Guia de Laboratorio Cult Cel Tejidos

UNIVERSIDAD CATÓLICA DEL MAULE
Ingeniería en Biotecnología
GUIA DE LABORATORIO
CULTIVO DE CÉLULAS Y TEJIDOS VEGETALES
IBI-312
Elaborado: Dra. Karla Quiroz B y Dr. Ariel D. Arencibia R
Profesor de Laboratorio: Borys Chong Pérez

boryschong@gmail.com
2018
I. INTRODUCCIÓN
En general, se entiende por biotecnología toda técnica que utiliza organismos vivos o
sustancias obtenidas de esos organismos para crear o modificar un producto con fines
prácticos. La biotecnología puede aplicarse a todo tipo de organismos, desde las
bacterias, los animales, las plantas, y formas acelulares como los virus, esta nueva
rama de las ciencias se ha convertido en un elemento importante de la medicina, la
agricultura, la industria, medio ambiente.
Algunas aplicaciones de la biotecnología, como la fermentación y el malteado, se han

utilizado durante milenios. Otras son más recientes, pero están igualmente
consolidadas. Por ejemplo, durante decenios se han utilizado los microorganismos
como fábricas vivas para la producción de antibióticos destinados a salvar vidas
humanas, entre ellos las penicilinas, obtenida a partir de hongos del género Penicillium,
y la estreptomicina, obtenida a partir de la bacteria Streptomyces griseus. Los
detergentes modernos se basan en enzimas producidas por medios biotecnológicos, la
producción de queso de pasta dura se basa en gran medida en cuajo producido
mediante levaduras biotecnológicas y la insulina humana para los diabéticos se
produce actualmente gracias a la biotecnología.
La biotecnología se utiliza para resolver problemas en todos los aspectos de la

producción y elaboración agrícolas, incluido el fitomejoramiento, para elevar y
estabilizar el rendimiento, mejorar la resistencia a plagas, animales y condiciones
abióticas adversas como la sequía y el frío, y aumentar el contenido nutricional de los
alimentos. Se utiliza también, con el fin de crear material de propagación/plantación de
bajo costo y libre de enfermedades para cultivos como la frutilla, el arándano,
frambuesa, nueces y muchos otros cultivos de interés. También ha proporcionado
nuevos instrumentos para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades de las plantas
y para la evaluación y conservación de los recursos genéticos.
Otra aplicación interesante es en la aceleración de los programas de mejoramiento de

plantas, ganado y peces y para ampliar la variedad de características que pueden
mejorarse. La biotecnología está cambiando los forrajes y las prácticas de alimentación
de los animales para mejorar la nutrición de estos y reducir los desechos, así como en
diagnosticar enfermedades y producir vacunas contra enfermedades de los animales.
Es evidente que el concepto de biotecnología es más amplio que el de ingeniería

genética o transgénesis. De hecho, algunos de los aspectos menos controvertidos de la
biotecnología agrícola son en potencia los más importantes y beneficiosos para los
sectores socialmente postergados.
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UNIVERSIDAD CATÓLICA DEL MAULE, 2018
Una de estas aplicaciones es la producción masiva de plantas de todo tipo: forestales,
ornamentales, alimenticias, medicinales, frutales, hortícolas. Esta propagación masiva
puede alcanzarse mediante el uso de una biotécnica simple denominada
genéricamente CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES O CULTIVO IN VITRO DE
PLANTAS.
II. OBJETIVOS
Los objetivos de los pasos prácticos del módulo de Cultivo de Células y Tejidos
Vegetales para los alumnos de la carrera de Ingeniería en Biotecnología están
encaminados a lograr:
 Familiarizar a los estudiantes con algunas técnicas de uso frecuentes en
los laboratorios de ciencias.
 Aplicar algunos de los conceptos aprendidos durante su desarrollo
intelectual a situaciones concretas de los estudios más empleados en esta ciencia.
 Aprender y perfeccionar la elaboración de informes de laboratorio en los
que se incluye la evaluación, análisis y discusión de resultados experimentales.
III. BIOSEGURIDAD
Conjunto de normas y medidas preventivas, destinadas a mantener el control de
factores de riesgo en el laboratorio procedentes de agentes biológicos, logrando la
prevención de impactos nocivos frente a riesgos propios de su actividad diaria,
asegurando que el desarrollo o producto final de dichos procedimientos no atenten
contra la seguridad de los estudiantes, su salud y el medio ambiente.
La bioseguridad en el laboratorio se refiere al conjunto de medidas preventivas
destinadas a proteger la salud de las personas que allí trabajan. El propósito
básico es obtener un ambiente de trabajo seguro y ordenado”.
El objetivo principal de estas normas, es la PROTECCIÓN del personal que trabaja en
las instalaciones, reduciendo el riesgo en cada una de las actividades desarrolladas en
el laboratorio.
IV. Normas generales para el trabajo de laboratorio

El ingreso al laboratorio, será regulado por el responsable del mismo y limitado sólo al
personal autorizado. El personal que ingresa a las instalaciones, debe
responsabilizarse del cumplimiento de las normas de bioseguridad. Se debe cumplir lo
siguiente:
1. El ingreso al laboratorio se realizará exclusivamente con equipamiento
adecuado, es decir, delantal manga larga, abotonada, limpia y con calzado adecuado.
Siempre utilice zapatos cerrados y mantenga las uñas cortas, limpias y sin esmalte.
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2. Las personas con cabello largo deben recogerlo al inicio de las
actividades.
3. Lave correctamente sus manos al entrar y al terminar cada sesión
práctica.
4. Los libros y demás pertenencias personales deben ser ubicados en el
lugar dispuesto para ello dentro del laboratorio. NO deje sus pertenencias sobre las
sillas o mesones de trabajo.
5. El laboratorio siempre debe permanecer LIMPIO Y ORDENADO, durante
la ejecución de los procedimientos, revelado o lectura de pruebas y otras actividades.
6. Se PROHIBE estrictamente lo siguiente: comer, beber, fumar, aplicarse
cosméticos (en especial máscara de pestañas, que acelera el deterioro de los oculares
del microscopio).
7. Emplee los equipos según las instrucciones disponibles en el laboratorio,
así como, los protocolos o guías correspondientes a las prácticas. No manipule equipos
sin la autorización respectiva y más aún, si no posee las destrezas para hacerlo.
8. Realice el transporte de muestras dentro o entre laboratorios en
contenedores apropiados (cajas herméticas o neveras transportables), con los cuales
se eviten salpicaduras y sean de fácil desinfección.
9. Evite hablar en tono alto y realizando movimientos bruscos y descuidados
en el transcurso del laboratorio.
10. Al INICIO y al FINAL del procedimiento realizado en el laboratorio, limpie
la superficie de trabajo con solución desinfectante y ubique adecuadamente las sillas,
materiales y equipos utilizados.
11. Al final de cada procedimiento, disponga el material contaminado o limpio
en sus respectivos lugares, NO los deje sobre los mesones.
12. No pipetee con la boca, utilice para ello propipetas.
13. Evite el contacto de la piel con reactivos que puedan ser peligrosos para
usted. Utilice guantes. Cuando haya terminado de utilizar los guantes, deberá
desecharlos antes de salir del área de trabajo y NO tocar implementos, puertas,
equipos o materiales con ellos puestos.
14. Se usarán gafas protectoras y máscaras faciales si existe riesgo de
salpicaduras y/o aerosoles, o cuando se trabaja en condiciones asépticas. Debe
evitarse al máximo la formación de aerosoles durante el trabajo de laboratorio.
15. Los derrames y accidentes deben ser informados inmediatamente al
profesor del laboratorio.
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V. SESIONES DEL LABORATORIO DE CULTIVO DE CÉLULAS Y TEJIDOS
VEGETALES
Lugar: Laboratorio de Cultivo de Tejidos, CENBIO.
FECHA HORARIO N° GRUPON° PRÁCTICO TEMAS HPRA PROF
Marzo 19 14:30 - 16:35 hrs. Grupo 1 Práctico 1 Inducción de laboratorio 2:05 hrs. Borys Chong
Marzo 19 16:50 - 18:55 hrs. Grupo 2 Práctico 1 Inducción de laboratorio 2:05 hrs. Borys Chong
Abril 26 14:30 - 18:55 hrs. Grupo 1 Práctico 2 Preparación de soluciones 4:30 hrs. Borys Chong
Abril 2 14:30 - 18:55 hrs. Grupo 2 Práctico 2 Preparación de soluciones 4:30 hrs. Borys Chong
Abril 9 14:30 - 18:55 hrs. Grupo 1 Práctico 3 Preparación de medios de cultivo 4:30 hrs. Borys Chong
Abril 16 Semana Novata
Abril 23 14:30 - 18:55 hrs. Grupo 2 Práctico 3 Preparación de medios de cultivo 4:30 hrs. Borys Chong
Abril 30 14:30 - 18:55 hrs. Grupo 1 Práctico 4 Introducción de material vegetal 4:30 hrs. Borys Chong
Mayo 7 14:30 - 18:55 hrs. Grupo 2 Práctico 4 Introducción de material vegetal 4:30 hrs. Borys Chong
Mayo 14 14:30 - 18:55 hrs. Grupo 1 Práctico 5 Multiplicación, individualización y enraizamiento 4:30 hrs. Borys Chong
Mayo 21 Feriado
Mayo 28 14:30 - 18:55 hrs. Grupo 2 Práctico 5 Multiplicación, individualización y enraizamiento 4:30 hrs. Borys Chong
Junio 4 14:30 - 18:55 hrs. Grupo 1 Práctico 6 Biorreactores de Inmersión Temporal 4:30 hrs. Borys Chong
Junio 11 14:30 - 18:55 hrs. Grupo 2 Práctico 6 Biorreactores de Inmersión Temporal 4:30 hrs. Borys Chong
Junio 18 14:30 - 18:55 hrs. Grupo 1 Práctico 7 Adaptación ex vitro 4:30 hrs. Borys Chong
Junio 25 14:30 - 18:55 hrs. Grupo 2 Práctico 7 Adaptación ex vitro 4:30 hrs. Borys Chong
VI. EVALUACION
Cada sesión de laboratorio está acompañada con una prueba de entrada y un Informe
de la práctica respectiva. El control consta de un 30 % y el informe un 70 % de la nota
final de laboratorio. Al finalizar el semestre se hará una prueba de Laboratorio. El valor
de la nota del laboratorio pondera un 40 % de la nota de presentación a examen o nota
final según sea el caso.
VII. PREPARACION DEL INFORME DE LABORATORIO

