1 INTRODUCCIÓN

Las enfermedades constituyen un factor limitante en el desarrollo de la producción de

especies animales para el consumo humano, de allí que se buscan herramientas de control en
el tratamiento de patologías infecciosas. La rutina de control de los microorganismos
patógenos ha sido el suministro de antibióticos, sin embargo, se han presentado
inconvenientes, tales como la resistencia bacteriana, constituyendo así una alternativa el uso
de probióticos.
A medida que se desarrollan en Chile métodos intensivos de producción de especies, se
ha incrementado la incidencia de enfermedades, ya que la utilización de densidades altas de
especies animales destinadas a consumo humano crea situaciones de estrés que propician el
establecimiento de patógenos oportunistas.
Hoy en día, el único método practicado para el manejo de poblaciones bacterianas
indeseables es el uso de quimioterapéuticos, pero su uso inadecuado ha creado resistencia
entre las bacterias, por lo cual se ha buscado alternativas para el control de enfermedades,
destacándose la prevención. Bajo este principio ha surgido el empleo de microorganismos
benéficos llamados probióticos, como control biológico en la prevención de ataques
bacterianos.
Es así que el término probiótico se define como un suplemento microbiano formado
por un cultivo simple o mixto de microorganismos seleccionados que son adicionados con el
propósito de manipular las comunidades microbianas presentes en los sistemas de producción,
entendiéndose que la manipulación microbiana es una herramienta viable para reducir o
eliminar la incidencia de microorganismos patógenos y además, constituye una alternativa
para la sustitución de agentes quimioterapéuticos en la prevención de enfermedades.
Las cepas valiosas se tienen que conservar durante largos períodos de tiempo libres de
cambios fenotípicos1adversos. En vista de lo anterior, el éxito en la preservación de los
cultivos microbianos es esencial para las actividades de investigación o industriales, basadas
en la actuación de estos microorganismos.

1
Fenotipo es cualquier característica detectable de un organismo (por ejemplo, estructural, bioquímico,
fisiológico y las relativas a la conducta) determinado por una interacción entre su genotipo y su medio ambiente.

1
 La elección del método de conservación utilizado debe permitir mantener las
características del microorganismo por las cuales fue seleccionado, siendo el secado una
alternativa a estudiar, dado que es técnicamente realizable a escala piloto, el producto que se
consigue por este proceso presenta alta viabilidad y mantiene sus características probióticas.

2
2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo general

Obtener un producto deshidratado de microorganismos probióticos (lactobacilos),

empleando técnicas de secado que minimicen el posible deterioro del producto.

2.2 Objetivos específicos

 Determinación de las condiciones de operación óptimas del secador que permitan obtener
un producto probiótico deshidratado.

 Determinar la resistencia al estrés térmico de la cepa de Lactobacillus seleccionada.

 Determinar la resistencia al estrés osmótico y químico de la cepa de Lactobacillus

seleccionada.

 Determinar el efecto de la etapa de secado y el efecto de agentes protectores sobre la

viabilidad del producto durante su almacenamiento.

3
3 ANTECEDENTES GENERALES

3.1 Alimentos Funcionales

Dentro de los alimentos funcionales2, han adquirido un papel relevante los probióticos,
prebióticos y simbióticos, con importantes funciones en la prevención y tratamiento de las
enfermedades, en la regulación del metabolismo y en la calidad de vida de los seres humanos,
y en este último tiempo, a los animales de consumo humano, tal como puede observarse en la
tabla 1. [1]
Los probióticos son organismos vivos, no patógenos, agentes biológicos con un
impacto significativo en la composición de la microflora intestinal, tanto cualitativa, como
cuantitativamente. Actúan estimulando selectivamente el crecimiento y la actividad de un
número limitado de bacterias, en especial, las bifidobacterias y lactobacillus (bacterias
amigas, beneficiosas o buenas), e inhibiendo el crecimiento de la flora patógena. Este hecho es
muy importante desde el punto de vista fisiológico, ya que la microflora intestinal tiene a lo
largo de todo el ciclo vital una gran influencia en el mantenimiento de la homeostasis 3, de la
función intestinal, de la inmunomodulación, como barrera contra la colonización por
patógenos intestinales y la diseminación bacteriana intestinal; en la alergia, en la absorción de
la lactosa, en el metabolismo, en la producción de vitaminas y en la neutralización de toxinas,
mutágenos y tumorígenos, y como fuentes de energía. [1]
Los prebióticos son ingredientes alimentarios no digeribles, fundamentalmente hidratos
de carbono, y en menor medida proteínas, cuya fermentación bacteriana en el colon favorece
el crecimiento selectivo y/o actividad de un número limitado de bacterias, principalmente
bifidobacterias y lactobacilos, en detrimento del crecimiento de patógenos en la flora colónica.
Además, juegan un importante papel en funciones inmunes gastrointestinales, en la
biodisponibilidad de minerales, en el metabolismo de lípidos y en la carcinogénesis colónica.[1]

2
Se denominan alimentos funcionales a aquellos alimentos que, además de nutrir, ejercen una acción
beneficiosa para la salud de quienes los consumen.
3
En su aplicación específica a la biología, la homeostasis es el estado de equilibrio dinámico o el conjunto de
mecanismos por los que todos los seres vivos tienden a alcanzar una estabilidad en su medio interno.

4
Tabla 1. Alimentos funcionales. Ejemplos de probióticos, prebióticos y simbióticos.
Alimentos Ejemplo
Definición Alimento usual
funcionales componente
Alimento suplementado
con bacterias vivas que
Yogur y otros
alcanzan el colon y Lactobacilos
Probióticos productos lácteos
favorecen el balance de Bifidobacterias
fermentados
la microflora intestinal,
la salud y el bienestar
Alimentos o
suplementos no
digestibles y
Inulina Alimentos naturales
fermentables en el
Oligosacáridos o incorporados a
Prebióticos colon, que favorecen el
Galactooligosacáridos bebidas, productos
crecimiento selectivo de
Fructooligosacáridos lácteos, pastelería
bacterias no patógenas
con beneficios para la
salud y bienestar
Mezcla de pro y
prebióticos, que
favorece la
sobrevivencia e Fructooligosacáridos Productos lácteos
Simbióticos
implantación de + bifidobacterias fermentados
microorganismos vivos
para la flora intestinal y
la salud y bienestar

3.2 Probióticos

El término probiótico provienen del griego y quiere decir “por la vida” (Fuller, 1989) [8].
Generalmente se define como “organismos o substancias que tienen un efecto beneficioso para

5
el animal anfitrión (humano y no humano) y que contribuye a su balance microbiano
intestinal”. Definiciones como ésta no son del todo satisfactorias, porque el término substancia
incluye a químicos como los antibióticos. Más recientemente, Havenaar y Huis[2] (1992)
ampliaron la definición de probióticos a través de “mezclas o monocultivos de
microorganismos que, aplicados a un animal o ser humano, afectan beneficiosamente el
anfitrión, mejorando las propiedades de la microflora nativa del organismo”. Esto implica que
el término “probiótico” está restringido a productos que (a) contienen microorganismos vivos,
por ejemplo, células liofilizadas o en un producto fermentado; (b) mejora el nivel de salud del
hombre o animal y ejerce efectos en el tracto gastrointestinal (por ejemplo, incluidos en
alimentos o administrados en cápsulas), en el tracto respiratorio superior (si son aplicados en
aerosol) o en el tracto urogenital (por aplicación local). [2]
La mayoría de las bacterias probióticas pertenecen a dos géneros: Lactobacillus
(Figura 1) y Bifidobacterium (Figura 2). Debe ser aplicado un criterio riguroso de selección
para la identificación de cepas con propiedades probióticas. Esencialemente, estos criterios
sugieren que la selección de cepas debe ser segura, viable y metabólicamente activa con el
tracto gastrointestinal, en relación a ejercer un impacto beneficioso en el anfitrión.

Figura 1: Lactobacillus

6
 Figura 2: Bifidobacterium

3.2.1 Bacterias Ácido Lácticas

Las bacterias ácido lácticas (lactic acid bacteria, LAB) han sido comúnmente utilizadas
como probióticos en varios alimentos fermentados desde tiempos históricos. LAB con
actividad probiótica se encuentran generalmente en la flora entérica, jugando un rol
beneficioso en el ecosistema del tracto gastrointestinal humano y animal, en general. El
espectro de su actividad probiótica puede ser dividido en efectos nutricionales, fisiológicos y
antimicrobianos (tabla 2).
Muchas investigaciones han demostrado que varias especies de LAB ejercen una
acción antagónica sobre muchos microorganismos patógenos. LAB son capaces de prevenir la
adherencia, el establecimiento, replicación y la acción patogénica de enteropatógenos
específicos [3]. Estas propiedades antagónicas pueden manifestarse por (a) disminución del pH
luminal debido a la producción de ácidos grasos volátiles de cadena corta; (b) haciendo que
los nutrientes específicos sean inasequibles para los patógenos; (c) disminuyendo el potencial
redox del ambiente luminal; (d) produciendo peróxido de hidrógeno bajo condiciones
anaeróbicas; y (e) produciendo compuestos inhibidores como los bacteriocidas.

7
Tabla 2. Efectos benéficos nutricionales y para la salud de alimentos funcionales preparados con bacterias
probióticas [4]
.
Efectos benéficos
Mejora la digestibilidad
Mejora el valor nutricional
Mejora la utilización de lactosa
Acción antagonista hacia enteropatógenos
Colonización del intestino
Efecto anticarcinogénico
Acción hipocolesterolémica
Inmunomodulación
Posibles causas y mecanismos
Hidrólisis parcial de proteínas, grasas y
carbohidratos.
Alto nivel de vitamina B y aminoácidos libres,
como lisina, metionina y triptofano.
Reduce la lactosa en el producto y aumenta la
disponibilidad adicional de la lactasa.
Desórdenes, como la diarrea, colitis mucosa,
diverticulitis, etc., son controladas por la
acidificación, inhibición microbiana y prevención
de la adhesión de patógenos o de la activación de
los mismos.
Sobre vivencia en ácido gástrico, resistencia a
lisozima y a la baja tensión superficial del
intestino, adherencia a la mucosa intestinal,
multiplicación en el tracto intestinal,
inmunomodulación.
Conversión del potencial pre-carcinógeno en
componentes menos dañinos. Acción inhibitoria
hacia algunos tipos de cáncer, en particular
cánceres del tracto gastrointestinal por degradación
de pre-carcinógenos, reducción de las enzimas
promotoras de carcinógenos y estimulación del
sistema inmune.
Producción de inhibidores de síntesis de colesterol.
Uso del colesterol por asimilación y precipitación
de sales de bilis desconjugadas.
Realce de formación de macrófagos, estimulación
de producción de células supresoras y -
interferonas.
8
 3.2.1.1 Lactobacillus

Son bacilos microaerófilos, gram positivos4 y catalasa negativos, estos organismos

forman ácido láctico como producto principal de la fermentación de los azúcares.
Dentro del género Lactobacillus se existen tres grupos metabólicos que se diferencian
principalmente por la presencia o ausencia de enzimas claves para la fermentación de
azúcares, estos grupos son:

 Homofermentativos Obligados: Producen ácido láctico como principal producto del

metabolismo de glucosa (85% o más). Este grupo está integrado por Lactobacillus
caucasicus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus lactis, Lactobacillus acidophilus y
Lactobacillus delbrueckü.
 Heterofermentativos Facultativos: Producen alrededor del 50% de ácido láctico a
partir de glucosa y concentraciones significativas de CO2, ácido acético y etanol.
 Heterofermentativos Obligados: Producen cantidades equimoleculares de ácido
láctico, CO2 y acetato. Crecen más lentamente en la mayoría de los carbohidratos.

Los Lactobacilos, son microaerófilos o anaerobios, pero después de cultivos continuos,

algunas cepas pueden desarrollarse en presencia de aire. Sus necesidades nutritivas son
complejas, y la mayor parte de las cepas no puede cultivarse en los medios nutritivos
ordinarios, a menos que se enriquezcan con glucosa y suero.

4
La Tinción de Gram es empleada en microbiología para la visualización en microscopio de bacterias, y también
se emplea como primer paso en la diferenciación bacteriana, considerándose gram positivas a las bacterias que
se visualizan color violeta y gram negativas a las que se visualizan en color rosa.

9
3.3 Métodos de preservación de cultivos bacterianos

Para producir un cultivo bacteriano estable, existen ciertos métodos disponibles. En

primer lugar, se debe diferenciar entre los métodos de laboratorio típicos y los métodos que
pueden ser aplicados a una producción a mayor escala. Métodos típicos de laboratorio
incluyen: (1) inmersión del cultivo bacteriano en aceite (por ejemplo, aceite de parafina); (2)
secado con aire de cultivos en gelatinas o agar; (3) adsorción-desorción en papel filtro o en
pliegos presecados de peptona o dextrano, porcelana o sílica gel, entre otros. Con estos
métodos, muchas bacterias pueden ser preservadas exitosamente por meses e incluso años.
Para uso industrial, se requieren grandes cantidades de bacterias activas, particularmente
en inoculación directa en procesos líquidos. Los métodos de laboratorio no son aplicables,
dado su complejidad, a la necesidad de aditivos, y a la baja tasa de sobrevivencia en mucha de
sus aplicaciones. Entre los métodos industriales se incluyen: (1) subcultivo; (2)
almacenamiento del cultivo en forma congelada; (3) almacenamiento del cultivo en forma
seca. Este último método será el centro del estudio presentado en este informe, dado que es
uno de los métodos que más se utilizan en la industria, dado los bajos costos que implica.

3.3.1 Microencapsulación

Los ingredientes son adicionados a los alimentos por muchas razones. Hoy en día,
existe la tendencia a reducir los niveles permitidos de muchos aditivos alimenticios y, en lo
posible, reemplazar aquellos aditivos derivados de sustancias químicas por aditivos de origen
natural. Sin embargo, muchos de los ingredientes naturales poseen un potencial de acción
menor, o una aplicación más restringida que sus contrapartes sintéticas. Una estrategia
novedosa para aumentar el rango de efectividad en la aplicación de muchos de estos
ingredientes naturales es utilizarlos en sistemas microencapsulados. Debido a la gran variedad
de ingredientes encapsulados, muchos productos alimenticios que antes eran técnicamente
irrealizables ahora son posibles de elaborar.
El propósito general de la microencapsulación es hacer que los líquidos se comporten
como sólidos; separar materiales reactivos; reducir material tóxico; proveer de protección

10
ambiental a los componentes; alterar las propiedades superficiales de los materiales; liberación
controlada de substancias; reducir la inflamabilidad y volatilidad de líquidos; y disfrazar el
sabor de compuestos amargos [5].

3.3.1.1 Materiales de microencapsulación

El material base de las microcápsulas puede estar en cualquier estado físico: líquido,
sólido, gas, e incluso en dispersiones en líquidos o emulsiones complejas. El primer paso en la
encapsulación de los ingredientes alimenticios es la selección de la capa de material
conveniente, referido a la matriz de encapsulación [5].

Un material conveniente tiene que poseer las siguientes propiedades:

1. Buenas propiedades reológicas a altas concentraciones y facilidad de manipulación durante

el proceso de encapsulación.
2. Capacidad de dispersar o emulsificar el material activo y estabilizar la emulsión producida.
3. Cualidad de no ser reactivo con el material a ser encapsulado durante el proceso y también
durante el almacenaje prolongado.
4. Capacidad de sellar y soportar el material activo dentro de su estructura durante el proceso
o en el almacenaje.
5. Capacidad de proveer protección máxima del material activo contra condiciones
ambientales (por ejemplo: calor, humedad, luminosidad, etc.).
6. Solubilidad aceptable en solventes utilizados en la industria de alimentos, por ejemplo,
agua, etanol, etc.
7. Químicamente no reactivo con el material activo.

En la práctica, muchos compuestos se utilizan en forma combinada, como por ejemplo,

oxígeno, antioxidantes, agentes quelantes, surfactantes, etc. Algunos tipos de estos materiales
se presentan en la Tabla 3:

11
Tabla 3: Materiales de encapsulación de ingredientes alimenticios [6].

Carbohidratos Maltodextrinas, dextranos, sucrosa,

cyclodextrinas.
Celulosas Carboxy metilcelulosa, metilcelulosa,
etilcelulosa, nitrocelulosa, acetilcelulosa.
Gomas Goma acacia, agar, alginato de sodio,
carragenina.
Lípidos Aceites, grasas, parafinas, ácido triesteárico,
diglicéridos, monoglicéridos, aceites
pesados.
Proteínas Gluten, caseína, gelatina, hemoglobina,
péptidos.

3.3.1.2 Técnicas de microencapsulación

Una variedad de técnicas son utilizadas tanto en la industria alimenticia como en la

farmacéutica. Muchos investigadores clasifican los procesos de encapsulación en dos: los
procesos de naturaleza química y los de naturaleza física, pero Thies(1996) [8] prefirió
clasificarlos como procesos de tipo A y de tipo B, dado que muchos de los procesos
denominados mecánicos actualmente involucran también a procesos químicos, y viceversa. La
siguiente tabla muestra ejemplos de ambos tipos de procesos. Generalmente, los procesos de
encapsulación del tipo B son los métodos más comunes de encapsulación de ingredientes
alimenticios y aditivos.

Tabla 4: Lista de procesos de encapsulación tipo A y B [7].

