UNIVERSIDAD PEDAGÓGICA NACIONAL

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS
PROFESOR RODRIGO RODRÍGUEZ CEPEDA
QUÍMICO MSc. MBA; Dr

SISTEMAS BIOQUÍMICOS
PRÁCTICA 1

OBJETIVOS

 Extracción de proteínas por el método de Osborne y Mendel

 Determinación y Cuantificación de proteínas por el método Kjeldahl, Biuret y UV

Material Reactivos
 Espátula  Harina (Trigo, avena)
 2 Vidrio de reloj Homogeneizada
 Equipo automático (digestor y  NaCl 1%
destilador)  Etanol 75%
 1 pipeta de 1 mL  NaOH 0.1 N
 2 Pipetas de 10 mL  Ácido Sulfúrico H2SO4 98%
 1 pipeta de 5 mL  Ácido Bórico H3BO4 4%
 4 Matraces aforados 100 mL  Indicador Tashiro
 Pinza para bureta  Ácido clorhídrico HCl 0.1 N
 Soporte universal  Reactivo Biuret
 Bureta 50 mL  Patrón albúmina de huevo 5mg/ml
 Espectrofotómetro
 19 tubos de ensayo
 Equipo de Centrifugado.
 Beaker de 200 mL
 Frasco lavador
 Escobilla
 Agitador de vidrio

MARCO TEÓRICO

¿Qué son las proteínas?

Son Macromolécula formada por una larga cadena lineal de aminoácidos unidos por enlaces
peptídicos. Las proteínas se despliegan adquiriendo una configuración tridimensional, lo que
junto a los aminoácidos que la componen determina su actividad y función biológica. En un
organismo los genes codifican una gran cantidad de proteínas distintas.

Funciones de las proteínas:

Cada proteína tiene una función específica: estructural, enzimática, reguladora, transportadora,
defensiva, etc. Por ejemplo: la hemoglobina es una proteína que transporta el oxígeno en la
sangre, los anticuerpos son proteínas defensivas, la insulina regula el nivel de azúcar en sangre,
la miosina y actina son proteínas musculares, etc. (Bertran, 2015)

Clasificación

Además de la clasificación en fibrosas y globulares o en simples y conjugadas. Las proteínas

globulares se pueden subdividir, según Osborn, de acuerdo con su solubilidad en:

 Albúminas: Son proteínas solubles en agua y en soluciones salinas; precipitan a altas

concentraciones de sales, 80%S (porcentaje de solubilidad). Ejemplo: (NH4)2.SO4,
Na2SO4 y están ampliamente distribuidos en tejidos animales y vegetales (albúmina de
huevo, albúmina sérica).

 Globulinas: Son insolubles en agua y solubles en soluciones salinas diluidas (NaCI 1%);
precipitan a concentraciones medianas de sales (40 a 50%) y se encuentran
prácticamente en todos los tipos de células y tejidos.

 Prolaminas: Insolubles en agua y soluciones salinas; son solubles en etanol 50-90% y se

encuentran sólo en vegetales (ej: zeína de maíz, hordeina de la cebada, gliadina del
trigo). Son ricas en Glu y en Pro (10%).

 Glutelinas: Solo se solubilizan en ácidos o bases diluidos; están presentes solo en tejidos
vegetales (gluten del trigo) y tienen buenos contenidos de CySH o CySSCy. (UNAD, 2011)

Solubilidad de las Proteínas

Dado que la proteína tiene varios grupos cargados, su solubilidad depende de la concentración
de sales disueltas, la polaridad del solvente, el pH y la temperatura. Algunas de estas variables
o todas ellas pueden manipularse para precipitar de manera selectiva algunas proteínas,
mientras que otras permanecen disueltas.

La solubilidad de una proteína en una concentración baja de iones aumenta a medida que se
agrega sal, un fenómeno llamado Salting in. Los iones adicionales ocultan las numerosas cargas
iónicas de la proteína debilitan así las fuerzas de atracción entre moléculas individuales de
proteína y (estas fuerzas pueden llevar a la agregación y la precipitación). Sin embargo, si se
agrega más sal, en especial si se usan sales de sulfato, la solubilidad de la proteína disminuye
nuevamente. Este efecto de Salting out es resultado sobre todo de la competencia entre los
iones de la sal agregados y los otros solutos disueltos por las otras moléculas del solvente. A
concentraciones muy elevadas de sal, muchos de los iones agregados están solvatados y, por lo
tanto, hay una cantidad significativamente menor de solvente disponible para disolver otras
sustancias, incluso proteínas. (Voet, Voet, & Pratt, 2009)

Variables de solubilidad

La solubilidad de las proteínas depende de varios factores:

 pH: A mayor interacción con el solvente mayor será la solubilidad, por esto en el pl
(donde la carga neta es cero) la solubilidad es mínima.
  Fuerza Iónica (μ) de la solución: La mayoría de las proteínas presenta un
comportamiento como el ilustrado en la figura 17, donde se grafica el logaritmo de la
solubilidad en función de la fuerza iónica:

Figura 17: Solubilidad de las proteínas en función de la fuerza iónica

Fuente: Pérez, G. Navarro Y. (1992). Bioquímica. Santa fe de Bogotá.: Unisur.
(ILUSTRACION TOMADA DE (UNAD, 2011))

Esta curva permite deducir la ecuación que rige la solubilidad:

Donde β' (intersección por extrapolación al eje y) representa la solubilidad (teórica para
proteínas diferentes a las albúminas) en agua pura y K'sμ (pendiente de la recta) es un
parámetro cuyo valor es característico para cada proteína. Se observa que la solubilidad
aumenta rápidamente al incrementar la fuerza iónica (salting out). Esto explica por qué las
albúminas y las globulinas precipitan con (NH4)2.SO4 al 80% y al 50% de saturación
respectivamente.