1. Para realizar su informe usted debe escribir a espacio simple y justificado.
El espacio simple está permitido también para el encabezado de las tablas (notas al
pie), leyendas de las figuras y por último las referencias. Utilice la fuente Arial con un
tamaño 12. La máxima longitud del informe son 15 páginas incluyendo título, índices, y
referencias (ver más adelante). Enumere las páginas desde el título principal en
adelante (en sector inferior derecho). No enumere la primera página.
2. Los márgenes para la escritura son los siguientes:
Margen superior: 3,0 cm
Margen inferior: 3,0 cm
Margen izquierdo: 4,0 cm
Margen derecho: 2,5 cm
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3. El informe debe incluir: una página de título principal del trabajo (portada),
índice de contenidos, introducción, materiales y métodos, resultados (registre el
progreso de su actividad), discusión (comente lo realizado a nivel crítico según lo que
conoce de la literatura), conclusión y referencias.
4. Tanto las tablas como las figuras deben llevar títulos. Las notas al pie de
las tablas deben ser indicadas con superíndice. Los nombres taxonómicos deben ir en
letra cursiva o subrayada (Ej., “Escherichia coli o E. coli”). Los números decimales
deben ser separados por comas. Las unidades, abreviaturas y nomenclatura deben ser
las internacionalmente aceptadas (nomenclatura química y bioquímica deben seguir las
normas IUPAC-IUB).
5. Con respecto a la sección Bibliografía; siga el siguiente ejemplo si está
citando un artículo:
Solioz, M. y Vulpe, C. 1996. CPx-type ATPases: a class of P-type ATPases that
pump heavy metals. Trends Biochemistry Science 32(6):237–241.
Si está citando un libro:
Roberts, G.P. Y Ludden, P.W. 1992. Nitrogen fixation by photosynthetic bacteria.
En G.Stacey R.H. Burris y H.J. Evans (eds), Biological Nitrogen Fixation. pp 135-165.
Chapman and Hall, New York.
VIII. BIBLIOGRAFÍA GENERAL

1. Lectura Obligatoria
 Barrueto, P. 2010. Cultivo in vitro de Plantas. Editorial Embrapa Informacao
Tecnológica, Brasília. 303 p.
 George, Edwin F., Hall, Michael A., De Klerk, Geert-Jan. 2008. Plant propagation by
tissue culture. 3ra ed. Springer, Netherlands. 502 p
 Dirr, Michael A., Heuser, Charles W. 1987. The reference manual of woody plant
propagation from seed to tissue culture. Editorial Varsity Press, Georgia. 239 p.
2. Lectura Complementaria
 Luna Rosales, B., Romero Arredondo, J. 2001. Micropropagación de plantas. Editorial
Trillas, México. 107 p.
 Hartmann, H.T., D.E. Kester, F.T. Davis, R. Geneve. 1997 Propagación de plantas
principios prácticos. Editorial Continental, México. 760 p.
 FIA. 2009. Resultados y lecciones en sistema de inmersión temporal en especies
anuales, frutales y vides: proyecto de innovación en Regiones Metropolitana, del
Maule, del Biobío y de los Ríos / ed. de Fundación para la Inovación Agraria. 55 p.
 Jain, S. Mohan, Ishii, Katsuaki. 2003. Micropropagation of woody trees and fruits.
Editorial Kluwer Academic, Dordrecht. 840 p.
 Alvarez, B. 2001. Micropropagación de plantas. Editorial Trillas, México. 107 p.
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Laboratorio N°1
“Introducción al laboratorio”
Elaborado por: Dra. Karla Quiroz B y Borys Chong P
I. INTRODUCCION
El laboratorio de cultivo de tejidos es un lugar destinado a la investigación, docencia y
producción en cultivo de tejidos, el que debe reunir los requisitos y condiciones para un
funcionamiento ideal y adecuado para realizar los diferentes trabajos de siembra,
inducción, multiplicación, propagación in vitro y otros que se requieren para
complementar los conocimientos de todo aquel que desee iniciar e introducirse en el
mundo de la biotecnología vegetal.
El laboratorio de cultivo de tejidos no es muy distinto de cualquier otro laboratorio de
investigación; la diferencia principal estriba en las condiciones de asepsia que se
requieren para el establecimiento de cultivos in vitro asépticos.
De la misma forma que el científico aporta los elementos para la nutrición del tejido
vegetal cultivado in vitro, también controla su medio ambiente físico (temperatura,
humedad, iluminación). La realización el cultivo de tejidos vegetales se divide
naturalmente en una serie de procesos, a cada uno de los cuales se le puede asignar
una zona del laboratorio. Una instalación ideal podría ser la de un único recinto
compuesto de varias habitaciones, una para cada aspecto de trabajo, comunicadas
entre sí de forma que se cumpla un flujo de trabajo lógico. Sin embargo, en la realidad
es probable que haya más que dos zonas, una de laboratorio general y otra para el
mantenimiento de los cultivos. Cualquiera que sea la escala de operaciones, hay que
proceder con cuidado en la fase de planificación para atender a cada una de las tareas
y para separar procedimientos incompatibles. Por ejemplo, para evitar la contaminación
del medio de cultivo con detergente, el lavado de los frascos y la preparación de los
medios no deben hacerse en la misma zona (Withers. FAO- 1985)
II. OBJETIVOS
Conocer las instalaciones e infraestructura necesarias, así como todos los equipos,
herramientas, soluciones y reactivos necesarios e indispensables para el buen
funcionamiento de un laboratorio de biotecnología vegetal.
Comprender los requisitos necesarios de ambiente y espacio del laboratorio para el
desarrollo de cultivo de tejidos vegetales.
III. MATERIALES
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Equipo Materiales Reactivos
Equipos de determinación Material de cristalería Etanol de 96 y 70°