12
 Tipo A (procesos químicos) Tipo B (procesos físicos)
Coacervación compleja Secado por atomización
Incompatibilidad polimérica Lecho fluidizado
Polimerización interfacial en medio líquido Deposición electroestática
Polimerización in situ Extrusión centrífuga
Gelación térmica e iónica en medio líquido Disco rotatorio o separación por suspensión
rotacional

3.4 Secado convectivo de bacterias

Muchos métodos de secado pueden ser utilizados para la preservación de

microorganismos. Dentro de las técnicas de secado convectivo, existen dos de particular
interés en el presente estudio:
-
Secado por atomización
-
Secado en lecho fluidizado

3.4.1 Consideraciones generales

Por muchos investigadores, se supone que la inactivación durante el secado convectivo

puede ser causado por dos mecanismos: inactivación térmica e inactivación por
deshidratación.
A altas temperaturas de secado, la inactivación térmica puede jugar un rol substancial.
Es importante al realizar el secado que, en general, la resistencia al calor de la célula
bacteriana aumente con la disminución de la concentración de agua.
En la primera etapa del proceso de secado, la superficie de la partícula contiene
humedad (velocidad de secado constante) y mientras se evapora el agua, la temperatura no
excede la temperatura de bulbo húmedo. La inactivación térmica está limitada por este estado,
debido a la alta velocidad de evaporación y por la temperatura de bulbo húmedo que protegerá
las células de las altas temperaturas del aire en el secador.
En la siguiente etapa, la superficie de la partícula comenzará a secarse (período de
velocidad decreciente) y la temperatura aumenta a un máximo hasta alcanzar la temperatura
del secador. En esta etapa, el enfriamiento evaporativo no es significativo y la inactivación

13
térmica se incrementará, pero debido a la baja concentración del agua, las células tendrán una
alta resistencia al calor.
Debido a la alta conductividad calórica, se puede suponer que la temperatura medida
dentro de la partícula puede ser despreciada. Durante el proceso de secado, sin embargo, el
interior de la partícula puede estar húmedo, mientras que la superficie está totalmente seca.
Debido a esto, las células en el interior de la partícula tienen una baja resistencia al calor que
las células en la superficie y esto incidirá en la velocidad de inactivación térmica. Más aún,
debido a la inactivación por deshidratación es posible que las células en el interior de la
partícula estén realmente inactivadas por la propia deshidratación, mientras que las células en
el interior de la partícula no son afectadas [8].

3.4.1.1 Mecanismos de inactivación térmica

Los mecanismos de inactivación térmica de microorganismos aún no han sido

completamente entendidos. Generalmente se supone que existen cuatro sitios primarios de
daño térmico que pueden causar lesiones o muerte celular. Estos sitios son: (1) DNA; (2) RNA
(incluyendo ribosomas-rRNA-); (3) proteínas (enzimas), y (4) la membrana celular.
Se ha determinado que los microorganismos aumentan su resistencia al calor con la
disminución de la concentración de agua. Una explicación simple a esto es que el agua está
involucrada como un reactante en la inactivación debido a la temperatura. Bajas
concentraciones de agua producen una disminución de velocidad de inactivación térmica. A
concentraciones intermedias de agua, sin embargo, aumentan la velocidad de inactivación.
Esto se debe, probablemente, a la transición entre los diferentes mecanismos de reacción
involucrados en los procesos de inactivación [8].

3.4.1.2 Mecanismos de inactivación por deshidratación

Los mecanismos de deshidratación han sido resumidos en muchos artículos sobre

preservación de bacterias por liofilización. Así como en la inactivación térmica, la inactivación

14
por deshidratación puede afectar un número importantes de componentes celulares, que se
resumen a continuación:

-
DNA/RNA: cadenas de DNA y RNA que se interrumpen durante el secado han sido
informadas por Wagmann, Heckly, Webb y Ashwood-Smith.[8]

-
Proteínas: Scott[8] reporta reacciones de grupos amino en proteínas celulares y
componentes carbonilos en la célula durante el secado y almacenamiento. Otros
autores han concluido que la desaminación y descarboxilación son importantes
mecanismos de inactivación. Es probable que estas reacciones sean resultado de
severas desnaturalizaciones proteicas debido a la deshidratación.

-
Membrana citoplasmática: el daño a este componente celular ha sido considerado
como un mecanismos debido a la deshidratación. Muchas investigaciones realizadas al
respecto han reportado la salida de componentes celulares (cationes, nucleótidos,
enzimas, proteínas, aminoácidos, etc.) fuera de la célula durante la rehidratación, que
se explica por el daño sufrido por la membrana celular en el proceso de secado.

-
Otros mecanismos: Rogers[8] sugiere que el primer causante de la inactivación de las
bacterias durante el secado es el aumento de la concentración de ácidos y sólidos
durante el proceso. Obviamente, las altas concentraciones de ácidos serán dañinas,
mientras que las altas concentraciones de otros componentes aumentarán la presión
osmótica en el medio, lo que puede conducir a la plasmólisis de las células.

En conclusión, se han establecido que existen dos mecanismos de inactivación: térmica

y por deshidratación, que han sido estudiadas por muchos investigadores, pero no del todo
comprendidas. Muchos componentes celulares son influenciados por las altas temperaturas y
las bajas concentraciones de agua. Después del secado, el daño de la membrana celular es
ciertamente el tipo de factor preponderante en la inactivación por deshidratación. Sin embargo,
los factores que influyen en la inactivación térmica aún son inciertos [8].

15
3.4.2 Secado por atomización (spray)

En vista de la inactivación térmica, la mayor ventaja mencionada es la rapidez de

secado, debido a la alta superficie específica. Esto conduce a un tiempo de residencia corto
para las células bacterianas en este equipo (como el que se muestra en la Fig. 3), lo que limita
la inactivación debida a la temperatura.
Debido al enfriamiento evaporativo en la primera etapa del proceso de secado, la
sobrevivencia de las células bacterianas durante el secado por atomización está fuertemente
correlacionada con la temperatura de salida y no directamente con la temperatura de entrada al
secador. Las altas tasas de sobrevivencia se encuentran a bajas temperaturas de salida.
Obviamente, una baja temperatura de salida resultará en una menor inactivación térmica, por
la posibilidad también de una alta concentración de agua residual, que influye positivamente
en la sobrevivencia. La sustancial inactivación térmica puede ser evitada modificando la razón
másica de aire seco/líquido alimentado, para que a la salida del secador el aire se enfríe por
evaporación de agua.
El historial de humedad-temperatura de un sistema está también influenciado
significativamente por el tamaño de partícula, el que depende de tres propiedades físicas de la
célula en suspensión: viscosidad, densidad y tensión superficial. La viscosidad es el único
parámetro que puede ser modificado considerablemente por un cambio en la concentración
celular. Una alta concentración de sólidos en suspensión dará como resultado partículas de
mayor tamaño. Con el aumento del tamaño de partícula, el tiempo de secado aumentará. Esto
puede disminuir la tasa de sobrevivencia, porque el tiempo de contacto de las partículas con el
aire caliente aumentará [8].

16
 Figura 3: Secador por atomización.

3.4.3 Lecho fluidizado

En un secador de este tipo, como el de la Fig. 4, el tiempo de secado puede ser mucho
mayor que en un secador por atomización (por ejemplo, 60 minutos versus 30 segundos). El
tiempo de residencia puede ser cambiado libremente, lo que posibilita la utilización de flujos
de aire de entrada al equipo a temperaturas relativamente bajas, que ayudará a minimizar la
inactivación térmica de los microorganismos sometidos a este proceso.
Entre las desventajas del proceso de lechos fluidizados se encuentra el problema del
tamaño del material granulado. Esto puede influenciar la sobrevivencia de las bacterias
después del secado. Por ejemplo, partículas pegajosas pueden aglomerarse fácilmente, lo que
resulta en un aumento del tamaño de partícula, lechos no homogéneos y disminución de las
velocidades de secado. Este problema puede ser evitado ajustando la concentración de agua
inicial o también utilizando una malla vibrante bajo el lecho, de forma tal de prevenir la
aglomeración, e incluso utilizar agentes fluidizantes.
Otro inconveniente es que sólo el material granulable puede ser secado. Las bacterias no
pueden obtenerse en forma granulada (por lo general se obtienen biomasas de consistencia
gelatinosa), y debido a eso, se deben utilizar materiales de soporte, como por ejemplo, mezclar
la biomasa con almidón o salvado de trigo, formando una pasta que puede ser convertida en
partículas.

17
 Una ventaja de los procesos de secado en lechos fluidizados, en comparación a los
procesos de secado por atomización es que pueden ser modelados fácilmente, dado que las
medidas y los cálculos obtenidos en un laboratorio o planta piloto pueden ser trasladados a un
proceso de escala industrial [8].

Figura 4: Esquema típico de un secador de lecho fluidizado industrial

3.4.4 Factores que influyen en la sobre vivencia de bacterias al secado convectivo

3.4.4.1 Especies bacterianas

Las especies de microorganismos estudiados en procesos de secado difieren bastante en

cuanto a su sensitividad al proceso. Entre las especies de bacterias, se puede distinguir
claramente entre células sensitivas y menos sensitivas, mediante la diferenciación entre
bacterias Gram negativas y Gram positivas. Cocos que son Gram positivos (Streptococcus
pyogenes, Staphylococcus aureus) han demostrado que son más resistentes a la liofilización.
Desafortunadamente, en la producción de cultivos bacterianos, las especies no pueden ser
subsituidas fácilmente, debido, entre otros factores, a las propiedades probióticas que
poseen[8].

18
 3.4.4.2 Condiciones de crecimiento

La fase de crecimiento de las células bacterianas es muy importante para la

sobrevivencia después de una etapa de secado. Probablemente, la composición de la
membrana celular sufre cambios ante diferentes condiciones de crecimiento (estrés térmico,
osmótico, cambios de pH, osmolaridad, etc.), que protege a la célula antes las condiciones
extremas de temperatura y concentración de agua, que acontece en un proceso de secado[8].

3.4.4.3 Aditivos protectores

Una de las razones por lo que los aditivos protectores han sido estudiados tan
extensamentes es que el diseño experimental es simple y los resultados que se obtienen son
prometedores. Entre los aditivos protectores que se ha reportado en literatura en secado de
bacterias, se encuentran: azúcares, polialcoholes, ácido carboxílico, glicerol, leche y permeado
de suero, medios de cultivos, polímeros (dextranos), proteínas, aminoácido y sales[8].
[9]
Orndoff y MacKenzie sugieren que no existe una interacción específica entre estos
aditivos y la célula bacteriana. Ellos postulan que la matriz amorfa formada por el aditivo es la
responsable de la dispersión de componentes dañinos (como los ácidos) que escapan fuera de
la célula. Otras hipótesis sobre el efecto protector de estos aditivos está basado en la
interacción específica entre el aditivo con los grupos hidroxílicos de la membrana celular y de
las proteínas. Algunas interacciones (formación de puentes hidrógeno) estabilizan estas
estructuras por el reemplazo del rol de “puente” del agua.

3.4.4.4 Concentración celular y pH

Una alta concentración celular en suspensión al momento de liofilizar exhibe altas

tasas de sobrevivencia.[10] Una explicación posible para este efecto puede encontrarse en la
expulsión de componentes intracelulares desde células dañadas que pueden proteger a otras
células. Es probable que estos componentes actúen como antioxidantes, produciendo un efecto
similar a la adición de agentes protectores. Otro efecto probable que acontece a altas

19
concentraciones celulares es que las células muertas reducen el área interfacial entre las
células viables (vivas) y el medio externo, cumpliendo, de esta forma, el papel de escudo
protector contra las agresiones ambientales.
Con respecto al efecto del pH, diversos estudios han encontrado valores óptimos de
pH, que difieren dependiendo del proceso de secado, ya sea liofilización, secado por
atomización, etc. Por ejemplo, se ha reportado una alta sobrevivencia de bacterias ácido
lácticas cuando el pH fue ajustado desde 4.5 a 6.0 – 6.5 antes de la liofilización. [8]

3.4.4.5 Agente secante y velocidad de secado.

La composición del gas de secado puede influenciar en la sobrevivencia de las

bacterias ácido lácticas. Por ejemplo, cuando la oxidación de componentes celulares juega un
rol importante en el proceso de secado, suele preferirse el nitrógeno como gas de secado. Dada
las grandes cantidades de gas que se utilizan para secar bacterias, el reemplazo de aire por otro
tipo de gas (como el mismo nitrógeno) suele resultar bastante costoso, y este tipo de estudios
se ha restringido a experimentos de laboratorio, aun convirtiendo el proceso en un sistemas
cerrado, donde el gas de secado humidificado puede re-utilizarse después de la condensación
del agua, lo que podría hacer el proceso más factible, aunque generalmente se prefiere la
adición de sustancias antioxidantes antes de secar que un gas distinto del aire.
Con respecto a la velocidad de secado, existe poca evidencia experimental al respecto.
Se puede esperar que la bacteria que está expuesta a condiciones adversas (altas temperaturas)
o reacciones perjudiciales (oxidación, producción de ácidos), le sea favorable una alta
velocidad de secado, que acorte el proceso de secado, y en conclusión, mientras menos esté
expuesta el cultivo bacteriano a un ambiente desfavorable, mayor será la tasa de
sobrevivencia, por lo que se debe encontrar el equilibrio entre velocidad y duración del
proceso de secado [8].

20
 3.4.4.6 Rehidratación

Las condiciones de rehidratación, como la composición, osmolaridad, temperatura y

pH del medio de rehidratación y la velocidad de la misma, pueden influenciar
significativamente la sobrevivenvia de las bacterias sometidas a procesos de secado, a tal
punto, que en muchas investigaciones realizadas al respecto han concluido que es uno de los
pasos más importantes en la conservación de cepas bacterianas.
El daño en la célula debido al secado no necesariamente conduce a la muerte. Algunas
bacterias pueden morir, pero otras sufren lesiones reversibles y pueden recuperarse
completamente si se les provee un medio conveniente de rehidratación. Por ejemplo, se ha
encontrado que la adición de Mg2+ al medio de rehidratación disminuye la expulsión de
componentes celulares desde L. bulgaricus liofilizados [8].
La importancia de la temperatura del medio también ha sido investigado por muchos
autores. Para las bacterias ácido lácticas citadas en el párrafo anterior, se encontró que la
temperatura óptima de rehidratación está entre los 20- 25ºC. En el mismo estudio se encontró
que la expulsión de componentes intracelulares desde las bacterias liofilizadas disminuye con
el aumento de la temperatura de rehidratación (4-40ºC), especialmente sobre los 20ºC.
Finalmente, estudios cuantitativos con respecto a la velocidad de rehidratación no han
sido reportados, pero se supone que una rehidratación lenta es beneficiosa para las células
secas[11]. Generalmente, la rehidratación de las bacterias en aire húmedo (vapor de
rehidratación), comparado con la simple adición de agua, aumente la sobrevivencia de muchas
especies de bacterias.

21
3.4.5 Estabilidad durante el almacenamiento

No hay duda que la estabilidad del almacenamiento aumenta con el decrecimiento de la

temperatura. El almacenamiento de cultivos bacterianos sobre los 10ºC por muchos meses sin
una pérdida significativa de actividad parece, hasta el momento, imposible.
Con respecto a la concentración de agua que deben contener las células al ser
almacenadas, los estudios reportan que la concentración máxima está en el rango de 0.01 –
0.03 kg kg-1 para bacterias liofilizadas, y en el rango de 0.04 – 0.09 kg kg -1 para levaduras
también liofilizadas. Sin embargo, concentraciones extremadamente bajas de agua producen
bajas tasas de sobrevivencias después del secado.
También es perjudicial la presencia de oxígeno en la atmósfera de almacenamiento.
Muchos autores han investigado este factor, encontrando que en atmósferas ricas en nitrógeno
o en vacío se obtienen resultados superiores que el almacenamiento en aire. La pérdida de
viabilidad en bacterias almacenadas en presencia de oxígeno está relacionada con la formación
de radicales, en reacciones como la oxidación de ácidos grasos.
De lo anterior, el tipo de material de empaque cobra gran importancia, dado que debe ser
impermeable tanto a la humedad, al oxígeno presente en la atmósfera de almacenamiento, y a
la luz. Es aconsejable el uso de polietileno con una capa de aluminio, dado que el polietileno
“solo” es permeable a la humedad, además que la capa de aluminio facilita el almacenamiento
bajo condiciones de oscuridad.
Los aditivos juegan un rol importante en la etapa de almacenamiento. Los antioxidantes
pueden reducir le efecto perjudicial del oxígeno, así como la trehalosa y otros azúcares, que
pueden también limitar la producción de radicales[8].

22
3.5 Operaciones de secado

[12]
El término secado, según Treybal , se aplica a la eliminación de la humedad en una
sustancia. El análisis se limitará principalmente a la eliminación de humedad en sólidos
(alimentos) por evaporación con una corriente gaseosa. En la práctica, la humedad es con tanta
frecuencia agua, y el gas, aire.
Las operaciones de secado pueden clasificarse ampliamente según sean por lotes o
continuas. Estos términos pueden aplicarse específicamente desde el punto de vista de la
sustancia que está secando. Así, la operación conocida como secado por lotes, generalmente es
un proceso de semilotes, en donde una cierta cantidad de sustancia que se va a secar se expone
a una corriente de aire que fluye continuamente, en la cual se evapora la humedad. En las
operaciones continuas, tanto la sustancia que se va a secar, como el gas, pasan continuamente
a través del equipo.
Para términos de este estudio, interesa conocer los principios del secado por lotes, que se
considera una técnica costosa, y en consecuencia, su uso se limita a operaciones a pequeña
escala, en plantas piloto y en trabajos de investigación, y para secar materiales valiosos cuyo
costo total será poco alterado por el costo agregado en la operación de secado.

