracción en otras variedades de té
o infusiones de origen vegetal y en otros derivados del
cacao ya que se evidenció que existe una afinidad de
los solventes evaluados por el contenido de
compuestos antioxidantes en el té negro y la cocoa en
polvo. De igual manera se propone que la combinación
de técnicas destinadas a la extracción es una alternativa
eficiente para la recuperación de compuestos de valor
agregado y nutricional como los polifenoles, por
ejemplo, existen algunos procesos que podrían
considerarse como extracciones sostenibles que
reducen la aplicación y recuperación de solventes, por
ejemplo, la extracción asistida por ultrasonido o la
extracción asistida por microondas [8] que aumentan
los rendimientos de recuperación de polifenoles a
partir de matrices vegetales.
5. CONCLUSIONES
 Utilizando una mezcla isopropanol-agua (60:40) se
determinaron las constantes cinéticas de extracción
fundamentadas en el modelo de Peleg (1982). Para
la extracción de polifenoles a partir de cocoa
comercial se evidenció una velocidad de
extracción de 0,0008 min.mL/µg GAE y una
constante de capacidad de 0,0006 mL/µg GAE, por
otra parte, la velocidad de extracción para el té
negro fue de 0,0095 min.mL/µg GAE y la
constante de capacidad fue de 0,0008 mL/µg GAE.
 Utilizando una mezcla etanol-agua (60:40) se
determinaron las constantes cinéticas de extracción
fundamentadas en el modelo de Peleg (1982). Para
la extracción de polifenoles a partir de cocoa
comercial se evidenció una velocidad de
extracción de 0,0019 min.mL/µg GAE y una
constante de capacidad de 0,0005 mL/µg GAE, por
otra parte, la velocidad de extracción para el té
negro fue de 0,0023 min.mL/µg GAE y la
constante de capacidad fue de 0,0004 mL/µg GAE.
 Se observó experimentalmente que la eficiencia de
extracción de polifenoles utilizando una mezcla de
isopropanol-agua (60:40) fue de 7,69 % a partir de
cocoa y de 4,70 % a partir de té negro.
 Se observó experimentalmente que la eficiencia de
extracción de polifenoles utilizando una mezcla de
etanol-agua (60:40) fue de 9,48 % a partir de cocoa
y de 8,52 % a partir de té negro.
 Se recomienda realizar pruebas con un mayor nivel
de detalle en las réplicas y condiciones de
operación del proceso de extracción de polifenoles
realizado en esta práctica para generar resultados
robustos de las cinéticas de extracción.
 A modo de perspectiva, se propone realizar
estudios complementarios en los cuales se evalúe
la aplicación de estrategias de extracción
combinadas, por ejemplo, la extracción con
solventes asistida por ultrasonido o microondas,
como alternativas para la recuperación de mayor
cantidad de polifenoles a partir de matrices
vegetales.
7. REFERENCIAS
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Mujica, and A. Martínez, “Evaluación
comparativa de los rendimientos obtenidos
mediante el proceso de extracción en aceites
vegetales a partir de semillas oleaginosas,” An.
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2009.
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Fenólicos a Partir De Subproductos De
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2015.
[3] E. Paredes, M. Quiroz, K. Quispe, B. Reyes, and
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dureza del agua durante la rehidratación de
6
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2012.
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“Extracción de polifenoles totales asistida por
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[8] V. Guntero, M. Longo, S. Ciparicci, R. Martini,
and A. Andreatta, “Comparación de métodos de
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la industria vitivinícola,” Asoc. Argentina Ing.
Quim., vol. 1, no. 1, pp. 1–9, 2015.