cuantitativa
(Se anexa relación) Hipoclorito de sodio
Fregaderos (equipados
Bisturís (10 y 22), Agua destilada y
para resistir ácidos y
mangos 3 y 4, pinzas de desionizada
álcalis) y áreas de
diferente punta y longitud
drenaje Además, se anexa
Tijeras relación de reactivos
Áreas para manipulación
asépticas Cuchillos
Hornos y ollas de presión Espátulas
Cuartos de cultivo o Sacabocados
incubadoras con control
Jeringas hipodérmicas
de luz, temperatura y
humedad Bandejas
Potenciómetros Papel aluminio
Balanza analítica y Papel estraza
técnica
Frascos de vidrio con
Cámara de flujo laminar tapa hermética
Refrigerador Plástico parafilm
Destilador de agua Filme plástico adherente
Autoclave Estantería
Microscopio Carro de laboratorio.
estereoscópico
Agitador magnético
Mecheros
IV. MÉTODO
El alumno conocerá las diferentes áreas que componen el laboratorio mediante un
recorrido y explicación por parte del profesor para señalar los componentes y funciones
que cumplen cada una de ellas y los requerimientos para su uso.
El alumno conocerá los equipos, instrumentos, dispositivos, materiales, reactivos y
soluciones que se requieren para realizar las prácticas de cultivo de tejidos, así como la
ubicación y función de cada uno de ellos.
El alumno investigara anticipadamente vía Internet y de fuentes bibliográficas todos los
componentes de un laboratorio de Biotecnología Vegetal sus características, usos,
manejo y trabajos que pueden realizarse en cada una de las áreas, equipos,
materiales e instrumentos.
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Para los equipos más sofisticados y de alta precisión se requiere usar más en detalle
su uso y manejo mediante prácticas adicionales y con el apoyo de manuales de
operación.
V. ACTIVIDADES PARA EL INFORME

1. Señalar las partes que componen un laboratorio de Biotecnología Vegetal.
2. Señalar las funciones que realiza cada área y que requisitos deben de cumplir
cada una de las áreas que componen un laboratorio de Biotecnología Vegetal.
3. ¿Cuál son los requisitos mínimos que debe cumplir un alumno al ingresar a un
laboratorio de Biotecnología Vegetal?
4. ¿Qué es la asepsia y como se logra en un laboratorio de Biotecnología Vegetal?
5. ¿Qué es la esterilización y que materiales, equipos, soluciones y medidas se
consideran para lograr esta condición?
6. Señalar las principales equipos, materiales, soluciones, herramientas y medidas
que se deben utilizar para mantener las condiciones de asepsia y esterilización.
7. Señalar que tipos de trabajo se pueden realizar en un laboratorio de
Biotecnología Vegetal.
8. Elaborar un plano que contemple la forma en que pueden estar distribuidas las
diferentes áreas que conforman un Laboratorio de Biotecnología Vegetal.
VI. REFERENCIAS
1. Lectura Obligatoria:
 George, Edwin F., Hall, Michael A., De Klerk, Geert-Jan. 2008. Plant propagation
by tissue culture. 3ra ed. Springer, Netherlands. 502 p
2. Lectura Complementaria:
 Luna Rosales, B., Romero Arredondo, J. 2001. Micropropagación de plantas.
Editorial Trillas, México. 107 p.
 Hartmann, H.T., D.E. Kester, F.T. Davis, R. Geneve. 1997 Propagación de
plantas principios prácticos. Editorial Continental, México. 760 p.
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Laboratorio N°2
“Preparación de Soluciones”
Elaborado por: Dra. Karla Quiroz B y Borys Chong Pérez
I. INTRODUCCION
Las soluciones stock o madres, son soluciones concentradas de los nutrientes que se
deben adicionar al medio de cultivo para el desarrollo del cultivo in vitro, según el medio
que se desea preparar (Tabla 1). Las soluciones stock se pueden preparar con
concentraciones 50x, 100x ó 200x veces la concentración normal. Las soluciones
madres de las concentraciones requeridas se preparan disolviendo la sustancia en el
agua destilada o des-ionizada, generalmente estéril.
Por lo general, la preparación del medio de cultivo se inicia preparando soluciones
concentradas (madre) de uno o más compuestos. Determinado volumen de cada una
de estas soluciones se mezclará más tarde para preparar el medio de cultivo final. Es
recomendable preparar las soluciones madres en cantidades relativamente altas y con
antelación para ahorrar el tiempo y el trabajo que implica pesar cada uno de los
ingredientes que componen el medio cada vez que se necesite la preparación del
medio de cultivo. Además, como muchos de los componentes (microelementos,
vitaminas, reguladores de crecimiento) son requeridos en pequeñas cantidades, si se
multiplica esa cantidad por un determinado número de veces para preparar la solución
madre, la labor de pesado será más fácil y precisa. La concentración de la solución
madre debe ser un factor a considerar. Las soluciones madres muy concentradas
tienden a formar precipitados. En algunos casos estos precipitados son el resultado de
mezclar sustancias incompatibles, por ejemplo, calcio, magnesio y fosfato. Es
recomendable que la solución madre no sea mayor de 100 veces (100x) la
concentración final en el medio de cultivo. No obstante, el volumen de medio a preparar
por semana en el laboratorio dará la pauta para considerar el grado de concentración
de la solución madre. Si la solución madre presenta precipitados es mejor descartarla
ya que no poseerá el balance adecuado de sustancias, alguna proporción de éstas
estará en el fondo con el precipitado.
El agua para preparar los medios de cultivo debe ser destilada, bi-destilada o
desionizada, ya sea por medio de equipos intercambiadores de iones o por equipos de
ósmosis inversa. Las soluciones madres deben almacenarse en el refrigerador. No se
puede dar un dato exacto de cuánto tiempo pueden permanecer almacenadas sin que
sufran deterioro, esto depende mucho de cómo se manipulen, el origen de los reactivos
utilizados en su elaboración y de otros factores. Como regla general, los compuestos
inorgánicos son más estables que los orgánicos, por lo que se ha recomendado
almacenar reguladores del crecimiento y vitaminas por un máximo de dos semanas y
los otros componentes por hasta dos meses, sin embargo, si se observa un precipitado
la solución debe descartarse inmediatamente.
Las soluciones madres de sales inorgánicas son fácilmente formuladas por la
disolución de cantidades prescritas de sus cristales en agua. Algunas sustancias
orgánicas, tales como las auxinas, citoquininas, giberelinas y vitaminas, son difíciles de
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disolver directamente en agua. Por ejemplo, las citoquininas, al igual que otros
compuestos básicos, se disuelven fácilmente en pequeñas cantidades de un ácido
diluido. También pueden utilizarse bases diluidas, etanol o dimetil sulfóxido (DMSO).
Las soluciones madres de la mayoría de las sales inorgánicas no requieren
refrigeración, aunque es preferible guardarlas en estas condiciones para evitar el
crecimiento de hongos y bacterias contaminantes que pueden crecer a temperatura
ambiente, sobre todo en verano. Antes de utilizar una solución madre es aconsejable
verificar que esté libre de precipitados y contaminación. Además, como medida de
precaución y para conocimiento de todos los que hacen uso de estas, en el momento
que se preparan las soluciones se debe ser etiquetar el frasco, colocando el nombre
del producto, la concentración, la fecha y quien la elaboró.
II. OBJETIVOS
 Conocer y aprender a preparar soluciones stock para el cultivo in vitro de plantas.
 Conocer los diferentes componentes del medio de cultivo y su naturaleza Química y
Bioquímica.
 Manejar las técnicas básicas a través del uso adecuado de reactivos.
 Comprender la importancia nutricional de los componentes de los medios de
cultivo.
III. MATERIALES
 Vasos de precipitado de diferentes volúmenes
 Matraces aforados de diferentes volúmenes
 Espátulas
 Recipientes para el pesado
 Probetas de diferentes volúmenes
 Reactivos para la preparación del medio de cultivo Murashige y Skoog (1962)
(MS)
 Balanza analítica
 Balanza técnica
 Agua destilada
 Botellas color normal y ámbar
 Refrigerador
 Micropipetas
 Puntas para micropipetas
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En la tabla 1 se encuentran los reactivos necesarios para la preparación de las
soluciones madres que posteriormente se utilizarán para la elaboración del medio de
cultivo MS. Para esto a cada estudiante, según el listado, le corresponderá la
elaboración de dichas soluciones, las cuales deben preparar a 50X, una vez terminada
su preparación debes rotular el frasco y colocar en el refrigerador según las
indicaciones de la guía. En el caso de los reguladores del crecimiento se procederá de
igual forma.
IV. MÉTODOS
Para la preparación se debe ser estricto en el cumplimiento de cada uno de los pasos
en la elaboración de la solución madre, además de ADICIONAR CADA PRODUCTO
SEGÚN EL ORDEN EN QUE APARECEN.
Se procede a constatar que se cuenta con todos los elementos requeridos para la
elaboración de la solución: agua destilada estéril, sales requeridas según el medio de
MS, vasos de precipitado, matraz aforado, para poder preparar las soluciones.
Se debe ser estricto en las medidas y formas de proceder. Un error en la preparación
de la solución puede alterar drásticamente los resultados de nuestros ensayos.
Concluida la elaboración de las soluciones, realizar el etiquetado y llevar a
refrigeración, en el caso de la solución de EDTA de Hierro debe evitar la exposición a la
luz, por lo que el frasco debe ser cubierto con papel de aluminio.
Concluida la elaboración fregar la cristalería empleada y otros equipos, retornar los
reactivos y otros productos a sus estantes o refrigeración, en el caso que los requiera.
Tabla 1. Medio de Murashige y Skoog, 1962
Reactivo mg/l
Macroelementos
NH4NO3 1650
KNO3 1900
CaCl2x2H2O 332,02
KH2PO4 170
MgSO4x7H2O 180,54
12
Microelementos
Na2EDTA 36,7
FeSO4x7H2O
H3BO3 6,20
CoCl2x6H2O 0,025
CuSO4x5H2O 0,025
KI 0,83
MnSO4xH2O 16,90
Na2MoO4x2H2O 0,25
ZnSO4x7H2O 8,60
Vitaminas
Mioinositol 100
Ácido Nicotínico 0,5
Piridoxina-HCl 0,5
Tiamina-HCL 0,1
Glicina 2
Tabla 2. Auxinas más utilizadas en el cultivo de células y tejidos
Abreviatura Nombre del regulador de crecimiento Uso más frecuente
AIB Ácido indol-3-butírico Obtención de raíces
AIA Ácido indolacético Obtención de raíces
2,4-D Ácido 2,4-Diclorofenoxiacético Obtención de callos
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Tabla 3. Citoquininas más utilizadas en el cultivo de células y tejidos
Abreviatura Nombre del regulador de crecimiento Uso más frecuente
BAP Bencil Aminopurina Obtención de brotes
2-ip Isopentil-adenina Obtención de brotes
Tabla 4. Diferentes medios reportados en la literatura
White’sa Heller’sb MS c ERd B5 e Nitsch’sf NTg