3.5.1 Secadores a vacío

Dentro de los secadores por lotes se encuentran los secadores indirectos, cuyo principio
es operar a vacío (Fig. 5). Aquí no se pasa ni recircula aire a través de los secadores. El calor
se conduce hasta el sólido a través de resistencias eléctricas. Después de cargar y sellar, el aire
se evacúa desde el secador mediante una bomba de vacío mecánica o un eyector de vapor;
luego se continúa la disminución de la humedad. Los vapores generalmente pasan hasta un
condensador, en donde licuan y se recolectan; sólo el gas no condensable se saca de la bomba.
Los secadores de esta categoría son caros de construir y de operar. En consecuencia, se
utilizan sólo para materiales valiosos que deben secarse a bajas temperaturas, o en ausencia de
aire para evitar descomposición, como en ciertos productos farmacéuticos[12].

23
 Figura 5: Secador rotatorio a vacío

3.6 Teoría y mecanismo del secado

3.6.1 Curva de rapidez de secado

A partir de los datos obtenidos durante las pruebas de secado (humedad de la muestra a
través del tiempo, peso seco de la muestra, condiciones de entrada del aire y de salida –
velocidad, temperatura, humedad-), se puede graficar el contenido de humedad en función del
tiempo (Fig. 6), que es de utilidad para determinar el tiempo necesario para secar grandes lotes
en las mismas condiciones de secado, o también si los datos son convertidos a rapidez (o
fluxs) de secado, expresadas como N masa/tiempo(área) y se grafican contra el contenido de
humedad[12] (Fig. 7).

24
 X= kg humedad/kg sólido seco
A'

A B

D
X*
E

Tiempo de deshidratación
Figura 6: Curva de secado en condiciones constantes

Figura 7: Curva típica de rapidez de secado, condiciones constantes.

25
 Generalmente hay dos partes principales en la curva de rapidez: un período de rapidez
constante y uno de rapidez decreciente.
Al principio de la operación de secado, la superficie sólida y la líquida están
generalmente más frías que la temperatura superficial final; la rapidez de evaporación aumenta
cuando la temperatura superficial aumenta hasta su valor final durante el período AB (Fig. 7)
sobre estar curvas. En forma alternativa, la temperatura en el equilibrio puede ser menor que el
valor inicial, lo cual dará lugar a una curva A’B mientras ocurre el ajuste inicial.
Cuando el contenido de humedad promedio del sólido alcanza un valor Xc el contenido
crítico de humedad, la película superficial de humedad se reduce tanto por evaporación que el
secado posterior produce puntos secos que aparecen sobre la superficie; éstos ocupan cada vez
porciones más grandes de la superficie expuesta al continuar el secado. Esto da lugar a la
primera parte del período decreciente de la rapidez, el período de secado superficial no
saturado, desde el punto C hasta el D. Finalmente, la película superficial original del líquido se
habrá evaporado completamente a un contenido de humedad promedio del sólido que
corresponde al punto D.
Al continuar el secado, la rapidez con la cual se puede mover la humedad a través del
sólido es el paso controlante, a causa de los gradientes de concentración que existen entre las
partes más profundas y la superficie. Como la concentración de humedad generalmente
decrece mediante el secado, la rapidez de movimiento interno de la humedad decrece. En
algunos casos, la evaporación puede tener lugar debajo de la superficie del sólido en un plano
o en una zona que se va hundiendo más profundamente en el sólido al irse secando. En
cualquier caso, la rapidez de secado decae aún más rápidamente que antes, como de D a E. En
el punto E, el contenido de humedad del sólido ha caído hasta el valor en el equilibrio X* para
la humedad del aire predominante y el secado se detiene[12].

26
3.6.2 Velocidad de deshidratación

De acuerdo a Felows[13], la velocidad de deshidratación depende de las características del

deshidratador (temperatura de bulbo seco, humedad relativa, velocidad del aire, y coeficiente
de transferencia de calor superficial) y de las características del producto a secar (contenido de
agua, relación volumen/superficie, temperatura superficial, y velocidad a la que el producto
pierde el agua). El tamaño del producto influye de forma importante sobre la velocidad de
deshidratación, tanto en el período de velocidad de deshidratación creciente como de la
velocidad decreciente. En el período de velocidad constante, las partículas de menor tamaño se
evaporan antes (porque su superficie es relativamente mayor) y en el de velocidad decreciente,
porque la distancia que el vapor de agua tiene al atravesar, es menor. Otros factores que
influyen en la velocidad de deshidratación son los siguientes:

(i) El contenido de grasa del producto (dado que los productos grasos se deshidratan
generalmente más lentamente, debido a que la grasa dificulta la salida del agua).
(ii) La cantidad de producto que contiene el deshidratador con respecto a su capacidad
total (la deshidratación se produce a mayor velocidad cuando menos carga se
alimenta al deshidratador).

La velocidad de transferencia de calor se calcula mediante un balance de energía que

conduce a la siguiente expresión:
Q  hc  A   a   s  (1)

De la misma forma, se obtiene para la velocidad de transferencia de masa la siguiente

expresión:
 mc  K g  A   Ys  Ya  (2)

Durante el período de velocidad constate, se produce un equilibrio entre la velocidad de

transferencia de calor al producto, y la de transferencia de masa (representada por el flujo de
vapor que escapa de éste). La siguiente fórmula expresa la relación entre ambas:

27
 hc  A
 mc    a   s  (3)


Para un secador de lecho fluidizado se puede estimar el coeficiente de transferencia de

calor por convección a través de la correlación de Gnielinski[23] para partículas cilíndricas:

Nu  f a  Nu Esferas (4)

Nu Esferas  2  2
Nu lam  Nu turb
2
(5)

Donde:
Nu lam  0.664  Re  3 Pr (6)

0.037  Re0.8  Pr
Nu turb  (7)
1  2.443  Re0.1  Pr  1
2
3
 

h  dk
Nu  (8)
k aire

vlibre  d k   aire
Re  (9)
 aire 

 aire
Pr  (10)
 aire  

V  VF
  (11)
V
Por otro lado:
Ap
dk  (12)


Donde A p es el área de una partícula individual.

28
 Para partículas cilíndricas se debe corregir Nu mediante un factor, que depende de la
longitud y diámetro del cilindro. Para efectos de las partículas a estudiar, se supone que la
relación longitud/diámetro no es mayor a 1.2, por lo que el factor de corrección resulta igual a
1.6.
f a  1.6 0.24  l d  1.2 (13)

29
3.7 Cinéticas de reacción de degradación de microorganismos

3.7.1 Principios generales

El cambio de concentración por unidad de tiempo, llamado velocidad de reacción

(dM/dt), depende de la temperatura, del catalizador presente, y de la concentración de
reactantes. Dependiendo del número de átomos o moléculas cuyas concentraciones determinan
la velocidad de reacción, los procesos son clasificados de acuerdo al orden de la reacción.
(i) Reacción de orden cero: es independiente de la concentración (por ejemplo, la
electrólisis).
dM
 = constante (14)
dt
(ii) Reacción de primer orden: la velocidad de la reacción es proporcional a la
concentración. Es también denominada primera reacción monomolecular (por
ejemplo, destrucción de microorganismos, inactivación de enzimas).

dM
  k  M 1 (15)
dt

3.7.2 Efecto del tiempo sobre la velocidad de reacción

La velocidad de reacción está determinada por la etapa más lenta. Sin embargo, ya que
se tiende a minimizar el daño térmico del producto, es suficiente con considerar sólo la
primera etapa de cambios químicos.
La destrucción de microorganismos, por lo general, está bien descrita a través de las
reacciones de primer orden. La siguiente ecuación proviene de la integración de la Ec.16 entre
los límites inferiores y superiores M0 y M, respectivamente.

M dM t
  k   dt (16)
M0 M 0

30
 M 
 ln   k  t (17)
 M0 

M
 e  k t (18)
M0

La ecuación así obtenida muestra que el decrecimiento en la concentración

microorganismos es exponencial. El tiempo necesario para reducir el número de
microorganismos M para una fracción segura es independiente de M0.
Otra forma de expresar la misma ecuación:
k
log(M )    t  log(M 0 )
2.3 (19)

Figura 8: Variación de la concentración de microorganismos en el tiempo

En la Fig. 8, se muestra la variación del número de organismos o el número residual de

organismos, respectivamente, versus el tiempo, y en la Fig. 9, la gráfica del número de

31
microorganismos proyectados sobre una escala logarítmica versus el tiempo. La pendiente de
la línea recta es función de la temperatura, y está dada por la expresión:
k
Pendiente =  (20)
2.3
Las ecuaciones a continuación representan la destrucción de microorganismos a
diferentes temperaturas:

M  k
log    1  t1 a 1 (21)
 M0  2.3

M  k
log    2  t2 a 2 (22)
 M0  2.3

Dividiendo (21) con (22), se obtiene:

t1 k 2
 (23)
t 2 k1
El D-valor (tiempo de reducción decimal) es el tiempo necesario, a una temperatura
dada , para reducir el número de microorganismos a 1/10 del valor original.

Figura 9: Determinación de la constante de velocidad de muerte de los microorganismos en el tiempo.

De la pendiente de la recta de la Fig. 9, se puede obtener:

32
 2.3
D   t 0.1N (24)
k
Valores típicos de D se presentan en la Tabla 5:

Tabla 5: Parámetros de resistencia térmica y osmótica de microorganismos asociados a materias

primas y productos de pesquería.(Microorganisms in Foods, Vol. 1, 1974)
Temperatura
Resistencia
NaCl (%)
Microorganismo Mínima Óptima pH mínimo aw mínimo Térmica
máximo
(D(TºC), min.)
C.botulinum tipo D121(esporas)
10 35 4,0-4,6 0,94 10
proteolótico A, B, F 0,1-0,25
D82,2 0,15-2
(caldo) D80
C.botulinum tipo no
3,3 30 5,0 0,97 3-5 4,5-10,5
proteolótico B, E, F
(producto alta prot.-
grasa)

Vibrio sp. 5-8 37 5,0 D71 0,3

D55
Vibrio Cholerae 5 37 6,0 0,97 <8
0,24
60ºC por 5 min
Vibrio parahaemolyticus 5 37 4,8 0,93 8-10 reducción de 7
log(10)
Vibrio vulnificus 8 37 5,0 0,94 5

Aeromonas sp. 0-4 20-35 4,0 4-5 D55 0,17

60ºC 30min no hay

Plesiomonas sp. 8 37 4,0 4-5
sobrevivencia
D60
Listeria monocytogenes 1 30-37 5,0 0,92 10
1,95-4,48

Salmonella 5 37 4,0 0,94 4-5 D60 0,2-6,5

Shigella 7-10 37 5,5 4-5 60ºC 5 min

D60
0,1
E.coli 5-7 37 4,4 0,95 6
D55
5
D60
Staphylococcus aureus 7 37 4,0 0,83 10-15
0,43-7,9
Staphylococcus aureus
15 40-45 5,0 0,86 10 toxina muy estable
(productor de toxina)

33
3.7.3 Efecto de la temperatura

La constante de velocidad de muerte k se incrementa con el aumento de la temperatura,

es decir, la reacción ocurre más rápido. Esto es mostrado en la Fig. 9 y por la Ec. 24.
Cuando el incremento de la temperatura es de 2-1=10 (ºC):
t k 10
  Q10 (25)
t 10 k

Q10 muestra cuánto más rápida es una reacción si tiene lugar una aumento de
temperatura de 10ºC.
A partir de las leyes de los gases, la expresión cinética de Arrhenius y Van’t Off., y
tomando la energía de activación como Ea, la siguiente ecuación para los efectos de la
temperatura absoluta sobre la constante de velocidad k, puede ser formulada como:

Ee

k  cons tan te  e RT (26)

Cuando la razón de tiempo es 10, y el logaritmo es de base 10, el resultado del

logaritmo es 1. Esto corresponde a una cierta diferencia de temperatura sobre la abscisa, donde
el valor de ésta depende de la pendiente de la línea recta (Fig. 9). Esta diferencia es
usualmente llamada valor z, el que se define como el incremento necesario en la temperatura
para obtener la acción letal, o el mismo efecto (es decir M/M 0 = constante) en un décimo del

tiempo (z =  0.1t ).

34
 Figura 10: Determinación del valor z.

Usando el valor de Q10, la relación dada por éste y el valor z, es la siguiente:

10
z (27)
log(Q10 )

Debido a que el valor z es idéntico con el valor negativo recíproco de la pendiente de la

línea recta de la Fig. 10, z también puede ser expresado por medio de la energía de activación
Ea:

2.3  R  T  T *
z (28)
Ea
Se puede apreciar que el valor z es dependiente de la temperatura. Esta ecuación puede
ser utilizada para obtener la energía de activación conocidos los valores de z y de Q10.
Con estos parámetros, es posible determinar cuán resistente a la temperatura serán las
cepas con las cuales se realizará este estudio, lo que servirá ciertamente para determinar los 4
parámetros de operación del secador que optimice la viabilidad del producto seco.

35
4 MATERIALES Y MÉTODOS

4.1 Materiales

4.1.1 Cultivo bacteriano

La cepa utilizada en este estudio corresponde a LPT32, Lactobacillus plantarum, y

LPT87, correspondiente a Lactobacillus brevis, provenientes del tracto gastrointestinal de la
trucha arcoiris, en la región del Bío-Bío.

Figura 11: Cepario con cepas de truchas, entre ellas LPT32 y LPT87.

4.1.2 Químicos
Tabla 6: Químicos aplicados en los experimentos
Acetato de Sodio Merck Peptona Carne Merck
Ácido Acético Merck Peptona de Caseína Merck
Agar Merck Safranina Merck
Cloruro de Sodio Merck Suero en polvo Merck
D- Glucosa Merck Sulfato de Magnesio Merck
Extracto de Levadura Merck Sulfato de Manganeso Merck
MRS Merck Tween 80
Peróxido de hidrógeno Merck

4.1.3 Medios

36
LAPTg ( para conteo de viabilidad en placas de bacterias acidolácticas)
Peptona caseína 10 g/l
Peptona carne 15 g/l
Extracto Levadura 10 g/l
Glucosa 10 g/l
Tween 80 1 ml/l
Agar 15 ml/l

MRS [de Man, Rogosa y Sharpe, 1960 (para cultivo de lactobalilos)

Peptona 10.0 g
Peptona carne 10.0g
Extracto de levadura 5.0 g
Glucosa 20.0 g
Tween 0.1 mL
KH2PO4 2.0 g
Acetato de Sodio 5.0 g
Citrato de triamonio 2.0 g
Sulfato de Magnesio, hidratado (MgSO4*7H20) 0.2 g
Sulfato de Manganeso, hidratado (MnSO4* 4H20) 0.05 g
Agua destilada 1 lt

Permeado de suero
Permeado 30-50 g/l
Lactasa 0.3-0.45 ml/l
Peptona Caseína 2-10 g/l
Extracto de levadura 2-10 g/l
KH2PO4 1-5 g/l
Acetato de Sodio 1-10 g/l
Tween 80 0.1-2 ml/l
Sulfato de Magnesio 0.01-0.05 g/l
Sulfato de Manganeso 0.2-0.6 g/l

37
4.1.4 Equipos e Intrumentos

 Secador a vacío

Figura 12: Secador rotatorio a vacío.

 Secador de lecho fluidizado

Figura 13: Secador de lecho fluidizado.

 Medidor de pH
pH-metro CG837, Schott-Geräte, Germany

38
 Autoclave

 Medidor de densidad óptica (espectrofotómetro)

 Balanza

 Medidor de humedad
PRECISA Moisture analyser HA 60

 Fermentador

Figura 14: Fermentador de

Vidrio, acoplado con agitador,
utilizado para la realización de
los experimentos

39
4.2 Métodos

4.2.1 Activación del cultivo microbiano.

L.plantarum (cepa LPT325) y brevis (LPT87) fueron activadas en medio MRS e

incubadas por 24 horas a 15ºC. Las células fueron entonces cultivadas en las mismas
condiciones en tres sucesivas transferencias en MRS a 15ºC por 24 horas. Cuando las cepas
están activadas (después de 24 horas del tercer traspaso) estás listas para inocular.

4.2.2 Determinación de la resistencia al estrés térmico

Para análisis de la resistencia térmica de las cepas (tanto de la 32 como de la 87), se

inoculó 50 L de la cepa activada en viales de 30 mL en medio peptona caseína-agua al 1% y
sumergido en un baño termostático a una temperatura dada, que para estos efectos fueron
cuatro: 40ºC, 50ºC, 55ºC y 60ºC. Se tomaron muestras cada 5 minutos, hasta completar los 60
minutos, las que se sembraron en placas de LAPTg, para realizar el conteo de viabilidad a
través del tiempo.

4.2.3 Determinación de la resistencia al estrés osmótico y químico

Se inocularon 15 L de las cepas activadas en viales de 30 mL con MRS como medio.

Para la determinación de la resistencia al estrés osmótico, se prepararon viales de MRS con
0M, 0.5M y 0.1M de NaCl, y para la resistencia al estrés químico viales de 30 mL con MRS a
pH 4.5 (para simular condiciones ácidas en el estómago de la trucha). El cultivo en todos los
medios ya mencionados se hicieron a 15ºC y bajo agitación constante. Se tomaron muestras
cada 6 horas hasta completar 24 horas, y luego cada 12 horas hasta completar 72 horas,
midiendo pH, densidad óptica, y viabilidad, esta última a través de la siembra de 50 L de la
muestra diluida en placas de LAPTg.