 Temperatura: En el intervalo 0-60°C la solubilidad aumenta al aumentar la temperatura

pero a valores superiores las proteínas precipitan debido a que la energía térmica es
suficiente para destruir los enlaces no covalentes que estabilizan la estructura terciaria,
exponiendo al solvente los grupos R hidrofóbicos del interior y puesto que estos no
interactúan apreciablemente con el agua, precipitándose.

 Solventes orgánicos miscibles con el agua: Estos solventes (etanol, acetona, metanol)
disminuyen la constante dieléctrica del solvente acuoso y por tanto causan la
precipitación. Para que la proteína permanezca en solución se requiere, como en el caso
de las Prolaminas, que tenga una composición en aminoácidos muy particular. (UNAD,
2011)
PROCEDIMIENTOS:
PESAR 2g ± 0,1 mg de harina (trigo, avena)
Previamente homogenizada

Adicionar H2O relación

1:5 p/v
Repetir

Agitar 10 min. En vortex

Centrifugar a 2500 rpm

Residuo Sobrenadante: mezclar las dos

extracciones y aforar a 25 mL con
agua(Albúminas)

Adicionar NaCl 1%
relación 1:5 p/v
Repetir
Agitar 10 min. En vortex
Centrifugar a 2500 rpm.

Residuo Sobrenadante: mezclar las dos

Extracciones y aforar a 25 mL con
NaCl 1% (Globilinas)

Adicionar Etanol 75%

Relación 1:5 p/v

Repetir

Agitar 10 min. En vortex

Centrifugar a 2500 rpm

Residuo Sobrenadante: mezclar las dos

Extracciones y aforar a 25 mL con
Etanol 75 % (Prolaminas)

Adicionar NaOH 0,1 N

Relación 1:5 p/v

Repetir
 Agitar 10 min. En vortex
Centrifugar a 2500 rpm.

Residuo Sobrenadante: mezclar las dos

Extracciones y aforar a 25 mL con
NaOH 0,1 N (Glutelinas)

Método Kjeldahl

Tomar 1 mL de cada extracto o

Pesar máximo 1 g ± 0.1 mg de harina

Llevar a un balón digestor Kjeldahl

Y adicionar 2 a 4 g de mezcla
Catalítica

Adicionar 10 mL de H2SO4 98 %
Llevar al digestor hasta obtener
Una solución translúcida

Enfriar y adicionar agua hasta el

Doble del volumen

Destilar y recoger el destilado en 10 mL de

H3BO4 al 4 % con indicador Tashiro

Recoger hasta ≈ 100 mL de destilado

Titular con HCl 0,1 N estandarizado.

Método Biuret:

En nueve tubos de ensayo preparar las siguientes mezclas:

Tubo/Reactivo B 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Patrón ------- 0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 1,2 1,5 ------- -------
albúmina mL - -
Extracto mL ------- ------- ------- ------- ------- ------- ------- ------- 0,5 1,0
Agua mL 2,0 1,9 1,7 1,5 1,3 1,1 0,8 0,5 1,5 1,0
Biuret mL 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0
En los tubos 8 y 9 se puede adicionar cualquiera de los extractos de la harina.

Mezclar y reposar 30 min.

Leer A a 540 nm
Elaborar gráfica A vs. C

Método Ultravioleta

En ocho tubos de ensayo preparar las siguientes mezclas:

Tubo/Reactivo B 1 2 3 4 5 6 7 8
Patrón ------- 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 -------- --------
albúmina mL
Extracto mL ------- ------- ------- ------- ------- ------- ------- 0,5 1,0
NaCl 1% mL 5,0 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 3,8 4,5 4,0

En los tubos 7 y 8 se puede adicionar cualquiera de los extractos de la harina.

Mezclar.

Leer A a 280 nm
Elaborar gráfica A vs. C
Bibliografía
Bertran, A. A. (12 de Febrero de 2015). Enciclopediasalud.com. Recuperado el 27 de Febrero de
2016, de http://www.enciclopediasalud.com/definiciones/proteina

UNAD. (2011). Bioquimica. Recuperado el 26 de Febrero de 2016, de

http://datateca.unad.edu.co/contenidos/201103/201103/leccin_10_clasificacin_y__pr
opiedades_fisicoqumicas.html

Voet, D., Voet, J., & Pratt, C. (2009). Fundamentos de Bioquimica. Madrid: panamericana.