Constituyentes
Compuestos
inorgánicos
NH4 NO3 - - 1650 1200 - 720 825
KNO3 80 - 1900 1900 2527.5 950 -
CaCl2 x 2H2O - 75 440 440 150 - 220
CaCl2 x H2O - - - - - 166 -
MgSO4 x 7H2O 750 250 370 370 246.5 185 1233
KH2PO4 - - 170 340 - 68 680
(NH4)2SO4 - - - - 134 - -
Ca(NO3)2 x H2O 300 - - - - - -
NaNO3 - 600 - - - - -
Sulfato de sodio 200 - - - - - -

Na2SO4
NaH2PO2 x H2O 19 125 - - 150 - -
KCl 65 750 - - - - -
14
KI 0.75 0.01 0.83 - 0.75 - 0.83
H3BO3 1.5 1 6.2 0.63 3 10 6.2
MnSO4 x H2O - - - - 10 - -
ZnSO4 x 7H2O 3 1 8.6 - 2 10 -
ZnSO4 x 4H2O - - - - - - 8
ZnNaEDTA - - - 15 - - -
NaMoO4 x 2H2O - - 0.25 0.025 0.25 0.25 0.25
MoO3 0.001 - - - - - -
CuSO4 x 5H2O 0.01 0.03 0.025 0.002 0.025 0.025 0.025

5
CoCl2 x 6H2O - - 0.025 0.002 0.025 - -

5
CoSO4 x 7H2O - - - - - - 0.03
AlCl3 - 0.03 - - - - -
NiCl2 x 6H2O - 0.03 - - - - -
FeCl3 x 6H2O - 1 - - - - -
Fe2(SO4)3 2.5 - - - - - -
FeSO4 x 7H2O - - 27.8 27.8 - 27.8 27.8
EDTA de sodio . - - 37.8 37.8 - 37.8 37.8

Na2EDTA x 2H2O
Sequestreno 330Fe - - - - 28 - -
COMPUESTOS
ORGÁNICOS
Inositol - - 100 - 100 100 100
Ácido nicotínico 0.05 - 0.5 0.5 1 5 -
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Piridoxina HCl 0.01 - 0.5 0.5 1 0.5 -
Tiamina HCl 0.01 - 0.1 0.5 10 0.5 1
Glicina 3 - 2 2 - 2 -
Ácido fólico - - - - - 0.5 -
Biotina - - - - - 0.05 -
Sacarosa 2% - 3% 4% 2% 2% 1%
D-Manitol - - - - - - 12.7%
White, (1963); (b) Heller, (1953); (c) Murashige y Skoog (1962);

(a) (d) Eriksson (1965); (e) Gamborg et al
(1968); (f) Nitsch (1969); (g) Nagata and Takebe (1971).