5
LPT: Lactobacilo Probiótico de Trucha

40
4.2.4 Crecimiento de la cepa en fermentadores de 3L

Se inocularon 1500 L de la cepa activada en el fermentador de 3L con permeado de

suero hidrolizado. Según la curva de crecimiento para la cepa escogida (cepa 32 u 87), se deja
crecer de 48 a 50 horas, a fin de obtener la cantidad de biomasa requerida para el estudio.

4.2.5 Tratamiento térmico del alimento para truchas

Para tratar térmicamente 1 Kg de alimento para truchas proveniente de la Empresa

Frionatur, se mezcla con 35 g de almidón de maíz y 45 mL de agua destilada estéril y se carga
en el balón de vidrio previamente esterilizado (Fig. 15). Se instala el sistema en un baño
termostático a 65ºC, y bajo agitación permanente, se trata por 45 minutos y se deja enfriar el
alimento libre de flora basal.

Figura 15: Sistema de pasteurización. 1: Baño termoestático; 2: Balón de vidrio con alimento en su interior; 3:
Paleta de homogenización; 4: Boca de alimentación y descarga.

41
4.2.6 Adición de biomasa al alimento para truchas

La biomasa generada en el fermentador de 3L se centrifuga para eliminar el

sobrenadante, bajo condiciones de esterilidad. La biomasa así obtenida se resuspende en una
solución de mantención. Esto se mezcla con el alimento tratado térmicamente, y se
homogeniza con el equipo de agitación diseñado para tal efecto. Una vez realizado lo anterior,
se elaboran los pellets, mediante un molinillo esterilizado (Fig. 16). Al producto así formado,
se le determina humedad, y viabilidad antes de proceder con la etapa de secado.

Figura 16: Elaboración de alimento con biomasa probiótica en molinillo esterilizado.

42
4.2.7 Operaciones de secado

4.2.7.1 Secado en lecho fluidizado

El secador de lecho fluidizado instalado en el Departamento de Ingeniería Química, y

es operado de acuerdo al siguiente procedimiento, según lo señalado por Melo [14]:

4.2.7.1.1 Encendido y apagado

1. Energizar el sistema, levantando el interruptor de 380 V que se encuentra en la caja de

poder, sin olvidar activar el sistema de seguridad del soplador.
2. Regular la abertura de la válvula de entrada, de acuerdo al flujo final que se desea
obtener.
3. Fijar los parámetros del controlador de temperatura, de acuerdo a las características de
secado y por lo tanto, el número de resistencias que se tendrán operativas.
4. Encender el soplador, esperar que el flujo de aire se estabilice, y luego encender los
tubos UV de la caja de esterilización, esto para evitar que los tubos se quemen.
5. Encender las resistencias con los switch del panel de control rotulados como 1, 2 y 3,
los que encienden las tres resistencias independientemente. La cantidad de resistencias
dependerá de la temperatura que se quiera alcanzar en el equipo.
6. Limpiar el secador de vidrio por el interior con alcohol para eliminar restos del
producto secado anteriormente, además de la suciedad que arrastra el esterilizador.
Para realizar esta limpieza, primero se debe soltar el seguro superior e inferior del
secador, sacar la rejilla de la base y luego volver a ensamblar.
7. Fijar el set point de temperatura del controlador, y ubicar el sensor a la entrada del
lecho para asegurar que el secado ocurra a la temperatura establecida.
8. Mantener el sistema en estas condiciones por al menos 30 minutos antes de agregar el
producto a secar, para asegurar que el sistema se encuentre por completo estéril.

43
 9. Una vez que se concluye el secado, se debe fijar el set point de las resistencias a 20ºC,
para luego apagar las resistencias con los tubos UV, y por último, apagar el soplador
para asegurar que las resistencias hayan alcanzado la temperatura fijada.
10. Finalmente, bajar el interruptor de 380 V.

4.2.7.1.2 Carga del sistema

El procedimiento de carga del producto se debe seguir en forma rigurosa, para evitar
contaminaciones debido a la manipulación del material, por lo tanto:

1. Una vez que el sistema haya funcionado media hora bajo las condiciones establecidas,
se suelta el seguro superior para facilitar la posterior carga.
2. Encender los mecheros ubicados al costado del secador, para mantener estéril el
ambiente.
3. Abrir completamente la válvula de desvío ubicada antes del secador, para disminuir el
flujo de aire que ingresa al secador, y cerrar la válvula de entrada al mismo, a fin de
asegurar que el flujo de aire impida la carga del producto.
4. Abrir el sistema por la parte superior y cargar el producto. En este paso es importante
flamear constantemente el área de carga para mantener la esterilidad. Una vez
terminada la carga, cerrar el sistema, y asegurarlo.
5. Abrir la válvula de ingreso al sistema y luego cerrar la válvula de desvío.
6. Encender el cronómetro para comenzar a medir el tiempo de secado.
7. Agitar el sistema con cuidado para distribuir el producto dentro del secador.
8. Si las partículas se adhieren a las paredes, es necesario abrir el sistema, realizando lo
explicado en el punto 3, luego de lo cual con una espátula estéril se despegan las
partículas de la pared.
9. Cerrar el sistema y repetir desde el punto 5.
10. Repetir 8 y 9 si las partículas continúan adhiriéndose a las paredes.

44
4.2.7.1.3 Toma de muestras

Este procedimiento es necesario para poder determinar los parámetros de secado

(humedad, velocidad de secado, etc.).

1. Una vez que se ha completado el tiempo de secado, se suelta el seguro superior para
facilitar la posterior carga.
2. Encender los mecheros ubicados al costado del secador para mantener estéril el
ambiente.
3. Abrir completamente la válvula de desvío ubicada antes del secador, para disminuir el
flujo de aire que ingresa al secador, y cerrar la válvula de entrada al mismo.
4. Abrir el sistema en la parte superior e inferior, y extraer las partículas con la ayuda de
una espátula estéril y depositarla en los frascos estériles para su posterior análisis.
5. Cerrar el sistema.

4.2.7.2 Secado en secador rotatorio a vacío

Para operar el equipo de secado a vacío se debe tener en cuenta lo siguiente:

1. Mantener en la bomba de vacío un nivel adecuado de aceite.

2. Cambiar continuamente durante la operación el líquido refrigerante del condensador
(etanol), aproximadamente cada 20 minutos.
3. Observar el manómetro de mercurio, a fin de determinar el nivel de vacío alcanzado
por el equipo.

4.2.7.2.1 Carga del sistema

Teniendo en cuenta lo anterior, se presenta a continuación un procedimiento general:

1. Instalar el tambor en la cámara de vacío.

45
 2. Cerrar la cámara, subir el switch del motor que hace rotar el tambor, y el switch de
control de temperatura.
3. Fijar el set point del controlador a la temperatura deseada.
4. Esperar que el sistema llegue a estado estacionario (aproximadamente 30 minutos).
5. Abrir la cámara de vacío, bajar el switch del rotor, y cargar el tambor con el producto a
secar.
6. Cerrar la cámara, subir switch del rotor y de la bomba de vacío. Encender ventiladores
de la bomba de vacío.
7. Accionar la bomba de vacío, abrir válvula de seguridad superior de la misma.
8. Encender cronómetro para tomar el tiempo de secado.

4.2.7.2.2 Toma de muestras

1. Bajar switch del rotor, apagar bomba de vacío, y abrir la válvula de la cámara de vacío
para presurizarla.
2. Una vez alcanzada la presión atmosférica, abrir cámara de vacío. Extraer muestra con
la ayuda de una pinza estéril, procurar realizar esta operación en el mínimo tiempo
posible para evitar la contaminación del producto.
3. Cerrar cámara de vacío.

46
4.2.8 Rehidratación del producto seco.

Se pesa un tubo con 4 mL de MRS estéril. Al mismo tubo, y cerca del mechero para
evitar contaminación, se agrega la muestra seca, y se vuelve a pesar. La diferencia entre el
tubo con MRS sin pellet seco y con pellet seco será la masa a considerar para fines de obtener
la concetración de los lactobacilos en ufc/g. Se homogeniza por 5 min a máxima velocidad. Si
el pellet no se desintegra, se debe dejar reposar por no más de 5 minutos adicionales, al final
de los cuales se vuelve a homogenizar, y se extrae una muestra de 100 L para diluir y
sembrar en placas de LAPTg.

47
4.2.9 Diagrama de flujo del procedimiento experimental

Figura 17: Procedimiento de secado de lactobacillus con actividad probiótica.

48
5 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

5.1 Tratamiento térmico del alimento para truchas

Debido a la alta carga bacteriana del alimento proveniente de la planta de la Empresa

productora de alimento para peces Frionatur, que interfieren para fines de contabilizar la
concentración de lactobacillus en el tiempo, en un ensayo de secado, por ejemplo, o bien para
observar el efecto del microorganismo probiótico en su incorporación en dietas acuícolas, se
hizo necesario implementar un sistema de pasteurización que asegurara que el alimento esté
libre de la flora bacteriana indeseable, sin que se alteren las propiedades nutricionales del
mismo.
La presencia de flora bacteriana se confirmó por el crecimiento de estos
microorganismos en placas no selectivas, tales como LAPTg y Agar tripticasa, en el caso de
Gram-negativos, y en placas de MRS (selectivas), en el caso del crecimiento de bacterias
lácticas y/o lactobacillus.
De la información obtenida sobre los parámetros de destrucción térmica de
microorganismos presentes en productos pesqueros, que se muestra en la Tabla 5, de la sección
3.7.2 de Antecedentes, se determinó que tratar el alimento por 45 minutos a 65ºC, es suficiente
para eliminar la población bacteriana presente.

49
5.2 Resistencia térmica

Los resultados obtenidos de resistencia térmica de las cepas LPT32 y LPT87 se

presentan a continuación:
1,E+07
1,E+07
1,E+06

1,E+06 1,E+05

1,E+04

ufc/ml
ufc/ml

1,E+05 50ºC/Cepa 32
40ºC/ Cepa 32 1,E+03
50ºC/Cepa 87
40ºC/ Cepa 87
1,E+02
1,E+04

A 1,E+01 B
1,E+03 1,E+00
0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60
Tiempo (min) Tiempo (min)

1,E+06 1,E+06

1,E+05 1,E+05

60ºC/ Cepa 32
1,E+04 1,E+04
60ºC/ Cepa 87
ufc/ml

ufc/ml

1,E+03 55ºC/Cepa 32 1,E+03

1,E+02 55ºC/Cepa 87 1,E+02

1,E+01 C 1,E+01 D
1,E+00 1,E+00
0 5 10 15 20 0 2 4 6 8 10
Tiempo (min) Tiempo (min)

Figura 18: Viabilidad en función del tiempo para las cepas estudiadas a diferentes temperaturas.

Como es posible apreciar en la Fig. 18, a medida que aumenta la temperatura,

disminuye la viabilidad de las cepas a través del tiempo de tratamiento. Es interesante notar en
la Fig. 18-A que a 40ºC ambas cepas mantienen su concentración, lo que no ocurre a 60ºC
(Fig. 18-D), donde la viabilidad decrece rápidamente. La información aquí recopilada permite
confirmar que la cepa LPT32, además de sus propiedades probióticas, posee una muy buena
resistencia térmica, lo que la hace potencialmente resistente a futuros procesos de
concentración y secado, lo que se corroborará al determinar los parámetros de destrucción
térmica, que se presentan en la siguiente sección.

50
5.3 Determinación de los parámetros de destrucción térmica

Considerando que las cinéticas de destrucción térmica son de primer orden, los
parámetros obtenidos en los ensayos de resistencia a la temperatura son los siguientes (Figs.
19 y 20):

1
2
R = 0,8671
0
-1 0 10 2 20
R = 0,9856
30 40 50 60
2
R = 0,6411 60ºC
log(N/N 0)

-2
-3 55ºC
-4 2
50ºC
R = 0,9454
-5 40ºC
-6
-7

tiempo (min)

Figura 19: Variación de las Unidades Formadoras de Colonias (UFC) en función del tiempo para la cepa 32.

1
0
-1 0 10 20 30 40 50
2
60
R = -0,4035
60ºC
Log(N/N 0)

-2 2
R = 0,8107 55ºC
-3 2
R = 0,9557 50ºC
-4
2
40ºC
R = 0,9889
-5
-6
-7
tiempo (min)
Figura 20: Variación de las Unidades Formadoras de Colonias (UFC) en función del tiempo para la cepa 87.

51
 Tabla 7: Parámetros cinéticos de destrucción térmica para las cepas 32 y 87.
Cepa Temperatura (ºC) k (min–1) D (min)
40 0 
50 0.0264 87.12
55 0.0309 74.43
32 60 0.7315 3.14
40 0 
50 0.0463 49.68
55 0.1682 13.67
87 60 1.3963 1.65

Tabla 8: Parámetro Z en el rango 50-60ºC para las cepas estudiadas.

Cepa Q10 Z (ºC)
32 27.71 6.93
87 30.16 6.76

Los resultados presentados en tabla señalan que la cepa 32 es más resistente frente a un
aumento de temperatura que la cepa 87, lo que se puede observar, comparando los valores de
D en la Tabla 7. Lo mismo se puede apreciar en la Tabla 8, donde la cepa 32 muestra un valor
de Z mayor que la cepa 87.
En literatura ha sido bien reportado el efecto del estrés térmico en muchas especies de
[18]
lactobacillus (Hogg , Whitaker y Batt[19], Teixeira et al.[16]), en relación a aumentar la
resistencia de la bacteria ante un cambio en la temperatura del medio, como lo que ocurre en
una etapa de secado.
Teixeira et al.[16], por otra parte, demuestran experimentalmente que el efecto del
tratamiento térmico es función de la edad de las células. Cuando las células fueron estresadas
en fase estacionaria, no hubo aumento de la resistencia en la etapa de secado por atomización.
En cambio, al estresarlas en fase exponencial aumentaron su resistencia al proceso de secado,
al compararlo con la misma cepa sin estresar, L. bulgaricus.
Desde este punto de vista, las cepas estudiadas deberían ser estresadas en fase
exponencial y no en fase estacionaria, con el fin de que las bacterias desarrollen los
mecanismos de protección que les permitan sobrevivir a la etapa de secado. El objetivo de este
estudio, sin embargo, fue el determinar el efecto de la temperatura en la fase estacionaria de

52
las bacterias, con el propósito de estimar la temperatura óptima para secar la biomasa,
optimizando la viabilidad. Un estrés en cualquier fase de crecimiento implicaría un cambio en
el fenotipo de la bacteria (cambios en la membrana celular, acumulación de solutos
compatibles, etc.), lo que la alejaría de la condición de cepa indígena (cepa nativa sin alterar),
que es preciso conservar para fines del proyecto del que esta memoria de título forma parte.

53
5.4 Resistencia a un aumento en la osmolaridad del medio

Con el fin de determinar la respuesta de los lactobacilos ante un cambio en la

concentración salina del medio, se realizaron una serie de ensayos con las cepas 32 y 87. Los
resultados obtenidos se presentan a continuación:

1,E+10

1,E+09
Viabilidad (ufc/ml)

1,E+08

1,E+07 M32

1,E+06 M32/1M

M32/0,5M
1,E+05

1,E+04

1,E+03
0 10 20 30 40 50 60 70

Tiempo (horas)

Figura 21: Curva de crecimiento de la cepa 32 ante un cambio en la osmolaridad del medio.

5
M32
DO

4 M32 1M

M32 0,5M
3

0
0 20 40 60
Tiempo (horas)

Figura 22: Densidad Óptica (540 nm) de la cepa 32 frente a un cambio en la osmolaridad del medio.

54
 6,5

5,5
M32

pH
5
M32 1M

4,5 M32 0,5M

3,5
0 20 40 60
Tiempo (horas)

Figura 23: Variación del pH del medio en función del tiempo para la cepa 32 ante un cambio en la osmolaridad
del medio.

Se puede notar, al observar las Figs. 21 a la 23, que una concentración de NaCl de
0.1M causa un retardo en el crecimiento de la cepa 32, aunque se puede afirmar que no existe
destrucción, puesto que la viabilidad aumenta exponencialmente durante el tiempo de cultivo
hasta alcanzar el estado estacionario a las 60 horas, al igual que la cepa control. A una
concentración más baja (0.5 M), la cinética de crecimiento sigue la misma tendencia que la
cepa control, con una pequeña disminución en la viabilidad de aproximadamente medio ciclo
logarítmico, que para efectos del método de análisis empleado, es insignificante.
La Fig. 22 corrobora los resultados observados en la Fig. 21, es decir, una mayor
concentración de NaCl en el medio de cultivo produce un retardo en el crecimiento. Por otra
parte, en la Fig. 23 se muestra la variación del pH de la cepa 32 a las diferentes
concentraciones de NaCl, donde, a medida que aumenta la concentración del microorganismo,
disminuye el pH, por efecto de la producción de metabolitos, principalmente ácido láctico.

55
 1,E+10

1,E+09

1,E+08

Viabilidad (ufc/ml)
1,E+07 M87

M87/1M
1,E+06
M87/0,5M

1,E+05

1,E+04

1,E+03
0 10 20 30 40 50 60 70 80

Tiempo (horas)

Figura 24: Cinética de crecimiento de la cepa 87 frente a un cambio en la osmolaridad del medio.

14

12

10
M87
8
M87 1M
DO

6
M87 0,5M

0
0 10 20 30 40 50 60 70
Tiempo (horas)

Figura 25: Densidad Óptica (540 nm) de la cepa 87 frente a un cambio en la osmolaridad del medio.