Debe estar claramente definido en el informe y como parte de la búsqueda
bibliográfica, los términos medios de cultivos, soluciones madres, en este caso la
importancia y significación de estas en el trabajo del laboratorio, así como
concentración, solución y como calcular los valores en %, gramos, volumen de las
soluciones.
VI. REFERENCIAS
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Laboratorio N°3
“Preparación de Medios de Cultivo”
I. INTRODUCCIÓN
La preparación de los medios de cultivo para el trabajo en la propagación de material
vegetal es de gran relevancia para el establecimiento y desarrollo de los explantes.
Gran importancia tiene el considerar aspectos como la elección del medio nutritivo
óptimo para el material vegetal que se necesite introducir a condiciones in vitro, debido
a que los requerimientos nutritivos para un crecimiento in vitro óptimo varían con la
especie e incluso son específicos de acuerdo a la parte de la planta que se esté
cultivando y a la respuesta que se desea obtener. Por esta razón se han desarrollado
muchas formulaciones diferentes para los medios de cultivo.
Existen diferentes tipos de medios de cultivos, algunos resultan en una combinación
sólida o líquida de nutrientes y agua. Dentro de los nutrientes se incluyen sales
inorgánicas, vitaminas y aminoácidos, lo que se denomina a menudo como Medio
Basal y que puede ser suplementado con algún regulador de crecimiento dependiendo
de los resultados que se deseen obtener (enraizamiento, formación de callo,
estimulación de la división celular, etc). Es necesario además, añadir fuentes
carbonadas (glucosa, sacarosa, manitol), al medio de cultivo como parte de un recurso
energético a la planta ya que está en sus inicios no es completamente autotrófica
cuando se desarrollan en estas condiciones. Dentro de los medios de cultivo más
usados, se encuentran el medio informado por Murashige y Skoog (1962), conocido
como MS, cuyo uso es bien amplio e incluye la regeneración de plantas, formación de
callos, embriogénesis somática, entre otros. El medio de cultivo Van Waes (VW),
Woody Plant Medium (Lloyd y McCown, 1980) cuya principal característica es que
posee una baja concentración de sales y se usa especialmente para la propagación de
especies leñosas.
Por lo tanto, un medio de cultivo se forma de la mezcla en diferentes proporciones y
concentraciones de los siguientes compuestos:
 Compuestos orgánicos: reguladores del crecimiento (auxinas, citoquininas,
giberelinas, ácido abscísico, poliaminas), azúcares, aminoácidos, vitaminas,
 Compuestos inorgánicos: como son los macroelementos (N, P, K, Ca, Mg, S) y
microelementos (Fe, Zn, B, Mn, Cu, Ni, Co, Al, Mo, I),
 Mezclas de sustancias poco definidas: como son los Extractos de levadura,
extractos vegetales, peptona, hidrolizado de caseina y triptona,
 Agua destilada o des-ionizada.
Se podrían pesar las cantidades necesarias de todos y cada uno de los componentes
del medio. Esto, no obstante, sería una operación larga y tediosa, además de muy
imprecisa puesto que obligaría a pesar algunas cantidades muy pequeñas. Por esta
razón, en todos los laboratorios se acostumbra a preparar soluciones stock o llamadas
18
soluciones madres que es una solución concentrada de los distintos componentes del
medio deseado. Con esto se evita que se produzcan fenómenos de precipitación. Es
habitual trabajar con una solución stock de macronutrientes, una de micronutrientes,
una de hierro con un agente quelante, otra de vitaminas y mio-inositol, el cual
normalmente se pesa. Proceder de esa forma simplifica la preparación del medio: un
medio como el MS, que contiene un total de 20 substancias diferentes, requeriría otras
tantas pesadas, mientras que a partir de soluciones stock su preparación se reduciría a
cuatro medidas de volumen y una pesada (sacarosa). Las soluciones stock pueden
mantenerse durante un cierto tiempo en la nevera o en el congelador.
IMPORTANTE consideración es que al preparar un medio de cultivo y después de
añadir todos sus componentes, es necesario realizar un ajuste en el pH final. Para esto
se añade NaOH 0,1 N o HCl 0,1N al medio hasta lograr el pH deseado (la
concentración de estas soluciones dependerá del volumen de medio a preparar).
El pH final del medio de cultivo es un factor importante por diversas razones:
- Valores bajos, inferiores a 3,5 impiden la solidificación del medio de cultivo,
- Si la evolución del pH del medio (durante el cultivo) lo hace bajar por debajo de 3,5
se puede producir su licuación.
- El valor del pH puede afectar a la solubilidad de algunos componentes del medio de
cultivo
- El valor del pH puede afectar a la absorción de determinados nutrientes por parte del
explante (como ejemplo tenemos que la absorción de iones NO3-aumenta con la acidez
del medio de cultivo)
- El valor del pH del medio puede afectar al pH del citoplasma y como consecuencia a
la actividad de muchas enzimas
Por todas estas razones conviene optimizar el pH del medio para cada caso en
concreto. En general, se trabaja a pH entre 5.2 y 5.8.
Una vez ajustado el pH del medio, este sufrirá una ligera acidificación durante el
proceso de esterilización en autoclave, siguiendo con cambio en el pH debido a
razones fisiológicas durante el desarrollo del explante ya que se irá acidificando
progresivamente como resultado de la absorción diferencial de algunos componentes
del medio de cultivo, así como de la excreción de exudados por parte del explante.
Finalmente dependiendo del medio de cultivo que se desee preparar (medio semisólido
o líquido), se añadirá en el primer caso el agente gelificante (Agar), el que se fundirá
por calentamiento breve para luego ser dosificado en los contenedores adecuados. En
el caso de tratarse de un medio líquido se procederá a dosificar directamente en los
contenedores escogidos.
En algunos casos, donde alguno de los componentes del medio sea termolábil
(antibióticos, reguladores del crecimiento o algún otro componente), entonces se
procede a esterilizar primeramente los frascos de cultivo vacíos y posteriormente
esterilizar el medio de cultivo en un frasco de mayor volumen. Al concluir la
esterilización, este medio de cultivo se enfría y cuando tenga una temperatura entre 35-
45 ºC se le adiciona el reactivo termolábil (en el caso de que el medio sea semisólido),
19
se agita bien y rápidamente es dispensado en cada uno de los frascos estériles. Se
espera unos minutos hasta que el medio alcanza la dureza adecuada.
Generalmente los medios de cultivo, tanto sólido como líquido deben ser esterilizado en
autoclave en los contenedores bajo condiciones de presión y temperatura por tiempo
determinado, el cual dependerá del volumen de medio a esterilizar en cada frasco y del
tipo de autoclave a utilizar (generalmente a 121ºC durante 20 minutos).
II. OBJETIVOS
 Conocer y aprender a preparar diferentes de cultivos en dependencia de los
objetivos que se persiguen al cultivar plantas in vitro.
 Conocer los diferentes componentes del medio de cultivo y su naturaleza química y
bioquímica.
 Manejar las técnicas básicas a través del uso adecuado de reactivos, en particular
las soluciones madres y componentes de los diferentes medios de cultivo.
 Comprender la importancia nutricional de los componentes de los medios de cultivo
en la germinación de semillas, embriogénesis, organogénesis, etc.
III. MATERIALES
 Vaso de precipitado 500 mL
 Probeta de 10 mL
 Matraz de aforo de 500 mL
 Micropipeta de 1 mL
 Puntas azules
 Frasco de pesada o papel de aluminio
 Soluciones madres medio MS
 pH-metro
 Soluciones de NaOH 0,1N y HCl 0.1N
 Balanza analítica
 Agar y Sacarosa
 Agitador magnético
 Embudo
 Autoclave
 Frascos colados chicos
 Horno microondas
20
IV. MÉTODOS
1. Coloque ¾ partes de agua destilada en un matraz de aforo de 500 mL con el
agitador magnético en el interior.
2. Pese 30 gramos de sacarosa que se indican para el medio MS y añádalos con
ayuda del embudo al matraz de aforo.
3. Añada los volúmenes de cada una de las soluciones madres del medio MS según
corresponda.
4. Deje agitar durante 10 minutos o hasta que los nutrientes estén completamente
disueltos. En caso contrario, coloque más agua destilada al matraz hasta que la
solución se vea homogénea.
5. Asegúrese de que todos los componentes del medio se encuentren disueltos y
luego trasvase la solución a un vaso de precipitado de 500 mL para luego Ajustar el
pH del medio a 5,6- 5,7
6. Agregue 7,5 g/L de agar para al medio MS, agite y luego caliente la solución en
microondas. Esta solución debe ser agitada varias veces hasta que el agar este
completamente disuelto y se vea una solución homogénea. ¡CUIDADO! ¡Esta
solución está muy caliente y su derrame pueda causar quemaduras severas!
7. Dispense en los frascos disponibles previa agitación del medio. Empaquete los
frascos de cada tratamiento y marque el tipo de medio, la fecha y el equipo que
lo realizó.
8. Coloque los paquetes en la autoclave para realizar la esterilización del medio de
cultivo. Nota: LA PUESTA EN MARCHA DE LA AUTOCLAVE SERÁ REALIZADA
POR EL PROFESOR.