56
 6,5

5,5
M87

5 M87 1M
pH
M87 0,5M
4,5

3,5

3
0 10 20 30 40 50 60 70
Tiem po (horas)

Figura 26: Variación del pH del medio en función del tiempo para la cepa 32 ante un cambio en la osmolaridad
del medio.

La cepa 87 sigue el mismo comportamiento que la cepa 32 (ver Figs. 24 a la 26). La

disminución de viabilidad es mínima a 0.5M , por lo que se puede afirmar que esta cepa
también es resistente a esa concentración, mostrando también un retardo en el crecimiento a 1
M.
Los resultados que se observan en la Fig. 26 muestran que la menor variación de pH
inicial corresponde a la más alta concentración de NaCl, donde existe una conservación del pH
en las primeras 30 horas de cultivo, que obedece principalmente a la baja tasa de crecimiento
inicial de la cepa estresada con 1 M de NaCl, aunque luego de 50 horas de cultivo, el pH
disminuye hasta el mismo nivel que las otras dos muestras, lo que concuerda con la curva de
crecimiento de la Fig. 24, en donde la viabilidad de la cepa 87 estresada en un medio de 1M
alcanza una concentración de 109 ufc/ml, al igual que la muestra control y la muestra 0.5 M.
Los mecanismos asociados a la adaptación de las bacterias lácticas ante un estrés
osmótico han sido explicados extensamente en literatura. Csonka[15] afirma que existe una
acumulación de solutos compatibles en las células, por síntesis o por transporte hacia la
bacteria en el medio de crecimiento; entre ellos, iones de potasio, glutamato, trehalosa, que
ejercen el rol de agentes protectores ante una operación de secado. Becker et al. [11] suponen
mecanismos donde cationes divalentes acumulados durante un estrés salino forman sales con
fosfolípidos, que estabilizan la estructura de la membrana celular, ante alteraciones del medio.

57
5.5 Resistencia al pH

Dado que las cepas estudiadas serán adicionadas a alimento para truchas, es importante
determinar el comportamiento de estos microorganismos ante una disminución de pH. Por tal
motivo, se estudiaron las cinéticas de crecimiento a pH 4.5, correspondiente al nivel de acidez
que existe en el estómago de los peces a alimentar.

1,E+10

1,E+09

1,E+08
Viabilidad (ufc/ml)

1,E+07
M32/pH=6
M32/pH=4.5
1,E+06

1,E+05

1,E+04

1,E+03
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tiempo (horas)

Figura 27: Viabilidad en función del tiempo para la cepa 32 frente a una disminución de pH del medio.

Como se observa en la Fig. 27, la cepa 32 disminuye su viabilidad al disminuir el pH

desde 6 a 4.5. Si bien al inicio de la curva de crecimiento a pH 4.5 la disminución es notable al
compararla con la curva de pH 6.0 (aproximadamente 2 ciclos logarítmicos después de las 10
horas), luego, en la fase estacionaria, la curva de pH 4.5 se acerca a la curva control. Esto se
explica porque a pesar de la alta mortalidad inicial, hay bacterias que sobreviven al medio
adverso, reproduciéndose en generaciones de lactos resistentes al medio.

58
 1,E+10

1,E+09

Viabilidad (ufc/ml)
1,E+08

M87/pH=6
1,E+07
M87/pH=4.5

1,E+06

1,E+05

1,E+04
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tiempo (horas)

Figura 28: Viabilidad en función del tiempo para la cepa 87 frente a una disminución de pH del medio

Si se compara los resultados de la Fig. 27, con la Fig. 28, se observa que la cepa 87 es
más resistente frente a cambios en el pH del medio de crecimiento que la cepa 32. Los puntos
obtenidos entre las 10 y 30 horas se deben a errores del método de análisis, pero la tendencia
de estos valores indican claramente que la pérdida de viabilidad es menos significativa que en
la cepa 32.
Si bien aún no están del todo claros las respuestas a nivel microscópico de la célula
ante un cambio de pH, es vital determinar la cinética de crecimiento a pH ácido, dado que se
administrará la biomasa probiótica por vía oral (a través del alimento) a las truchas, y
lógicamente, deben ser capaces de resistir el pH estomacal, que para esta especie acuícola está
en el rango de pH 4 a 5.
Otros estudios[1] otorgan al estrés químico o ácido el mismo rol que tiene el estrés
salino, es decir, una disminución o aumento del pH del medio de crecimiento de las bacterias
les confiere una mayor resistencia ante una etapa de secado.

59
5.6 Cinéticas de crecimiento frente a un estrés térmico inicial

En forma paralela a los estudios de cinética de crecimiento bajo condiciones de estrés

osmótico y de cambio de pH del medio, se analizó el comportamiento de las cepas 32 y 87
frente a un estrés térmico inicial, esto para determinar si esto afecta el desarrollo de estos
microorganismos a través del tiempo, y si además, tal y como se ha reportado en la literatura
(Teixeira et al.[16]), este pre - tratamiento otorga algún grado de protección frente a una
operación de secado.

1,E+10

1,E+09
Viabilidad (ufc/ml)

1,E+08

Sin trat.
1,E+07 térmico
Con trat.
1,E+06 térmico

1,E+05

1,E+04
0 20 40 60 80
Tiempo (horas)

Figura 29: Viabilidad en función del tiempo para la cepa 32, con y sin estrés térmico a 55ºC.
1,E+10

1,E+09
Viabilidad (ufc/ml)

1,E+08

Sin trat.
1,E+07 térmico
Con trat.
térmico
1,E+06

1,E+05

1,E+04
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tiempo (horas)

Figura 30: Viabilidad en función del tiempo para la cepa 87, con y sin estrés térmico a 55ºC.

60
 Las cinéticas de crecimientos de estos microorganismos, con un pre-tratamiento
térmico (Figs. 39 y 30), demuestran, una vez más, que la cepa 32 es más termorresistente que
la cepa 87, dado que sigue la tendencia de la cepa control – sin el pretratamiento – y no
disminuye significativamente su viabilidad, lo que no acontece con la cepa 87, la que se ve
seriamente afectada por el tratamiento térmico inicial, aunque luego de 50 horas logra
recuperarse hasta alcanzar el nivel de viabilidad de la cepa control – 87 sin pretratar -.
Muchos autores han señalado –entre éstos Teixeira et al.[16] –que un pre-tratamiento
térmico aumenta la viabilidad del lactobacilo después de una operación de secado,
probablemente por la generación, por parte del microorganismo, de las denominadas proteínas
de estrés, que actúan como escudo protector ante la adversidad del medio.
A pesar de los resultados satisfactorios logrados en los ensayos aquí presentados,
pretratar a las bacterias antes de las operaciones de secado no es una alternativa a considerar
para fines del proyecto del que forma parte esta memoria de título, dado que un cambio en el
fenotipo de la bacteria la alejaría de su condición de autóctona.

61
5.7 Comparación entre las cinéticas de crecimiento de 32 y 32MUT.

Con el propósito de determinar si la mutación de la cepa 32 (cepa resistente a un

antibiótico, rifampicina) alteró la cinética de crecimiento, se realizaron ensayos, tanto en un
medio de cultivo comercial (MRS) como en el medio desarrollado en el Laboratorio de
Alimentos (Permeado de Suero).

1E+10

1E+09

1E+08
ufc/ml

MRS 32

1E+07 MRS 32*

1E+06

1E+05
0 20 40 60 80
tiempo (h)
Figura 31: Cinéticas de crecimiento de la cepa 32 y 32MUT en MRS.

1E+10

1E+09

1E+08
ufc/ml

P 32

1E+07 P 32*

1E+06

1E+05
0 20 40 60 80

tiempo (h)
Figura 32: Cinéticas de crecimiento de la cepa 32 y 32MUT en Permeado de suero.

62
 1E+10
MRS 32
1E+09
0,5M 32
1E+08 1M 32
ufc/ml
1E+07 MRS 32*

0,5M 32*
1E+06
1M 32*
1E+05
0 20 40 60 80

Tiempo (h)

Figura 33: Cinéticas de crecimiento de la cepa 32 y 32MUT con un cambio osmótico del medio MRS.

1E+10
MRS 32
1E+09

1E+08 pH 32
ufc/ml

1E+07 MRS 32*

1E+06
pH 32*
1E+05
0 20 40 60 80

Tiempo (h)

Figura 34: Cinéticas de crecimiento de la cepa 32 y 32MUT con cambio de pH en MRS.

Tal y como se observa en las Fig. 31 a la 34, la cepa mutante se comporta en forma
similar a la cepa 32 sin mutar. El descenso de la viabilidad después de las 42 horas de cultivo
puede deberse a una alteración del medio, asociado a un error experimental, pero aún así sirve
para demostrar que la mutación de la cepa 32 no altera su crecimiento en un medio comercial
ni en un medio alterado, si lo comparamos a la cepa control, dado que ambas mostraron la
mencionada disminución de la viabilidad.

63
 En la investigación microbiológica es común el empleo de antibióticos como ácido
nalidíxico o rifampicina como agentes seleccionadores de bacterias mutantes resistentes a la
acción inhibitoria, principalmente por la alta frecuencia de mutación que presentan algunos
grupos bacterianos a estas sustancias.
En el caso de este estudio en particular, se hizo necesario utilizar la cepa 32 MUT porque
era de vital importancia contar con una metodología que fuese capaz de detectar
selectivamente a la cepa en el estudio descartando a los demás microorganismos asociados,
que es lo que acontece en el bioensayo de alimentación del producto probiótico a truchas, dado
que el tracto gastrointestinal de estos peces no es afecto a sufrir un tratamiento térmico, tal y
como el que se aplica al alimento, en una etapa previa a la dosificación de la biomasa
probiótica, con el fin de eliminar la flora bacteriana presente en él.
De esta forma, para analizar la colonización de la cepa 32 MUT en el tracto gastrointestinal
de estos peces, sin la interferencia de otros microorganismos, basta con sembrar una muestra
diluida de esa zona del animal en una placa agarizada y dosificarla con una cierta cantidad de
rifampicina, para asegurar que en el conteo de viabilidad se obtenga sólo la concetración de la
cepa 32MUT [22].

64
5.8 Secado de alimento para truchas sin biomasa probiótica.

40
35
30
4 mm
Humedad (%)

25
20
2 mm

15
10
5
0
0 10 20 30 40 50 60
Tiempo (min)

Figura 35: Curva de secado en función del tiempo para alimentos de distinto diámetros sin biomasa probiótica.

Los ensayos previos de secado de alimento sin biomasa tuvieron por objetivo
determinar la humedad que es posible alcanzar en el secador de lecho fluidizado, para los dos
diámetros de pellets a estudiar, teniendo en cuenta que la humedad de los alimentos
comerciales para truchas flutúan entre un 7 a 10%.
De lo anterior, se obtuvo que para el pellet de 2 mm, un tiempo de secado de 40
minutos sería suficiente para asegura una humedad de alrededor del 5%, y de 60 minutos para
los pellets de 4mm, que corresponde a una humedad del 7%, aproximadamente. Esto es
importante para fines de este estudio, dado que el tiempo de secado es una variable que influye
en la sobrevivencia de estos microorganismos ante un proceso de secado (ver Fig. 35).
Estos resultados también fueron reproducidos en el secador a vacío, con tiempos de 40
minutos para los pellets de 2 mm y de 60 minutos para los de 4 mm, con humedades sobre el
5% y bajo el 10 %, un rango razonable para obtener un producto estable para fines de
almacenamiento y comercialización.

65
5.9 Secado de alimento para truchas con biomasa probiótica

Se realizaron ensayos por duplicado en los dos equipos de secado utilizados para este
estudio: secador rotatorio a vacío y secador de lecho fluidizado. Los resultados se presentan a
continuación:

Figura 36: Secado de alimento con biomasa probiótica de 2 mm en lecho fluidizado (aire, 40ºC).

Figura 37: Secado de alimento con biomasa probiótica de 2 mm en secador rotatorio a vacío (60ºC, 370mmHg).

66
 De las Figs. 36 y 37, se puede observar que el producto con biomasa probiótica
mantiene su viabilidad a través del tiempo de secado, tanto en el secador a vacío como en el
secador de lecho fluidizado, con una humedad final inferior a 10% en el lapso de una hora.
Las temperaturas de secado escogidas para cada equipo son el resultado de los ensayos
de resistencia térmica realizados con la cepa 32, que demostró ser resistente a un estrés
térmico de 40ºC. Una temperatura menor a 40ºC fue descartada para fines de los ensayos,
porque implica un mayor tiempo de secado, por lo que el proceso se encarece, si lo
proyectamos a escala industrial. En el caso del secador a vacío, si bien la temperatura de la
cámara es de 60ºC, la temperatura al interior del tambor rotatorio, y por ende, del producto que
se está secado, es inferior y es aproximadamente 40ºC, por efecto de la baja presión alcanzada
en el equipo.
La conservación del 100% de la viabilidad de la biomasa probiótica es contraria a los
resultados de investigaciones publicadas al respecto. Por ejemplo, según las revisiones en
extenso efecuadas por Lievense y Van Riet (1992) [8], se deja en claro que con técnicas
convencionales de secado como por atomización, granulación-spray y lecho fluidizado es
complejo alcanzar un 100% de retención de viabilidad de los microorganismos. Los autores sí
hacen alusión al hecho de que al utilizar estas técnicas es posible obtener productos a bajo
costo, y también recalcan que no existe un procedimiento único de secado, pues depende del
tipo de microorganismo que se quiere deshidratar. Lo mismo es afirmado por Texeria et al.
(2004)[17], quien concluye que es posible entregar recomendaciones generales para secar
microorganismos, y que cada tipo de éstos se comporta de forma diferente, y por lo tanto,
deben ser estudiados individualmente.
Por otra parte, el alimento en el que se encuentra la biomasa probiótica ejerce un rol
protector ante el aumento de la temperatura en la etapa de secado. Muchos autores han
estudiado el efecto de los agentes protectores en la sobrevivencia de microorganismos. Se
debe considerar, además, que la biomasa está suspendida en una solución de leche descremada
y peptona de caseína, que actuarían también como agentes protectores. Por lo tanto, no se
puede considerar que los resultados obtenidos son ajenos a lo que se ha reportado en la
literatura; más bien son un aporte a ella, y de interés inmediato para próximas investigaciones
en el mismo proyecto, con el fin de identificar el o los factores que gobiernan el
comportamiento de esta cepa en relación a la etapa de secado.

67
 Al comparar ambas tecnologías de secado, es claro que en el secador a vacío se llega a
una humedad menor que en el lecho fluidizado. En cuanto a la viabilidad, no se presentan
diferencias, aun cuando son notables los resultados que se obtienen en el secador a vacío, por
cuanto se mantiene la viabilidad incluso a una humedad del orden del 2%.
Es interesante notar que en estos procesos gobiernan distintos mecanismos de
transferencia de calor, primando la convección en el caso de la fluidización y la conducción-
radiación en el caso del secado a vacío. De acuerdo a las Figs. 36 y 37, ninguna de las
operaciones de secado presenta un claro período de secado constante, a excepción de lecho
fluidizado los primeros 10 minutos. Esto permite afirmar que la etapa controlante durante el
secado se encuentre en el producto mismo y no en su entorno. Por lo tanto, se puede concluir
que el tipo de equipo de secado no es un factor que influya en la pérdida de viabilidad o
mantención de la misma para esta cepa probiótica.
Resultados similares se presentan para el alimento de 4mm de diámetro, según las Fig.
38 a la 40. Las diferencias que se pudieron notar entre los dos tipos de secado (esto es, secado
en lecho fluidizado y secador a vacío) en el alimento de 2 mm no son tan claras para el caso
del alimento de mayor diámetro.
De acuerdo a las leyes fundamentales de transferencia de materia, el tamaño y la
geometría de un producto a secar condicionan su coeficiente de transporte, velocidad de
secado en período decreciente, entre otras variables importantes en una operación de secado.
Se debe notar, sin embargo, que aun cuando la cinética de secado es más lenta en el alimento
de 4mm, se alcanza una humedad inferior o cercana al 5% después de transcurrido los 60
minutos de secado, en ambos equipos utilizados para este fin (ver Fig. 38 y 39). Además, al
igual que los resultados con el alimento de 2mm, se conserva la viabilidad, aun a humedades
bajo 5%, como lo que se obtiene en el secador a vacío.

68
Figura 38: Secado de alimento con biomasa probiótica de 4 mm en secador de lecho fluidizado (aire, 40ºC).

Figura 39: Secado de alimento con biomasa probiótica de 4 mm en secador rotatorio a vacío (60ºC, 370
mmHg).

69
Figura 40: Secado de alimento con biomasa probiótica de 2mm y 4 mm en secador rotatorio a vacío (60ºC, 370
mmHg) y secador de lecho fluidizado (aire, 40ºC). Valores promedio.

En la Fig. 40. se corrobora lo que se ha comentado ya al observar las Fig 38 y 39, es

decir, se aprecia que el secado es más rápido en el alimento de menor diámetro, y que la
viabilidad se mantiene constante, a pesar de la disminución de la humedad del alimento,
independiente del tamaño del mismo y del equipo de secado utilizado.