 Diferenciar los medios en dependencia de los objetivos y resultados a esperar
en nuestros ensayos. Consultar en la bibliografía.
 ¿Cuál es la concentración de las soluciones madres?
 Explica el uso de los reguladores de crecimiento en la obtención de
embriogénesis u organogénesis, en el cultivo de tejidos y argumenta la sinergia
entre ellos.
VI. REFERENCIAS
21
 Lloyd, G. McCown. 1980. Commercially-feasible micropropagation of mountain
laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot-tip culture. B., Int. Plant Prop. Soc. Proc. 30,
421.
 Murashige, T., Skoog, F. 1962 A revised medium for rapid growth and bioassays
with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarun, 15(3), 473-497.
22
Laboratorio N°4
“Introducción de Material Vegetal (Semillas)”
I. INTRODUCCIÓN
Durante el desarrollo de una planta los procesos de formación de semillas y de
germinación son procesos absolutamente indispensables para la dispersión y
perpetuación de la especie. Por este motivo, averiguar los mecanismos que gobiernan
la germinación de semillas ha sido esencial para comprender tanto el papel
reproductivo de éstas, como el papel que juegan en un contexto ecológico que tiene
implicaciones de competitividad y dispersión. Hasta el día de hoy se han identificado 4
requerimientos abióticos básicos necesarios para la germinación:
1. Agua, mediado principalmente por el potencial hídrico del ambiente y de la
semilla. Se considera que es el factor determinante para que se realice la germinación
(si no hay agua no hay germinación).
2. Oxígeno, el cual ingresa a la semilla en forma gaseosa o disuelto en agua.
3. Temperatura, específica para cada especie.
4. Luz, no es considerada un factor determinante, pero si un promotor de la
germinación.
La semilla contiene al embrión generado por la fecundación en la planta madre y el
éxito que tenga para su supervivencia depende mucho de su habilidad para germinar
en el lugar y momento apropiado. Esto se asocia a mecanismos adaptativos que
previenen la germinación en ausencia de un ambiente adecuado, lo que se denomina
latencia de semillas. En estos casos las estructuras de la semilla restringen cualquiera
de los factores antes mencionados, en especial el agua y el oxígeno, con lo cual se
limita la germinación. Dentro de los procesos y factores reconocidos para la liberación
de las semillas del estado de latencia se encuentran los siguientes:
 Post maduración (afterrippening): se obtiene cuando la semilla ha reducido el
nivel de humedad por desecación.
 Escarificación natural. Se refiere a la permeabilización de la testa producto de la
degradación de ésta por diversos medios naturales (microorganismos, desgaste
mecánico, paso por el tracto digestivo etc.), permitiendo la penetración de agua
y oxígeno hacia el embrión.
 Congelamiento/enfriamiento: existen semillas que requieren períodos de
congelamiento para germinar.
 Luz u oscuridad.
23
II. OBJETIVOS
 Comprender y evaluar los métodos (protocolos) de desinfección de semillas, para
su establecimiento in vitro.
 Inducir la germinación de semillas de diferentes especies vegetales para la
obtención de plántulas libres de hongos y bacterias.
 Comprender la importancia nutricional de los componentes de los medios de cultivo
en la germinación de semillas, embriogénesis, organogénesis, etc.
 Familiarizar al estudiante con las técnicas de cultivo de vegetales in vitro.
III. MATERIALES
BIOLÓGICO: Semillas seleccionadas por el profesor.
MATERIAL DE LABORATORIO:
 Medios de cultivos preparados para la germinación in vitro de semillas, según
cada equipo
 Botellas con agua destilada estéril. Una por equipo.
 Botellas con solución de hipoclorito de sodio al 2,5% estéril. Una por equipo
 Botellas con solución de sulfato de cobre al 2,5% estéril. Una por equipo
 Mangos de bisturí y hojas estériles
 Placas de Petri estériles
 Pinzas
 Gorros y tapa boca
 Papel toalla (Nova)
 Etanol al 70%
 Etanol de quemar
 Mecheros
 Cámara de flujo laminar
EQUIPOS:
IV. MÉTODOS
DESARROLLO:
1. Llevar al cuarto de siembra los materiales y medios de cultivos requeridos para
realizar la siembra de semillas.
2. Limpiar y desinfectar superficialmente la cámara de flujo laminar con etanol al 70%.
24
3. Encender la luz ultravioleta durante 25 minutos.
4. Proceder a realizar la desinfección de las semillas a sembrar, para lo cual debes
seguir el siguiente protocolo:
Desinfección de semillas:
 Poner las semillas en frascos limpios,
 Lavar con detergente (podría ser con tween 20) y agua corriente, enjuagar varias
veces.
 Colocar las semillas en los frascos estériles para realizar la primera fase de la
desinfección.
 Adicionar la solución de sulfato de cobre al 2,5%, y agitar durante 20 minutos.
 Retirar con cuidado la solución de sulfato de cobre al 2,5% y realizar 3
enjuagados con agua destilada estéril de 6 minutos.
 Adicionar la solución de hipoclorito de sodio al 2,5 y agitar durante 15 minutos.
 Retirar con cuidado la solución de hipoclorito de sodio al 2,5% y realizar 3
enjuagues con agua destilada estéril durante 6 minutos cada uno.
 Pasar las semillas a una placa de Petri estéril.
 Proceder a realizar la siembra.
 Una vez concluido realizar el rotulado de los frascos y llevarlos al cuarto de
incubación.
 Realizar una vez por semana la evaluación de los niveles de contaminación y
momento de la germinación y comportamiento de la misma.

 Como parte del informe a entregar debes realizar una búsqueda bibliográfica
dirigida a conocer cómo actúan en la germinación de la semilla los siguientes
factores: Agua, Oxígeno, Temperatura, Luz.
 El tiempo de germinación de las semillas, el % de germinación. Una
comparación de estos resultados con los demás equipos. Discutir a detalle el
papel que juega cada una de las soluciones en el proceso de desinfección.
VI. REFERENCIAS
25
 FIA. 2009. Resultados y lecciones en sistema de inmersión temporal en
especies anuales, frutales y vides: proyecto de innovación en Regiones
Metropolitana, del Maule, del Biobío y de los Ríos / ed. de Fundación para la
Inovación Agraria. 55 p.
 Alvarez, B. 2001. Micropropagación de plantas. Editorial Trillas, México.107p.
26
Laboratorio N°5
“Multiplicación”
I. INTRODUCCIÓN
MULTIPLICACIÓN DE BROTES. Durante esta fase se espera que los explantes que
sobrevivieron la FASE 1 originen brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varias
hojas. En la base de cada hoja hay una yema que se desarrollará luego de ser puesta
en contacto con el medio de cultivo. Periódicamente estos nuevos brotes se deben
subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u
otros recipientes adecuados. Estas operaciones se realizan en la cámara de flujo
laminar o en un lugar aislado que nos permita mantener las condiciones de asepsia. De
esta forma aumenta el número de plantas en cada repique o división de las plantas. El
número de plantas que se obtiene dependerá de la especie vegetal y de las
condiciones del medio de cultivo. El número de plantas que se obtiene por la vía de la
micropropagación permite alcanzar incrementos exponenciales, considerando que
todos los factores que afectan el crecimiento hayan sido optimizados.
II. OBJETIVOS
 Conocer los factores más influyentes en la multiplicación del material
establecidos a las condiciones in vitro de arándanos y camotes.
 Aprensión de habilidades en manejo en la cámara de siembra tendientes a la
multiplicación.
 Evaluación y cálculo de los coeficientes de multiplicación de cada especie o
variedad.
III. MATERIALES
 Tubos para cultivo o frascos con medio MS para multiplicación vegetativa
 Pinzas y bisturíes esterilizados en autoclaves
 Placas de Petri y papeles de filtro estériles
 Agua destilada estéril
 Etanol al 70%
 Tubo de 50 ml estéril con etanol 95% para sumergir pinzas y mangos de
bisturíes antes de flamearlo
 Mechero de etanol
 Encendedor o fósforos
 Guantes, mascarillas y gorros
27
IV. METODOLOGÍA
Multiplicación. (Repique).
1. Se acondiciona la cámara de flujo laminar, para lo cual se limpia el área de trabajo
con etanol al 70% y se enciende la UV por 30 minutos. Concluida la limpieza y
esterilización de la cámara.
2. Se trasladan los frascos de las variedades seleccionadas para el repique. Antes
de pasar a la cámara se deben revisar detenidamente para detectar signos de
contaminación.
3. Una vez realizado con éxitos la revisión se procede a limpiar la superficie de los
frascos con el atomizador con etanol al 70% y el papel estéril, para quitar
partículas de polvo o posible fuente contaminante.
4. Tomaremos las pinzas y bisturí, los colocamos en el tubo de 50 ml con etanol 95
% para el flameado. Estas herramientas se sitúan en las placas de Petri estéril.
5. Se flamea el frasco con el material biológico, se retira la tapa y se extrae la planta
fuera del frasco y se deposita en la placa de Petri, para realizar los cortes, los que
por lo general se realizan uni-nodal o bi-nodal.
6. Se toma el frasco con el medio de cultivo, se flamea y retira la tapa, para proceder
a realizar la siembra, con el auxilio de la pinza, la cantidad dependerá de la
especie.
7. Una vez terminado la siembra se procede al flameado de la boca del frasco y se
le coloca la tapa.
8. Se repite el procedimiento hasta que se concluya la siembra.
9. Se rotulan los frascos con el código de cada especie, fecha y operario.
10. Se retornan los frascos al cuarto de cultivo.

dirigida a conocer ANTECEDENTES DE LA MICROPROPAGACIÓN DE LAS
ESPECIES TRABAJADAS.
 Debes calcular el coeficiente de MULTIPLICACIÓN DE CADA ESPECIE. Debe
discutir qué importancia reviste está fase en los programas de reproducción
masiva de las especies de interés, argumente mediante un ejemplo. .
 Explicar el papel del medio de cultivo en esta fase, así como, la importancia de
los reguladores de crecimiento.
28
VI. REFERENCIAS
29
Laboratorio N°6
“Bioreactores”
I. INTRODUCCION
El empleo de los medios de cultivo en estado líquido es un aspecto primordial en la
automatización de la micropropagación y en el desarrollo de técnicas para la
producción a gran escala. Sus ventajas incluyen la facilidad de preparación,
esterilización y manipulación, mayor rapidez en la absorción de sustancias nutritivas y
la difusión de sustancias tóxicas producidas por el metabolismo de las plantas.
Además, la productividad de los operarios de cabina de flujo laminar aumenta debido a
que los explantes sólo deben ser colocados en contacto con el medio de cultivo sin
necesidad de manipularlos de forma individual. El cambio en la composición del medio
de cultivo puede efectuarse por simple transferencia. Esto brinda grandes posibilidades
para la automatización y la reducción de los costos de producción así como una mayor
eficiencia en la transferencia de las plantas a condiciones ex vitro. Sin embargo, en
condiciones estáticas provoca un efecto depresivo sobre el crecimiento del tejido en el
cultivo in vitro, ya sea por hipoxia o por hiperhidricidad. La hiperhidricidad,
anteriormente nombrada vitrificación, ha sido descrita con mayor frecuencia y es el
término empleado para caracterizar las malformaciones hiperhídricas que afectan tanto
a las plantas herbáceas como las leñosas durante su propagación vegetativa in vitro.
La técnica de inmersión temporal se desarrolló con el objetivo de reducir los problemas
de asfixia e hiperhidricidad, los daños mecánicos, la complejidad del equipamiento así
como lograr un aumento en la eficiencia de la micropropagación dado por el incremento
de los ritmos de producción y la calidad de los propágulos. El sistema permite el
contacto del medio de cultivo líquido con el material vegetal de manera intermitente y
por un corto período de tiempo y una disminución de los costos de producción, en
comparación con las formas convencionales de micropropagación. La renovación de la
atmósfera y el medio de cultivo reducen la humedad relativa e incrementa la
asimilación de agua y nutrientes. Por otra parte, producto de las inmersiones los
explantes quedan recubiertos por una fina película de medio de cultivo líquido que evita
la desecación sin obstaculizar la difusión de los gases. Además es de fácil manejo y
uso.
II. OBJETIVOS
 Familiarizar a los estudiantes con sistemas de cultivo semiautomatizados,
 Conocer los factores más influyentes en el cultivo in vitro de plantas en
sistemas de inmersión temporal de camote.
 Aprensión de habilidades en manejo en la cámara de siembra tendientes a la
multiplicación.
30
 Evaluación y cálculo de los coeficientes de multiplicación en sistemas de
inmersión temporal.
III. MATERIALES
 Plantas de camote cultivadas en medio de cultivo líquido.
 Frascos de Sistemas de Inmersión Temporal estériles con conexiones y
medio de cultivo MS.
 Frascos estériles vacíos.
 Pinzas y bisturíes esterilizados en autoclaves.
 Placas de Petri y papeles de filtro estériles.
 Agua destilada estéril.
 Etanol al 70%
 Tubo de 50 ml estéril con etanol 95% para sumergir pinzas y mangos de
bisturíes antes de flamearlo.
 Mechero de etanol
 Encendedor o fósforos.
 Guantes, mascarillas y gorros
IV. METODOLOGIA
 Se acondiciona la cámara de flujo laminar, para lo cual se limpia el área de
trabajo con etanol al 70% y se enciende la UV por 30 minutos. Concluida la
limpieza y esterilización de la cámara.
 Se trasladan los frascos de las variedades seleccionadas para el repique.
Antes de pasar a la cámara se deben revisar detenidamente para detectar
signos de contaminación.
 Una vez realizado con éxitos la revisión se procede a limpiar la superficie de
los frascos con el atomizador con etanol al 70% y el papel estéril, para quitar
partículas de polvo o posible fuente contaminante.
 Tomaremos las pinzas y bisturí, los colocamos en el tubo de 50 ml con etanol
95 % para el flameado. Estas herramientas se sitúan en las placas de Petri
estéril.
 Se flamea el frasco con el material biológico, se retira la tapa y se extrae la
planta fuera del frasco y se deposita en la placa de Petri, para realizar los
cortes, los que por lo general se realizan uni-nodal o bi-nodal.
31
 Se inoculan 20 explantes por frasco de 1L de los Sistemas de Inmersión
Temporal.
 Se flamean los frascos y se cierran, se rotulan y se llevan a las cámaras de
crecimiento donde son conectados a las respectivas mangueras.
 Programar los temporizadores y verificar que estos funcionan de manera
adecuada y que no hay escape de aire en los sistemas.