70
5.10 Balances en el Secador de Lecho Fluidizado

A continuación, se presentan los tiempos de secados teóricos determinados para los dos
diámetros de alimento con biomasa probiótica estudiados6:

Tabla 9: Tiempo de secado teórico

T bulbo Hum. Hum.

mc hGnielinski t
Dalimento (mm) T bulbo seco (ºC) húmedo inicial final
(ºC) (kg/s) (W/m2K) (min)
(%) (%)
2 40 21.35 2.02x10-5 42.32 23.17 73.37 2.8
4 40 23.05 6.44x10-6 42.32 26.66 51.08 7.0

Los bajos tiempos de secado en período de velocidad constante para los dos tipos de
pellets concuerdan con lo observado en las curvas de secado (Ver Fig. 35), es decir, es una
típica curva controlada por mecanismos difusivos de transferencia de materia. Por
consiguiente, dado que es la difusión interna el efecto que controla durante tiempos
prolongados de secado, la velocidad de deshidratación (mc) es inversamente proporcional al
diámetro del alimento. En otras palabras, el tiempo de secado entre límites de humedad fijos
varía directamente con el espesor de la partícula, y esto se puede demostrar a través de la
segunda ley de Fick para difusión en estado no estacionario.
Los resultados obtenidos directamente de las curvas de secado para lecho fluidizado se
presentan a continuación:

Tabla 10: Parámetros determinados experimentalmente.

Dalimento mc Uexo tsecado
(mm) (kg/s) (W/m2K) (min) Nu NuGnielinski
2 1.28x10-6 20.48 10 10.79 38.66
4 9.48x10-7 35.96 10 23.98 53.83
Los resultados experimentales muestran la misma tendencia que los resultados teóricos
(Tabla 10), es decir, la velocidad de deshidratación es mayor a menor tamaño del alimento. Se
presentan, además, los valores experimentales del coeficiente de transferencia de calor global

6
El detalle del balance se encuentra en el apéndice D.

71
para el equipo, que es un parámetro fundamental para fines de escalar el equipo de laboratorio
en el que se realizaron los ensayos, a una planta piloto.
Con respecto a los tiempos de secado en período de velocidad constante, los resultados
son estimativos, dado que en la curvas de secado para los dos tipos de alimentos estudiados
(de 2 y 4 mm) prácticamente no existe un período de velocidad constante y no se tomaron más
puntos experimentales entre 0 y 10 minutos con los que se pueda afirmar que dicho período
tiene una duración menor.

72
5.11 Almacenamiento del producto fresco y deshidratado

Una vez que se logró formular el alimento con biomasa probiótica, se midió la
viabilidad del producto fresco (sin secar) a 4ºC. Este alimento así preparado se utilizó como
dieta para truchas arcoiris, con el fin de determinar el efecto del lactobacilo en el crecimiento
de esa especie. La viabilidad del producto fresco almacenado a lo largo del tiempo se puede
observar en la Fig. 41:

Figura 41: Curva de viabilidad del producto probiótico fresco (humedad: 40%), almacenado a 4ºC.

Como se aprecia, el producto fresco conserva su viabilidad luego de 32 días de

almacenamiento, aunque se pudo comprobar, en forma cualitativa, que luego de una semana,
comienza a producir aromas, lo que indica una acidificación del producto, debido,
probablemente a la actividad metabólica de la biomasa probiótica, puesto que es el único
microorganismo que está presente en el alimento (se debe recordar que el alimento está tratado
térmicamente para eliminar la flora bacteriana presente inicialmente).
La actividad biológica en el alimento, asociado a la actividad de agua, del orden del
40% en el producto fresco, es un problema para efectos de conservación y comercialización
del mismo. Por tal motivo, se ha aplicado en este estudio la conservación por deshidratación,

73
pero queda por analizar si la biomasa probiótica es capaz de sobrevivir en el tiempo luego de
una operación de secado.
Con ese objetivo, se almacenaron muestras de alimento de 2 mm secadas en el secador
de lecho fluidizado, a 4ºC y a temperatura ambiente (aproximadamente 20ºC), en ausencia de
luz, tal y como fue sugerido por Texeira et al. [17] y Lievense y Van Riet (1992)[8]. En el caso de
este estudio, se almacenó en viales de vidrio con tapa de goma, de 30 mL (ver Fig. 42),
envueltos en papel aluminio, almacenados en un lugar seco y desprovisto de luz, a las dos
temperaturas ya mencionadas.

Figura 42: Viales de vidrio utilizados para almacenar producto probiótico seco.

1,E+10
1,E+09
1,E+08
1,E+07
1,E+06
4ºC, 03/01
ufc/g

1,E+05
20ºC, 03/01
1,E+04 4ºC, 05/01
1,E+03 20ºC, 05/01

1,E+02
1,E+01
1,E+00
0 7 14 21 28 35 42
Tiempo (días)
Figura 43: Viabilidad del producto probiótico seco almacenado.

74
 Se estudiaron dos muestras de alimento: la primera fue secada el 3 de enero (3/01), con
una humedad –al momento de almacenar a 4ºC y a 20ºC- de 5%; la segunda muestra fue
secada el 5 de enero (5/01), con una humedad cercana al 7%. Los resultados se muestran en la
Fig. 43: como se puede notar, la viabilidad se conserva en un 100% cuando el producto seco se
almacena a 4ºC (se consideran el punto de 14 días como error del método), y una mortalidad
creciente hasta alcanzar la totalidad a los 21 días, en el producto seco almacenado a
temperatura ambiente.
Estos resultados demuestran que almacenar el producto probiótico genera un costo
asociado a un sistema de refrigeración para mantener una temperatura baja. Sería interesante
modificar en algún punto el procedimiento que se ha llevado a cabo hasta el momento para
formular el alimento con la cepa probiótica, de tal forma de optimizar la viabilidad del
producto almacenado a las dos temperaturas aquí estudiadas. Es claro que esto depende única
y exclusivamente de la etapa de activación y cultivo de la cepa probiótica. Por tal motivo, se
analizaron dos alternativas:

1. Cosechar la biomasa del biorreactor a las 72 horas, en vez de las 50 horas que se
aplicaba hasta el momento. Debido a la cinética de crecimiento de la cepa estudiada,
se estima que alcanza la fase estacionaria después de 48 horas. En experiencias previas
con otras cepas probióticas que se han cosechado en 72 horas y liofilizadas, se ha
conservado la viabilidad del producto seco, más que con la misma cepa cosechada a las
48 horas.

2. Estresar la cepa probiótica en la etapa de crecimiento. Muchos autores, entre otros,

Becker et al.[8] sugieren que estresar la cepa en la etapa de cultivo (crecimiento de la
cepa) es beneficioso para la sobrevivencia del microorganismo después de una etapa de
secado. Por tal motivo, al medio de permeado de suero, se adicionó NaCl a 0.5M, de
tal forma de estudiar el efecto del estrés osmótico en la sobrevivencia de la cepa en la
etapa de almacenamiento.

75
 Los resultados se presentan a continuación:

1,E+10 1,E+10

1,E+09 1,E+09
LF1
ufc/g

ufc/g
LF1
SV1
1,E+08 1,E+08 SV1

1,E+07
1,E+07
0 10 20 30 40
0 20 40 60
Tiempo (min) 1 2
Tiempo (min)

Figura 44: Viabilidad en función del tiempo para la biomasa con 72 horas de cultivo: 1: alimento de 2 mm; 2:
alimento de 4 mm.

1,E+10
1,E+10
1,E+09
1,E+08 1,E+09
LF1
ufc/g
ufc/g

1,E+07 LF1
SV1
1,E+06 SV1 1,E+08

1,E+05
1,E+04 1,E+07
0 30 60 0 10 20 30 40
Tiem po (m in) 1 Tiempo (min) 2

Figura 45: Viabilidad en función del tiempo para la biomasa estresada con sal: 1: alimento de 2 mm; 2:
alimento de 4 mm.
1,E+11

1,E+10
Las Figs. 1,E+09
44 y 45 demuestran, una vez más, la conservación de la viabilidad de la cepa
probiótica durante
1,E+08la etapa de secado. Se tomaron menos puntos experimentales que en los

1,E+07
ensayos anteriores, puesto que interesaba estudiar el efecto de estas dos alternativas en la etapa
ufc/g

LF 4ºC
1,E+06
de almacenamiento. LF 20ºC
1,E+05 SV 4ºC
1,E+04 SV 20ºC

1,E+03

1,E+02
76
0 7 14 21
Tiempo (días)
 Figura 46: Viabilidad del alimento probiótico seco de 2 mm (biomasa con 72 hrs. de cultivo) almacenado.

1,E+10

1,E+09

1,E+08

1,E+07
LF 4ºC
ufc/g

1,E+06 LF 20ºC

1,E+05 SV 4ºC
SV 20ºC
1,E+04

1,E+03

1,E+02
0 7 14 21
Tiempo (días)

Figura 47: Viabilidad del alimento probiótico seco de 4 mm (biomasa con 72 hrs. de cultivo) almacenado.

Tal como se observa en las Figs. 46 y 47, la viabilidad del producto probiótico en la
etapa de almacenamiento mejora notoriamente, al compararlo con la Fig. 52.
Las células en fase estacionaria desarrollan un metabolismo diferente al de la fase de
exponencial (fase de crecimiento exponencial) y durante ella se produce una acumulación y
liberación de metabolitos secundarios. Los microorganismos entran en fase estacionaria bien
porque se agota algún nutriente esencial del medio, porque los productos de desecho que han
liberado durante la fase de crecimiento exponencial hacen que el medio sea inhóspito para el
crecimiento microbiano o por la presencia de competidores u otras células que limiten su

77
crecimiento. Si se considera que no existe presencia de competidores (medio de cultivo se
considera estéril), la presencia de metabolitos potencialmente tóxicos genera un medio de
estrés que, tal como acontece con el estrés osmótico, confiere resistencia a las bacterias ante
una etapa de secado.
Sin embargo los buenos resultados mostrados con respecto a la alternativa de cosechar
la biomasa a las 72 horas, el costo de aumentar el tiempo de residencia de las bacterias es alto,
pues implica contar con un fermentador de mayor capacidad para tal efecto.

1,E+10

1,E+09

1,E+08

1,E+07
LF 4ºC
ufc/g

1,E+06
LF 20ºC
1,E+05 SV 4ºC
SV 20ºC
1,E+04

1,E+03

1,E+02
0 7 14 21
Tiempo (días)

Figura 48: Viabilidad del alimento probiótico seco de 2 mm (biomasa estresada con NaCl en la etapa de cultivo)
almacenado.

1,E+10
1,E+09
1,E+08
1,E+07
1,E+06 LF 4ºC
ufc/g

1,E+05 LF 20ºC
1,E+04 SV 4ºC
SV 20ºC
1,E+03
1,E+02
1,E+01
1,E+00
0 7 14 21
Tiempo (días)
Figura 49: Viabilidad del alimento probiótico seco de 4 mm (biomasa estresada con sal en la etapa de cultivo)
almacenado.

78
 Las Figs. 48 y 49 muestran los resultados obtenidos con el alimento con biomasa
estresada con NaCl en la etapa de cultivo, y al igual que las Figs. 46 y 47, la viabilidad mejora
notoriamente al compararlo con el almacenamiento del producto con biomasa sin alterar, si
bien la viabilidad del producto almacenado se reduce en al menos 1 ciclo logarítmico al cabo
de 2 semanas (tanto en el alimento de 2 mm como en el de 4 mm).
Los efectos del estrés osmótico en la cepa LPT32 ya han sido mencionado en análisis
anteriores, pero es preciso recalcar que este fenómeno otorga una mayor resistencia a este
microorganismo después de una etapa de secado, por modificiación en la estructura de la
membrana celular, por acumulación de solutos compatibles que actúan como agentes
protectores, etc.
Al contrario que lo que acontece con la alternativa de cosechar a las 72 horas la cepa en
estudio, el costo de estresar la biomasa con NaCl no está asociado a invertir en un equipo de
mayor tamaño, sólo comprende el costo de la sal propiamente tal.

79
5.12 Concentración de la biomasa probiótica en el alimento y costo de producirla.

Con el procedimiento aquí descrito, se asegura una concentración de 10 9 ufc por gramo
de alimento, esto ya se ha podido apreciar en la Fig. 41, donde se muestra la conservación de
la viabilidad del alimento probiótico a través del tiempo.
Por otro lado, el costo de producir esta biomasa asciende a 1005 [$/kg alimento] 7. Este
costo es excesivo si se piensa en escalar a una producción de toneladas de alimento, por
ejemplo. Un producto probiótico comercial posee una concentración no superior a 10 8 ufc por
gramo, esto es 10 veces menos que lo que se obtiene en laboratorio. Por lo tanto, puede
estimarse que el costo de elaborar alimento probiótico para truchas también disminuye 10
veces, es decir, a sólo 100 [$/kg alimento].
En cuanto al proceso de elaboración del alimento para truchas la alternativa propuesta en
esta memoria de título equivale a tres etapas extras: una etapa de fermentación, otra de
separación y una de secado.

Figura 50: Proceso actual de elaboración de alimento para truchas.

7
Ver detalle en la sección E1 del Apéndice.

80
Figura 51: Proceso propuesto en esta memoria para elaborar alimento probiótico para truchas.

81
6 CONCLUSIONES

 De los ensayos de resistencia térmica, la cepa 32 mostró tener mayor tolerancia ante un
aumento de temperatura (desde 40ºC hasta 60ºC) que la cepa 87, encontrándose que a
40ºC se mantiene la concentración celular, por lo que resultó ser la temperatura
escogida para las pruebas de secado. Los parámetros de destrucción térmica de la cepa
32 son: z = 6.93 ºC y Dθ a 60ºC = 3.1 min.

 Las cepas estudiadas presentan una alta resistencia a un aumento de la osmolaridad del
medio. A una concentración de 0.5 M de NaCl no hay inhibición en el crecimiento,
pero una concentración de 1 M afecta la cinética de crecimiento.

 Se logró formular un producto probiótico de concentración de 109 ufc/galimento.

 En ambos equipos de secado la deshidratación del alimento con biomasa probiótica

alcanzó humedades iguales o inferiores a un 5%; en el caso del secador a vacío, en un
tiempo de 60 minutos, y en el caso del secador de lecho fluidizado, de 40 minutos.

 La viabilidad de la biomasa durante la etapa de secado se conserva en un 100% y este

fenómeno es independiente del tipo de equipo, y por lo tanto, del mecanismo de
transferencia de calor.

 El producto almacenado por 4 semanas a 4ºC conserva su viabilidad, pero no ocurre lo

mismo a temperatura ambiente.

 Se comprueba que cosechando la biomasa a las 72 horas (y no a las 48 horas) se

conserva en un 100% la viabilidad del producto probiótico almacenado a temperatura
ambiente. El producto con estrés salino también muestra mejoras satisfactorias de
viabilidad al ser almacenado a temperatura ambiente.

82
 El costo de producir biomasa con concentración de 10 9 ufc/galimento para adicionarla al
alimento para truchas asciende a 1005 [$/Kgalimento] y con una concetración comercial
de 108 ufc ufc/galimento de 100 [$/Kgalimento].

 De las curvas de secado del lecho fluidizado, se determinaron los coeficientes de

transferencia de calor a 40ºC, que para el alimento de 2 mm de diámetro corresponde a
20.5 W/m2K, y para el alimento de 4 mm, a 36 W/m2K.

83
7 RECOMENDACIONES

 En futuras investigaciones, se debería estudiar en extenso la etapa de almacenamiento

del producto probiótico deshidratado, a fin de determinar los factores que favorecen la
conservación de la viabilidad.

 Una alternativa a la propuesta en el proceso de elaboración del producto probiótico

consiste en la fermentación de la biomasa en el descarte de pescado. Esto ahorraría al
menos dos etapas de proceso, y se ahorraría en aditivos que se agregan al medio de
cultivo. Esto podría ser tema de otra memoria de título.

 Con respecto al secador a vacío, en esta ocasión sólo se pudo utilizar como medio de
comparación con el secador de lecho fluidizado, dado que no se contaba con un
indicador de la temperatura del producto, la bomba de vacío presenta problemas de
fuga de aceite, entre otras falencias, por lo que sería óptimo contar con este equipo en
buenas condiciones, a fin de escalar el proceso, puesto que los resultados obtenidos en
el equipo son prometedores.

 Algunas modificaciones a realizar en el equipo de lecho fluidizado correspondería a

instalar un sistema de vibración, para lograr una fluidización rápida de las partículas.
Por otra parte, es vital poder transformarlo en un sistema continuo, para poder simular
un proceso productivo real.

84
8 REFERENCIAS

[1] R. Tojo Sierra, R. Leis Trabazo, “Alimentos funcionales. Su papel en la nutrición

preventiva y curativa”. Unidad de Investigación de Nutrición y Desarrollo Humano de
Galicia, Departamento de Pediatría. Hospital Clínico Universitario de Santiago,
Universidad de Santiago de Compostela, (1995)

[2] Havenaar, R., Huisin’t Veld, J. “Probiotics: A general view.”, Wood J. B.J. (ed)., Lactic
Acid Bacteria in health and Disease, Vol. 1. Elsevier Applied Science Publishers,
(1992).

[3] Saavedra, J. M., “Microbes to fight microbes: A not so novel approach to controlling
diarrheal disease”, Journal of Pediatrics and Gastrointestinal Nutrition, 21(2) (1995),
125-129.

[4] Gomes, A. M. P., Malcata, F. X., “Bifidobacterium spp. and Lactobacillus acidophilus:
Biological, biochemical, technological and therapeutical properties relevant for use as
probiotics.”, Triends in Food Science and Technology, 10 (1999), 139-157.

[5] Sameh Hassan Mosilhey, “Influence of Different Capsule Materials on the

Physiological Properties of Microencapsulated Lactobacillus acidophilus”, Institut für
Lebensmitteltechnologie, Hohen Landwirtschaftlichen Fakultät, Rheininschen
Friedrich – Wilhelms – Universität, Bonn, (2003), 12-15.

[6] Shahidi, F., Han Xiao-Qing, “Encapsulation of Food Ingredients. Critical Reviews in
Food Science and Nutrition”, 33(6) (1993), 501-547.

[7] Thies, C. “Survey of microencapsulation processes”, In: Benita S. (ed.),

Microencapsulation: Methods and industrial applications, Marcel Dekker Inc., New
York, (1996), 1-19

85
[8] Livense, L. C., Van’t Riet, K., “Convective Drying of Bacteria”, Advances in
Biochemical Engineering, (1992).

[9] Orndoff G. R., MacKenzie A. P., Cryobiology , (1973), p.10-475.

[10] Kilara A., Shahani K. M., Das N. K., Cultured Dairy Products J, (1976), p. 8.

[11] Beker M. J., Rapoport A., In: Fiechter A (ed.), Advances in Biochemical
Engineering/Biotechnology, vol 32, Springer, Berlin Heildelberg New York, (1987),
p.127.

[12] Treybal R., “Operaciones de Transferencia de Masa”, Segunda Edición, McGraw-Hill,

México, (1980).

[13] Felows P, “Tecnología del procesado de alimentos”, Editorial Acribia S.A., España,
(1994).

[14] Melo M., Carolina, “Cultivo y Deshidratación de un Probiótico para Medicina

Preventiva”, Informe de Memoria de Título, Departamento de Ingeniería Química,
Universidad de Concepción, (2005).

[15] Csonka, L.,”Physiological and Genetic Responses of Bacteria to Osmotic Stress”,

Microbiological Reviews, (1989), p. 121-147.

[16] Teixeira, P., Castro, H., Kirby, R., “Spray Drying as a method for preparing
concentrated cultures of Lactobacillus bulgaricus”, Journal of Applied Bacteriology,
(1995), vol. 78, p. 456-462.

[17] Teixeira, P. et al., “Relevant factors for the preparation of freeze-dried lactic acid
bacteria”, International Dairy Journal, (2004), vol.14, p. 835-847.

86
[18] Hogg, T., “Effects of heat shock on the survival of Salmonella typhimurium”, pHD
Thesis, University of Reading, UK, (1989).

[19] Whitaker, R. D. and Batt, C. A., “Characterisation of the heat shock response in
Lactococcus lactis subsp. Lactis.” Applied and Environmental Microbiology”, (1991),
vol.57, p. 1408-1412.

[20] http://www.joseacortes.com/practicas/tinciongram.htm

[21] http://www.telecompra.cl/Productos/productos.php?.cat=Leche%20en%20polvo

[22] Sánchez Urra, M., “Obtención de cepas de Lactobacillus mutantes resistentes al

antibiótico rifampicina”, Proyecto Innova Bío-Bío 03-B1-205L-1,(2005).

[23] VDI-Wärmeatlas, (1991).

87
9 APÉNDICE

Apéndice A. Tinción de Gram

Los tiempos de exposición a los colorantes son orientativos. Cada vez que se prepara la
batería de colorantes para realizar la tinción Gram presentan algunas diferencias respecto a los
preparados en otro momento, por lo que puede ser necesario ajustar los tiempos.

1. Preparar el frotis bacteriano. Esto se realiza según el siguiente procedimiento:

 Preparar los portaobjetos, limpios y libres de grasa.

 Esterilizar el asa en llama de mechero, y se toma la muestra a analizar, en forma

aséptica, extendiéndola sobre la superficie, formando una gruesa película de
líquido.

 Dejar secar la película sin calentar, y después pasar el portaobjeto 3 veces por
encima de la llama para así matar las bacterias y fijar la muestra.

 Dejar enfriar el portaobjeto.

2. Teñir con cristal violeta 1min.

3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
4. Cubrir con Lugol 1min.
5. Lavar con agua el exceso de Lugol.
6. Decolorar con alcohol-acetona o simplemente con alcohol hasta que la preparación
deje de perder color (30seg)
7. Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente.
8. Teñir con safranina 1min.
9. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste.
10. Secar la preparación y examinar al microscopio fijándose sobre todo en el color de
cada preparación.

88
Apéndice B. Determinación de la viabilidad de las células.

B1. Preparación de placas petri con LAPTg.

Se diluyen en un volumen dado de agua destilada los ingredientes del caldo LAPTg
agarizado, según la sección 4.1.3, en Materiales y Métodos. Una vez disuelto todos los
componentes, se tapa el matraz que los contiene con algodón, y se envuelve la boca del mismo
con papel. Se esteriliza por 15 minutos en olla a presión, luego de lo cual se agita, para
homogenizar la mezcla y se enfría hasta 40-50ºC. Se vierten 15 mL de caldo agarizado en
placas petri estériles al lado de un mechero, para evitar contaminación.

B2. Siembra en placas para recuentos de colonias viables.

Se toma una muestra de 0.1 mL con micropipeta (100 L) y se vierte en un eppendorf
que contiene 0.9 mL de agua destilada. Se realizan diluciones consecutivas, en la que se van
tomando 100 L de un eppendorf y vertiéndolo al siguiente, previa agitación. Realizadas todas
las diluciones requeridas, se toman 50 L y se vierte en una placa de LAPTg agarizada, al lado
de un mechero. Con una pipeta Pasteur doblada en forma de rastrillo se extiende la muestra en
toda la placa, luego de lo cual se deja incubar en medio anaeróbico por 48 horas.

B3. Conteo de colonias viables en ufc/mL.

Se contabilizan las unidades formadoras de colonias (ufc) en las placas, luego de 48

horas de haber sido sembrada, según la Fig. 52. El número de colonias contabilizadas se
dividen por la dilución a la que corresponde. Como por lo general se siembran más de una
dilución, por ejemplo, diluciones 10-4, 10-5 y 10-6 (10-4 indica que se diluyó 4 veces la muestra
antes de sembrarla), se debe tomar un promedio de todas las que se sembraron, para una
muestra dada. El promedio obtenido se divide por el factor 50 L/1000 L (dado que se

89
extrajeron 50 L de un eppendorf que contiene un total de 1000 L para sembrar). De esta
forma se obtiene el conteo de colonias viables en ufc/mL, según la Ec. (29).

Figura 52: Placas de LAPTg con crecimiento de colonias viables.

Pr omedio Conteo ufc Dilución 

Viabilidad  ufc / mL  
50L (29)
1000L

90
Apéndice C. Tablas de datos y gráficos anexos

C.1 Gráficos para para determinar Uexp

Figura 53: Gráfico para determinar tiempo de deshidratación en período de velocidad decreciente. Alimento de
2mm.

La Fig. 53 muestra las dos curvas de secado para el alimento de 2 mm. El período de
velocidad decreciente, en el que se determina Uexp, es de aproximadamente 10 minutos. Hasta
ese tiempo, se traza la línea de tendencia, y se utiliza la pendiente para estimar la humedad al
final del período de velocidad decreciente. Con este último valor y con la humedad inicial del
alimento, se determina el agua evaporada por unidad de tiempo (mc) y luego Uexp, según la Ec.
(3). Lo mismo se muestra para el alimento de 4 mm (ver Fig. 54):

91
Figura 54: Gráfico para determinar tiempo de deshidratación en período de velocidad decreciente. Alimento de
4 mm.

C2. DO y pH

Figura 55: Variación de la Densidad Óptica (540 nm) en el tiempo de la cepa 32 y 87 con un estrés térmico
inicial.

92
 Figura 56: Variación del pH del medio en función del tiempo para las cepas 32 y 87 con un estrés térmico
inicial.

Figura 57: DO (540 nm) en función del tiempo para las cepas 32 y 87 ante una disminución del pH del medio.

93
Figura 58 Variación del pH del medio en función del tiempo para las cepas 32 y 87 ante una disminución del pH
del medio.

94
Apéndice D. Ejemplo de cálculo

D1. Balance de materia y energía en el secador de lecho fluidizado

Datos:
Tabla 11: Datos del sistema de lecho fluidizado y del alimento con biomasa probiótica.

Parámetro Valor
Velocidad del aire (v) 7,3 m/s
Temperatura de bulbo húmedo 23.05 ºC
Temperatura bulbo seco 40 ºC
Densidad del aire 1.1124 kg/m3
 2293.39 kJ/kg
Densidad alimento 2 mm 1002.4 kg/m3
kaire 0.006 W/m K
 1.920x10-5 kg/ms
Longitud lecho 0.15 m
Diámetro de lecho 0.07 m
Pr 0.712

Para el alimento de 2 mm, el área y volumen de un pellet (considerando una longitud

promedio de 2.4 mm):

Área pellet  
D2
 DL   

2 x10 3  2

   2 x10 3  4 x10 3  3.14 x10 5 m 2

2 2

Dado que la carga de alimento es de 3 g, se puede determinar el volumen total de la carga,

obtenida la densidad del pellet:
3 x10 3 kg
Vc arg a  3
 2.9928 x10 6 m 3 / total pellets
1002.4 kg / m
Por otro lado, el volumen del lecho que contiene a los pellets:
D2  0.07 2 
V   L      0.15  5.8 x10  4 m 3
4  4 

De la Ec. (11), se obtiene la porosidad del lecho:

95
 V  VF V   2.99 x10 6 
   1   F   1   4
  0.99
V V   5.8 x10 
Por otro lado:
.3.14 x10 5
dk   0.003 m

Luego, de la Ec. (9)
7.3  0.003  1.1124
Re   1344
1.920 x10 5  0.99
De las Ec. (5) a la (7):
Nu lam  0.664  1344  3 0.712  21.739

0.037  1344 0.8  0.712

Nu turb   4.31
1  2.443  1344 0.1   0.712 3  1
2

 

Nu Esferas  2  21.74 2  4.312  24.16

Con el factor de corrección fa igual a 1.6:

Nu  1.6  24.16  38.66
Por lo tanto, de la Ec (8) se despeja hc:
Nu  k aire 38.66  0.006 W
hc    73.37 2
dk 0.003 m K

De la Ec.(3) se obtiene la velocidad de deshidratación:

73.37  7.48  10 3
mc   40  23.05  4.46 x10 6 kg
2293.39  1000 s

Del balance de materia:

Sólidos Totales Iniciales  3x10 3 kg  (1  humedad inicial )  3x10 3  (1  0.4232)  0.0017 Kg

Masa agua inicial  3x10 3  0.0017  0.00127 Kg

Dado que los sólidos totales no varían y la humedad llega a 0.24, la masa total final
corresponde a:
0.0017
Masa total final   0.0023 kg
(1  0.062)

Masa agua final  0.0023  0.0017  0.000542 kg

96
 Masa agua evaporada  0.00127  0.000542  0.00075 kg

Por lo tanto, el tiempo de deshidratación corresponde a:

0.00075 kg
t deshidr.   167.5 s  2.8 min
4.46 x10 6 kg
s

D2. Determinación de la cantidad de biomasa por gramo de alimento

Según lo explicado en la sección 4.2.8 de Materiales y Métodos, a la masa de alimento

agregado a un tubo con MRS, homogenizado y sembrado en varias diluciones en placas de
LAPTg, se le realiza el conteo de ufc, las que se expresan en ufc/mL según lo señalado en el
apéndice B3. Este valor se multiplica por el volumen líquido del tubo (volumen de MRS) y se
divide por la masa de alimento, según la siguiente ecuación:

Viabilidad  ufc / mL   4 mL
Viabilidad  ufc / g   (30)
Masa pellets g 

D3. Determinación de los parámetros de destrucción térmica

De las Figs. 19 y 20 para la cepa LPT32 y LPT87 a las diferentes temperaturas

estudiadas, se obtiene la constante de velocidad de muerte k, que corresponde a la pendiente
de la recta, de acuerdo a la Fig. 6. Estos valores se encuentran en la Tabla 5.
En cuanto al valor de Dθ, éste es calcula de acuerdo a la ecuación 24.
Una vez determinados estos parámetros, para calcular el valor de z es necesario
conocer el valor de Q10 el cual se obtiene realizando el cuociente de dos constantes calculadas
para un ΔT=10 (ºC). En este caso se consideraron las constantes a 50 y 60 (ºC), en este
ejemplo, para la cepa 32:
0.7315
Q10   27.71
0.0264

97
Y por lo tanto el valor de z es:
10
z  6.93º C
log 27.71

98
Apéndice E. Evaluación económica.

Dado que la formulación de alimento para truchas con biomasa probiótica es una etapa
de proceso extra, se estimará el costo de producir dicha biomasa para 1Kg de alimento de
truchas.

E1. Cultivo de la biomasa probiótica.

Para elaborar 1Kg de alimento probiótico, se prepara 1 Lt de permeado de suero, como

medio de cultivo para cultivar la biomasa. El permeado de suero fue cotizado en Parmalat y
los aditivos, en Merck.

40 g   476 $ 
 Lt   kg   $ 
Costo del Permeado de Suero    19 
1000 g   Lt medio 
 kg 

5 g  18,488 $ 
 Lt   kg   $ 
Costo de Acetato de Sodio    92 
1000 g   Lt medio 
 kg 

6 g   61,039  $ 
 Lt   kg   $ 
Costo de Peptona de Caseína    366  
1000  g   Lt medio 
 kg 

3 g  121,749  $ 
 Lt   kg 
Costo de Extracto de Levadura    365 $ 

 Lt medio 

1000  g 
 kg 


1 mL   63,542 $ Lt
Lt

tween 
  64 $ 
1000mL 
Costo Tween 80   
Lt  Lt medio 

99
 2 g   22,277 $ 
 Lt   Kg   $ 
Costo Di  Hidrógeno Fosfato de Potasio    46 
1000 g   Lt medio 
 kg 

0.2 g   20,522 $ 
 Lt   kg   $ 
Costo del Sulfato de Manganeso   4 
1000 g   Lt medio 
 kg 

0.01 g   23,844 $ 
 Lt   kg   $ 
Costo del Sulfato de Magnesio   0.2 
1000 g   Lt medio 
 kg 

Por otro lado, el costo de 1Kg de lactasa es de $113050. 1 mL de lactasa equivales a

1.1543 gr y para hidrolizar 1 Lt de perneado se requieren 0.35 mL de lactasa. Esto se traduce
en:


0.35 mL
Lt
 1.1543 g  113,050 $ kg   $ 
Costo Lactasa   46 
1 mL 1000 g   Lt medio 
 kg 
Por lo tanto, el costo del medio perneado de suero corresponde a todos los costos
anteriores, y corresponde a:
 $ 
Costo Medio Permeado de Suero  1003 
 Lt medio 
En otras palabras, el costo de formular alimento probiótico tiene un costo adicional al
proceso ya existente de 1003 [$/Kg de alimento].

E2. Suspensión biomasa probiótica

La biomasa cosechada del litro de medio preparado, y posteriormente centrifugada, se

suspende en 40 mL de solución al 1% de Peptona de Caseína y Leche Descremada.

100
 40 mL   1 g   61,039 $ 
 kg a lim ento   kg   $ 
Costo de Peptona de Caseína   2 .
1000 mL  1000 g   kg a lim ento 
 Kg 

40mL   1 g   4,687 $ 
 kg a lim ento   kg   $ 
Costo Leche Descremada   0,2 
1000 mL   1000  g   kg a lim ento 
 kg 
Por lo tanto, el costo de la suspensión de biomasa es bajísimo, y equivale a 2 [$/kgalimento].

E3. Costo total

El costo total que se debe invertir para producir la biomasa suficiente para asegurar una
concentración de biomasa de al menos 109 ufc/g de alimento, es de 1005 [$/kg de alimento],
esto sin dimensionar equipos tales como: fermentador, equipos de separación centrífugos,
bombas, etc., que no son objetivos de esta memoria, pero que se deberán estimar para efectos
del proyecto de la que ésta forma parte.