dirigida a conocer antecedentes del cultivo en sistemas de inmersión
temporal o biorreactores de inmersión temporal.
 Debes calcular el coeficiente multiplicación obtenido. Debe discutir qué
importancia reviste esta fase en los programas de reproducción masiva de
las especies de interés, argumente mediante un ejemplo. .
 Explicar los factores que pueden influir en la calidad de las plantas obtenidas
en estos sistemas de cultivos.
 Comparar los resultados obtenidos en esta práctica con los obtenidos para el
mismo cultivo en la práctica anterior.
VI. REFERENCIAS
1. Lectura Obligatoria.
 George, Edwin F., Hall, Michael A., De Klerk, Geert-Jan. 2008. Plant
propagation by tissue culture. 3ra ed. Springer, Netherlands. 502 p
 Dirr, Michael A., Heuser, Charles W. 1987. The reference manual of woody
plant propagation from seed to tissue culture. Editorial Varsity Press,
Georgia. 239 p.
2. Lectura Complementaria.
32
 Jain, S. Mohan, Ishii, Katsuaki. 2003. Micropropagation of woody trees and
fruits. Editorial Kluwer Academic, Dordrecht. 840 p.
 Alvarez, B. 2001. Micropropagación de plantas. Editorial Trillas,
México.107p.
33
Laboratorio N°7
“ADAPTACIÓN DEL MATERIAL in vitro A
INVERNADERO”
I. INTRODUCCION
Las características anatómicas y fisiológicas de las plantas micropropagadas hacen
necesaria para su supervivencia en condiciones ex vitro, una gradual adaptación a las
condiciones medioambientales ex vitro. Esta adaptación se le conoce con el nombre de
aclimatización (no confundir con aclimatación, que es un fenómeno natural) del
invernadero o del campo.
La última fase del proceso de micropropagación, llamada Fase 4, consiste en la
adaptación de las plantas procedentes de la fase de enraizamiento (Fase 3) a las
condiciones ex vitro. En algunas especies las Fases 3 y 4 se hacen simultáneamente,
es decir, se induce el proceso de enraizamiento durante la adaptación a las
condiciones ex vitro.
El medio ambiente artificial del laboratorio es diferente al que está en el exterior
(humedad, temperatura, gases, nutrientes, intensidad de luz). Por consiguiente, las
plántulas se deben adaptar del medio ambiente artificial al medio ambiente natural.
Durante el cultivo in vitro las plantas crecen bajo un ambiente con alta humedad
relativa, baja intensidad luminosa, temperatura constante, escaso intercambio gaseoso
y medios ricos en compuestos orgánicos, especialmente sacarosa. Estas condiciones
provocan cambios en la morfología y la fisiología de las plantas, que las hacen diferir
de las que crecen en invernaderos o en el campo. Los cambios fenotípicos que son
inducidos por las condiciones ambientales provocan que una gran parte de las plantas
micropropagadas no sobrevivan al trasplante en las condiciones naturales, lo que hace
necesario aplicar técnicas de aclimatación in vitro o ex vitro que garanticen un retorno
gradual a sus características morfológicas normales. La calidad de las plantas y la
eficiencia del proceso de micropropagación dependen de la aclimatación del material
vegetal. Se entiende por aclimatación la adaptación de las plantas de un entorno en
otro, como el dar el paso de una zona de producción o invernadero al interior de un
centro comercial, el traslado a otra localidad, etc., y la duración del proceso dependerá
de la especie, de las condiciones de cultivo y de la magnitud del cambio.
II. OBJETIVOS
 Conocer los factores más influyentes en la aclimatización del material in vitro.
 Conocer las diferentes técnicas de aclimatación.
 Aprensión de habilidades en manejo de invernadero tendientes a la
aclimatización.
III. MATERIALES
34
 Frascos con plantas in-vitro (camote y arándanos).
 Bandejas de 50 pocillos.
 Turba y perlita. (64/36 %).
 Vasos de Precipitado.
 Bolsas de plástico para basura.
 Bisturí.
 Lápiz.
IV. METODOLOGIA
Aclimatación de las plantas in vitro
1. La turba requerida con la perlita para obtener una mejor consistencia y las
plantas puedan plantarse y enraizarse sin problema y así obtener un
desarrollo adecuado.
2. Tomaremos unas pinzas con las cuales sacaremos cuidadosamente las
plantas del frasco.
3. Una vez las plantas fuera del frasco se lava para retirar el material
adherido en las raíces.
4. Si se conserva aún partes blanquecinas se debe cortar con el bisturí para
evitar que un hongo inhiba su crecimiento.
5. Revisaremos que la bandeja tenga un buen drenaje de agua y una
humedad óptima para su desarrollo.
6. Se llenarán los pocillos con el substrato previamente mezclado es decir la
turba y perlita.
7. Para la siembra debes abrir un orificio en el substrato para realizar la
siembra:
 En arándano: Debes emparejar las plantas a sembrar para tener
uniformidad de las plantas. Para lo cual debes cortarlas todos a una
altura de 6 cm. En el momento de la siembra debes colocar ±2 cm bajo el
sustrato y 4 cm por encima. Una vez colocada en orificio debes ejercer
presión para fijar la planta, de no seguir estos procedimientos corres el
riesgo de que muera.
 En Camote: Cortar las plantas a sembrar a ±10 cm para que estas

queden uniforme. En el momento de la siembra debes colocar ±2 cm por
debajo del sustrato y el resto por encima. Una vez colocada en orificio
debes ejercer presión para fijar la planta, de no seguir estos
procedimientos corres el riesgo de que muera.
35
8. Realizar todas las anotaciones y rotular la bandeja, la que debes colocar
sobre el mesón del invernadero, donde las condiciones de temperatura,
humedad estás ajustadas. Para lo cual se debe consultar al encargado
del Invernadero.

dirigida a conocer ANTECEDENTES DE LA ADAPTACIÓN DE AMBAS
ESPECIES.
 Debes calcular la supervivencia. Debe discutir el porqué del éxito o fracaso de la
adaptación explicando cada uno de los elementos considerados por ti.
 Explicar el papel del SUSTRATO, además de buscar qué otros substrato
consideras pudieron ser utilizados.
VI. REFERENCIAS
1. Lectura Obligatoria.
2. Lectura Complementaria.
36

Guia de Laboratorio Cult Cel Tejidos

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VII. PREPARACION DEL INFORME DE LABORATORIO

VIII. BIBLIOGRAFÍA GENERAL

Equipos de determinación Material de cristalería Etanol de 96 y 70°

V. ACTIVIDADES PARA EL INFORME

Tabla 1. Medio de Murashige y Skoog, 1962

Ácido Nicotínico 0,5

Tabla 2. Auxinas más utilizadas en el cultivo de células y tejidos

Abreviatura Nombre del regulador de crecimiento Uso más frecuente

AIB Ácido indol-3-butírico Obtención de raíces

AIA Ácido indolacético Obtención de raíces

2,4-D Ácido 2,4-Diclorofenoxiacético Obtención de callos

Abreviatura Nombre del regulador de crecimiento Uso más frecuente

BAP Bencil Aminopurina Obtención de brotes

2-ip Isopentil-adenina Obtención de brotes

Tabla 4. Diferentes medios reportados en la literatura

White’sa Heller’sb MS c ERd B5 e Nitsch’sf NTg

NH4 NO3 - - 1650 1200 - 720 825

KNO3 80 - 1900 1900 2527.5 950 -

CaCl2 x 2H2O - 75 440 440 150 - 220

CaCl2 x H2O - - - - - 166 -

MgSO4 x 7H2O 750 250 370 370 246.5 185 1233

KH2PO4 - - 170 340 - 68 680

Ca(NO3)2 x H2O 300 - - - - - -

Sulfato de sodio 200 - - - - - -

NaH2PO2 x H2O 19 125 - - 150 - -

H3BO3 1.5 1 6.2 0.63 3 10 6.2

ZnSO4 x 7H2O 3 1 8.6 - 2 10 -

NaMoO4 x 2H2O - - 0.25 0.025 0.25 0.25 0.25

CuSO4 x 5H2O 0.01 0.03 0.025 0.002 0.025 0.025 0.025

CoCl2 x 6H2O - - 0.025 0.002 0.025 - -

CoSO4 x 7H2O - - - - - - 0.03

NiCl2 x 6H2O - 0.03 - - - - -

FeSO4 x 7H2O - - 27.8 27.8 - 27.8 27.8

EDTA de sodio . - - 37.8 37.8 - 37.8 37.8

Inositol - - 100 - 100 100 100

Ácido nicotínico 0.05 - 0.5 0.5 1 5 -

Tiamina HCl 0.01 - 0.1 0.5 10 0.5 1

Ácido fólico - - - - - 0.5 -

White, (1963); (b) Heller, (1953); (c) Murashige y Skoog (1962);

V. ACTIVIDADES PARA EL INFORME

V. ACTIVIDADES PARA EL INFORME

V. ACTIVIDADES PARA EL INFORME

V. ACTIVIDADES PARA EL INFORME

V. ACTIVIDADES PARA EL INFORME

 En Camote: Cortar las plantas a sembrar a ±10 cm para que estas

V. ACTIVIDADES PARA EL INFORME

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