101
 Índice

1 INTRODUCCIÓN..........................................................................................................................1

2 OBJETIVOS.................................................................................................................................3
2.1 OBJETIVO GENERAL..................................................................................................................3
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS...........................................................................................................3
3 ANTECEDENTES GENERALES..............................................................................................4
3.1 ALIMENTOS FUNCIONALES.......................................................................................................4
3.2 PROBIÓTICOS............................................................................................................................6
3.2.1 Bacterias Ácido Lácticas...................................................................................................7
3.3 MÉTODOS DE PRESERVACIÓN DE CULTIVOS BACTERIANOS.....................................................10
3.3.1 Microencapsulación........................................................................................................10
3.4 SECADO CONVECTIVO DE BACTERIAS.....................................................................................13
3.4.1 Consideraciones generales..............................................................................................13
3.4.2 Secado por atomización (spray)......................................................................................16
3.4.3 Lecho fluidizado..............................................................................................................17
3.4.4 Factores que influyen en la sobre vivencia de bacterias al secado convectivo................18
3.4.5 Estabilidad durante el almacenamiento..........................................................................22
3.5 OPERACIONES DE SECADO......................................................................................................23
3.5.1 Secadores a vacío............................................................................................................23
3.6 TEORÍA Y MECANISMO DEL SECADO.......................................................................................24
3.6.1 Curva de rapidez de secado.............................................................................................24
3.6.2 Velocidad de deshidratación............................................................................................27
3.7 CINÉTICAS DE REACCIÓN DE DEGRADACIÓN DE MICROORGANISMOS....................................30
3.7.1 Principios generales........................................................................................................30
3.7.2 Efecto del tiempo sobre la velocidad de reacción...........................................................30
3.7.3 Efecto de la temperatura.................................................................................................34
4 MATERIALES Y MÉTODOS...................................................................................................36
4.1 MATERIALES...........................................................................................................................36
4.1.1 Cultivo bacteriano...........................................................................................................36
4.1.2 Químicos.........................................................................................................................36
4.1.3 Medios.............................................................................................................................37
4.1.4 Equipos e Intrumentos.....................................................................................................38
4.2 MÉTODOS................................................................................................................................40
4.2.1 Activación del cultivo microbiano...................................................................................40
4.2.2 Determinación de la resistencia al estrés térmico...........................................................40
4.2.3 Determinación de la resistencia al estrés osmótico y químico.........................................40
4.2.4 Crecimiento de la cepa en fermentadores de 3L..............................................................41
4.2.5 Tratamiento térmico del alimento para truchas...............................................................41
4.2.6 Adición de biomasa al alimento para truchas.................................................................42
4.2.7 Operaciones de secado....................................................................................................43
4.2.8 Rehidratación del producto seco.....................................................................................47
4.2.9 Diagrama de flujo del procedimiento experimental.........................................................48
5 RESULTADOS Y DISCUSIÓN.................................................................................................49
5.1 TRATAMIENTO TÉRMICO DEL ALIMENTO PARA TRUCHAS.......................................................49

102
 5.2 RESISTENCIA TÉRMICA...........................................................................................................50
5.3 DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS DE DESTRUCCIÓN TÉRMICA......................................51
5.4 RESISTENCIA A UN AUMENTO EN LA OSMOLARIDAD DEL MEDIO...........................................54
5.5 RESISTENCIA AL PH................................................................................................................58
5.6 CINÉTICAS DE CRECIMIENTO FRENTE A UN ESTRÉS TÉRMICO INICIAL...................................60
5.7 COMPARACIÓN ENTRE LAS CINÉTICAS DE CRECIMIENTO DE 32 Y 32MUT................................62
5.8 SECADO DE ALIMENTO PARA TRUCHAS SIN BIOMASA PROBIÓTICA........................................65
5.9 SECADO DE ALIMENTO PARA TRUCHAS CON BIOMASA PROBIÓTICA.......................................66
5.10 BALANCES EN EL SECADOR DE LECHO FLUIDIZADO.............................................................71
5.11 ALMACENAMIENTO DEL PRODUCTO FRESCO Y DESHIDRATADO.............................................73
5.12 CONCENTRACIÓN DE LA BIOMASA PROBIÓTICA EN EL ALIMENTO Y COSTO DE PRODUCIRLA.
80
6 CONCLUSIONES......................................................................................................................82

7 RECOMENDACIONES............................................................................................................84

8 REFERENCIAS..........................................................................................................................85

9 APÉNDICE.................................................................................................................................88
APÉNDICE A. TINCIÓN DE GRAM.........................................................................................................88
APÉNDICE B. DETERMINACIÓN DE LA VIABILIDAD DE LAS CÉLULAS.................................................89
B1. Preparación de placas petri con LAPTg................................................................................89
B2. Siembra en placas para recuentos de colonias viables..........................................................89
B3. Conteo de colonias viables en ufc/mL....................................................................................89
APÉNDICE C. TABLAS DE DATOS Y GRÁFICOS ANEXOS.......................................................................91
C.1 Gráficos para para determinar Uexp....................................................................................91
C2. DO y pH.................................................................................................................................92
APÉNDICE D. EJEMPLO DE CÁLCULO...................................................................................................95
D1. Balance de materia y energía en el secador de lecho fluidizado ........................................95
D2. Determinación de la cantidad de biomasa por gramo de alimento.......................................97
D3. Determinación de los parámetros de destrucción térmica.....................................................97
APÉNDICE E. EVALUACIÓN ECONÓMICA..............................................................................................99
E1. Cultivo de la biomasa probiótica...........................................................................................99
E2. Suspensión biomasa probiótica............................................................................................100
E3. Costo total............................................................................................................................101

103
 Índice de Tablas

Tabla 1: Alimentos funcionales. Ejemplos de probióticos, prebióticos y simbióticos……………......…..5

Tabla 2: Efectos benéficos nutricionales y para la salud de alimentos funcionales preparado con
bacterias probióticas
……………………………………………………………………………………………....8
Tabla 3: Materiales de encapsulación de ingredientes alimenticios………………………………...…….12
Tabla 4: Lista de procesos de encapsulación tipo A y B……………………………………......…………..13
Tabla 5: Parámetros de resistencia térmica y osmótica de microorganismos asociados a materias
primas y productos de pesquería.............................................................................................................33
Tabla 6: Químicos aplicados en los experimentos................................................................................ 36
Tabla 7: Parámetros cinéticos de destrucción térmica para las cepas 32 y 87.....................................52
Tabla 8: Parámetro Z en el rango 50-60ºC para las cepas estudiadas..................................................52
Tabla 9: Tiempo de secado teórico.........................................................................................................71
Tabla 10: Parámetros determinados experimentalmente.......................................................................71
Tabla 11: Datos del sistema de lecho fluidizado y del alimento con biomasa probiótica.....................95

104
 Índice de F iguras

Figura 1: Lactobacillus……………………………………………………………………………………………6
Figura 2: Bifidobacterium………………………………………………………………………………………...7
Figura 3: Secador por atomización............……………………………………………………………………
17
Figura 4: Esquema típico de un secador de lecho fluidizado industrial…………. ……………………....18
Figura 5: Secador rotatorio a vacío……………………………………………………………………………24
Figura 6: Curva de secado en condiciones constantes………………………………………………………25
Figura 7: Curva típica de rapidez de secado, condiciones
constantes…………………………………….25
Figura 8: Variación de la concentración de microorganismos en el tiempo....…………………………..31
Figura 9: Determinación de la constante de velocidad de muerte de microorganismos...................….32
Figura 10: Determinación del valor
z.....................................................................................................35
Figura 11: Cepario con cepas de truchas, entre ellas LPT32 y LPT87……………………………………36
Figura 12: Secador rotatorio a vacío .....……………………………………………...................................38
Figura 13: Secador de lecho fluidizado ................................
……………………………………………….38
Figura 14: Fermentador de Vidrio……………………………………………………………………………. 39
Figura 15: Sistema de pasteurización………………………………………………………………………….41
Figura 16: Elaboración de alimento con biomasa probiótica en molinillo esterilizado………………..42
Figura 17: Procedimiento de secado de lactobacillus con actividad probiótica………………………...48
Figura 18: Viabilidad en función del tiempo para las cepas estudiadas a distintas Tº......……………..50
Figura 19: Variación de las ufc en función del tiempo para la cepa 32…………………………………..51
Figura 20: Variación de las ufc en función del tiempo para la cepa 87………………..…………………51
Figura 21: Curva de crecimiento de la cepa 32 ante un cambio en la osmolaridad del medio………..54
Figura 22: Densidad Óptica de la cepa 32 frente a un cambio en la osmolaridad del medio…………
54
Figura 23: Variación del pH del medio en función del tiempo para la cepa 32 ante un cambio en la
osmolaridad del medio……………………………………………………………………………………………55
Figura 24: Cinética de crecimiento de la cepa 87 frente a un cambio en la osmolaridad del medio....56
Figura 25: Densidad Óptica de la cepa 87 frente a un cambio en la osmolaridad del medio…………
56

105
Figura 26: Variación del pH del medio en función del tiempo para la cepa 32 ante un cambio en la
osmolaridad del medio……………………………………………………………………………………………57
Figura 27: Viabilidad en función del tiempo para la cepa 32 frente a una disminución de pH del
medio………………………………………………………………………………………………………………..58
Figura 28: Viabilidad en función del tiempo para la cepa 87 frente a una disminución de pH del
medio………………………………………………………………………………………………..………………59
Figura 29: Viabilidad en función del tiempo para la cepa 32, con y sin estrés térmico a 55ºC……….60
Figura 30: Viabilidad en función del tiempo para la cepa 87, con y sin estrés térmico a 55ºC……….60
Figura 31: Cinéticas de crecimiento de la cepa 32 y 32MUT en MRS………………………………………62
Figura 32: Cinéticas de crecimiento de la cepa 32 y 32MUT en Permeado de suero………………..……62
Figura 33: Cinéticas las cepas 32 y 32MUT con cambio osmótico en MRS.....…………………………….63
Figura 34: Cinéticas de crecimiento de la cepa 32 y 32MUT con cambio de pH en MRS.......................63
Figura 35: Curva de secado para alimentos de distinto diámetro sin biomasa probiótica...…………..65
Figura 36: Secado de alimento con biomasa probiótica de 2 mm en lecho fluidizado .........................66
Figura 37: Secado de alimento con biomasa probiótica de 2 mm en secador a vacío........
…………….66
Figura 38: Secado de alimento con biomasa probiótica de 4 mm en secador de lecho fluidizado .…..69
Figura 39: Secado de alimento con biomasa probiótica de 4 mm en secador rotatorio a vacío. .........69
Figura 40: Secado de alimento con biomasa probiótica de 2mm y 4 mm en secador vacío y secador
de lecho fluidizado…………………...................……………………………………………….
…………………..70
Figura 41: Curva de viabilidad del producto probiótico fresco almacenado a 4ºC….………………….73
Figura 42: Viales de vidrio utilizados para almacenar producto probiótico seco………………….……74
Figura 43: Viabilidad del producto probiótico seco almacenado………………………………………….74
Figura 44: Curvas de viabilidad en función del tiempo para la biomasa con 72 horas de cultivo…....76
Figura 45: Curvas de viabilidad en función del tiempo para la biomasa estresada con sal……………
76
Figura 46: Viabilidad del alimento probiótico seco de 2 mm (biomasa con 72 hrs. de cultivo)
almacenado…………………………………………………………………………………………………………
77
Figura 47: Viabilidad del alimento probiótico seco de 4 mm (biomasa con 72 hrs. de cultivo)
almacenado…………………………………………………………………………………………………………
77

106
Figura 48 Viabilidad del alimento probiótico seco de 2 mm (biomasa estresada con NaCl en la etapa
de cultivo)
almacenado…………………………………………………………………………………………...78
Figura 49: Viabilidad del alimento probiótico seco de 4 mm (biomasa estresada con sal en la etapa de
cultivo)
almacenado……………………………………………………………………………………………….78
Figura 50: Proceso actual de elaboración de alimento para truchas……………………………………..80
Figura 51: Proceso propuesto en esta memoria para elaborar alimento probiótico para truchas……81
Figura 52: Placas de LAPTg con crecimiento de colonias viables………………………………………...90
Figura 53: Gráfico para determinar tiempo de deshidratación en período de velocidad decreciente.
Alimento de
2mm…………………………………………………………………………………………………..91
Figura 54: Gráfico para determinar tiempo de deshidratación en período de velocidad decreciente.
Alimento de 4
mm………………………………………………………………………………………………….92
Figura 55: Variación de la Densidad Óptica en el tiempo de la cepa 32 y 87 con estrés térmico
inicial......................................................................................................................................................92
Figura 56: Variación del pH del medio en función del tiempo para las cepas 32 y 87 con un estrés
térmico
inicial……………………………………………………………………………………………………...93
Figura 57: DO (540 nm) en función del tiempo para las cepas 32 y 87 ante una disminución del pH
del medio……………………………………………………………………………………………………………
93
Figura 58 Variación del pH del medio en función del tiempo para las cepas 32 y 87 ante una
disminución del pH del medio…………………………………………………………………………………...94

107
Universidad de Concepción
Facultad de Ingeniería
Departamento de Ingeniería Química

Profesor Patrocinante:
Dr. Rodrigo Bórquez Y.

Estudio del secado de Lactobacilos con actividad

probiótica

Natalia Valentina Toledo Aguilar

Informe de Memoria de Título

para optar al Título de

Ingeniero Civil Químico

Concepción, Marzo 2006.

108
 Secado de Lactobacilos probióticos para la formulación de
alimentos para uso acuícola

N. Toledo, C. Melo, J. Ferrer,1R. Bórquez

Univ. de Concepción, Dep. Chemical Engineering, P.O.Box 160-Correo 3, Concepción,
Chile; 1e-mail: rborquez@udec.cl

Las enfermedades constituyen un factor limitante en el desarrollo de la producción de

especies animales para el consumo humano, de allí que se buscan herramientas de control en
el tratamiento de patologías infecciosas. Bajo este principio ha surgido el empleo de
microorganismos benéficos llamados probióticos, como control biológico en la prevención de
ataques bacterianos.
En este trabajo se estudió la incorporación de una cepa probiótica en la dieta de Trucha
Arcoiris para la formulación de un producto deshidratado estable en el tiempo. Se estudiaron
dos cepas: LPT32 y LPT87, Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum, respectivamente,
provenientes del tracto gastrointestinal de peces de la Octava Región de Chile. Con respecto a
sus propiedades tecnológicas: resistencia térmica, resistencia a un estrés salino y a un estrés
ácido, los resultados indican que ambas cepas son resistentes ante estas modificaciones de su
medio ambiente natural. La potencialidad tecnológica de estos microorganismos confirma que
es posible someterlos a operaciones unitarias, con el fin de obtener un producto probiótico
estable. Sin embargo, de acuerdo a ensayos in vitro e in vivo efectuados en paralelo por el
grupo de Biología (Proyecto Innova Bío-Bío 03B1-205-L1), indicaron que la cepa LPT32
poseía mejores propiedades probióticas que la cepa LPT87. Los estudios posteriores de
secado, por consiguiente, fueron realizados con LPT32.
Se logró formular un alimento funcional para dietas acuícolas, con una concentración
de 108 - 109 Ufc/g y una humedad del 40%, que luego fue sometido a dos tipos de secado: en
lecho fluidizado y a vacío. Una etapa de pasteurización, por 45 minutos a 60ºC, fue necesaria
para reducir la flora microbiana del alimento, sin generar destrucción o pérdida de su calidad
nutricional. En la etapa de incorporación de la biomasa al alimento, fue necesario incluir una

109
etapa de dosificación para poder obtener una mezcla homogénea, libre de contaminación, y
que mantuviera su viabilidad.
Los estudios de secado efectuados indican que es posible desarrollar un producto
estable en el tiempo (secado en lecho fluidizado, secado a vacío). Para las 2 tecnologías de
secado ensayadas se obtuvieron productos con una alta viabilidad, manteniendo el 100% de
viabilidad por efecto del proceso (108-109 Ufc/g), deshidratando el producto hasta un 5% de
humedad, aproximadamente. A pesar de que la etapa de secado no afecta la viabilidad del
microorganismo, esta sí se ve afectada durante la etapa de almacenamiento a temperatura
ambiente (25ºC) y no así a 4ºC.
Se efectuaron ensayos de secado con microorganismos estresados con NaCl en la etapa
de cultivo, además de la modificación en el tiempo de cosecha de los microorganismos, de 48
horas a 72 horas, para evaluar el efecto sobre su resistencia al almacenamiento a temperatura
ambiente. Los resultados de estos ensayos indican que el producto seco mantiene su viabilidad
almacenado a 4ºC, y también mantiene su viabilidad a temperatura ambiente. Esto indica que
las dos alternativas aplicadas influyen en la sobrevivencia de estos microorganismos a una
etapa de secado, siendo la modificiación en el tiempo de cosecha la alternativa que entrega
mejores resultados.
Por último, del análisis de los datos experimentales en los ensayos de secado en lecho
fluidizado, se obtuvo que el coeficiente de transferencia de calor a 40ºC para el alimento de 2
mm de diámetro corresponde a 20.5 W/m2K, y para el alimento de 4 mm, a 36 W/m2K.

Palabras claves: Secado, lactobacilos, probióticos, trucha arcoiris, alimento.

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Nomenclatura

A : superficie de evaporación, m2.

Ap : superficie de una partícula, m2.
d : diámetro, m.
dk : diámetro característico, m.
D : tiempo de reducción decimal de microorganismos, min.
fa : factor de corrección, correlación de Gnielinski.
hc : coeficiente de transferencia de calor por convección, Jm-2K-1.
k : constante de velocidad de muerte celular.
kaire : conductividad del aire, Wm-1K.
Kg : coeficiente de transferencia de masa, kg m-2 s-1.
l : longitud, m.
M : número de microorganismos o concentración a tiempo t.
mc : velocidad de deshidratación, kgs-1.
M0 : cantidad inicial de microorganismos o concentración inicial.
N : rapidez de secado, kg s-1 m-2.
Nu : Número de Nusselt, adimensional.
Nulam : Nusselt laminar.
Nuturb : Nusselt turbulento.
Nuesferas : Nusselt para partículas esféricas.
Pr : Número de Prandtl, adimensional,
Q : velocidad de transferencia de calor, Js-1.
Q10 : constante de incremento de la velocidad de reacción ante un aumento de 10ºC.
Re : Número de Reynolds, adimensional.
t : tiempo, min.
V : volumen de la cámara que contiene las partículas, m3.
VF : volumen total de partículas que ocupan el lecho, m3.
X : humedad en base húmeda, kg humedad kg  sólido seco-1.
X* : humedad crítica en base húmeda, kg humedad kg  sólido seco-1.
Ya : humedad del aire, kg de vapor por kg de aire seco.
Ys : humedad de saturación, kg vapor de agua  kg de aire seco.

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Caracteres griegos

 : Difusividad térmica, m2s.

 : calor latente de vaporización a la temperatura de bulbo húmedo, J kg -1.
 : viscosidad, cP.
a : media aritmética de la temperatura de bulbo seco del aire del deshidratador, ºC.
s : media aritmética de la temperatura de bulbo húmedo del aire del deshidratador, ºC.
 : densidad, kgm-3.
 : porosidad del lecho, adimensional.

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