Validacion de Metodos de Ensayo - Aymee Luis-Collantes PDF

UNIVERSIDAD DE LA HABANA
INSTITUTO DE FARMACIA Y ALIMENTOS
Validación de métodos de
ensayos químicos para la
determinación de residual de
sulfitos en mariscos
Tesis presentada en opción al Título Académico de
Master en Ciencia y Tecnología de los Alimentos
Autora: Lic. Aymeé Luis Collantes
Tutores: Dr. C. Manuel Alvarez Gil

Dr. C Manuel Alvarez Prieto
Colaboradora: Lic. Carmen Wong Wong
La Habana
2010
¨ Invertir en conocimientos produce siempre los mejores
beneficios. ¨
Benjamín Franklin
Dedicatoria
El esfuerzo realizado para la culminación de este estudio compromete a muchos

compañeros, amigos y familiares que durante largo tiempo aportaron
desinteresadamente un granito de arena en cada fase de trabajo; y de forma
general en esta pequeña dedicatoria quiero agradecerles a todos, no solo por su
ayuda, sino también por su amistad.
En primer lugar a todos los profesores del IFAL que contribuyeron a mi formación,
de quienes guardo los mejores recuerdos. A los tutores de este trabajo, con
nombre común (Manolo). Que no desistieron a pesar de todas las dificultades
afrontadas; a ellos el mas sincero reconocimiento y mi consideración.
A mis padres por su ayuda, un agradecimiento profundo de mi parte; en especial a

mi padre que nunca dejaré de valorar su apoyo y los consejos brindados.
Agradezco también a sus compañeros de trabajo Ofelita, Díaz y Carmita.
A todos mis compañeros de trabajo en PRODAL, principalmente los técnicos de

Laboratorio: Eva, Georgina, Marta y Frank, que se esforzaron día a día bajo
condiciones difíciles. Mi más merecido respeto hacia ellos.
A todos los técnicos del Laboratorio de Química del Centro de Investigaciones

Pesqueras: Mayito, Aidita, Ofelia, Cristi, Paulina, Marvelis y Josefina, sin cuyo
esfuerzo no se hubieran obtenido la mayoría de los resultados.
A la encomiable labor de Carmen Wong, la china, trabajadora incansable; mujer a

quien admiro en su humildad, amistad, amor y sentido de pertenencia.
A Lourdes Nodarse, amiga intachable, maestra y guía de muchos jóvenes

profesionales, quien supo guiar mis pasos en todo momento.
A mis amigos de siempre y otros más nuevos que supieron alentarme y brindarme
su apoyo incondicional: Mirlis, Marlene, Laurita, Osvaldo Puñales, Yamilet, Marilu.
Y finalmente dedico este trabajo a la memoria de mi abuelo Antonio Polo Flores,

cuyo espíritu inteligente, lleno de conocimiento y abierto siempre al aprendizaje,
supo inculcarme desde muy pequeña el amor a la sabiduría. Siempre estarás
conmigo.
Gracias a todos.
RESUMEN
La afectación de la calidad de los crustáceos debida al ennegrecimiento de su masa corporal

causado por el proceso de melanosis, ha sido una de las principales líneas de trabajo de la
industria procesadora de mariscos. Esto, unido a la necesidad de encontrar un preservante que
inactive este proceso y no perjudique la salud del consumidor, ha constituido esfera de trabajo
de numerosos investigadores a nivel mundial y en Cuba.
La industria pesquera en Cuba ha generalizado el uso del aditivo metabisulfito de sodio como
una de las tecnicas de prevencion contra la melanosis, controlando su concentración exacta a
través de las normas de proceso que norman los niveles a utilizar para camarón y langosta. El
problema consiste entonces en controlar que no exceda los límites establecidos.
Los objetivos planteados estuvieron dirigidos a evaluar el cumplimiento de los criterios de

validación en la determinación de residual de metabisulfito en mariscos por tres métodos de
ensayo químico: Microdifusión, Destilación Directa y Destilación Rápida. Además se
determinó la Incertidumre de cada uno.
El proceso de validación para todos los métodos de ensayo se realizó según lo establecido en
la NC TS- 368:2004, evaluándose los parámetros correspondientes.
Como resultado de los ensayos realizados se demostró que los métodos por Destilación
Rápida y Destilación Directa satisfacen los criterios de validación establecidos, mientras que el
método por Microdifusión no cumplió con las especificaciones planteadas en la norma para los
parámetros precisión y veracidad; demostrando así que el método debe ser revisado y
sometido a cambios en su operatoria que permitan lograr una mayor calidad de ensayo durante
su realización.
Se demostró la factibilidad de los métodos validados para ser utilizados en los laboratorios
como ensayos de rutina en el control de la calidad del residual de metabisulfito en la industria
pesquera.
ÍNDICE DE CONTENIDOS
Resumen
Introducción____________________________________________1
Capitulo 1 Revisión Bibliográfica____________________________5
1.1 La Pesca y su industrialización____________________5
1.1.1 Principales rubros exportables____________________ 5
1.2 Crustáceos. Generalidades_______________________6
1.2.1 Langosta_____________________________________ 6
1.2.1.1 Caracterización física____________________________7
1.2.1.2 Caracterización nutricional________________________7
1.2.2 Camarón______________________________________8
1.2.2.1 Caracterización física____________________________ 9
1.2.2.2 Caracterización nutricional________________________ 10
1.2.3 Especificaciones de calidad de los crustáceos_________10
1.3 Aditivos alimentarios. Sulfitos______________________ 10
1.3.1 Generalidades__________________________________ 10
1.3.2 Sulfitos como aditivos alimentarios__________________ 11
1.3.3 Sulfitos para la conservación de crustáceos___________ 11
1.3.4 Toxicidad de los sulfitos__________________________ 13
1.3.5 Métodos para determinación de sulfitos en alimentos___ 14
1.4 Acreditación del Sistema de Gestión de la Calidad_____ 16
1.4.1 Aspectos generales______________________________ 16
1.4.2 Validación de métodos de ensayo__________________ 17
1.4.2.1 Tipos de validación______________________________ 20
1.4.3 Parámetros fundamentales de la validación__________ 20
1.4.3.1 Precisión______________________________________ 20
1.4.3.1.1 Repetibilidad __________________________________ 20

1.4.3.1.2 Reproducibilidad________________________________ 21
1.4.3.2 Especificidad __________________________________ 21
1.4.3.3 Linealidad_____________________________________ 21
1.4.3.5 Sensibilidad____________________________________ 22
1.4.3.6 Veracidad______________________________________ 22
1.4.3.7 Rango de concentración o de medición_______________23
1.4.3.8 Límite de detección______________________________ 23
1.4.3.9 Límite de cuantificación __________________________ 24
1.4.3.10 Robustez______________________________________ 24
1.4.4 Incertidumbre de las mediciones____________________ 24
Capitulo 2 Materiales y Métodos_________________ _________26

2.1 Productos seleccionados para el estudio___________________ 27
2.1.1 Langosta (entera, cola y pre-cocinada)____________________ 27
2.1.2 Camarón cola pelado y glaseado_________________________ 27
2.2 Muestras evaluadas___________________________________ 28
2.3 Métodos de ensayo a evaluar____________________________ 28
2.3.1 Método 1 Determinación de sulfitos por Microdifusión_________ 28
2.3.2 Método 2 Determinación de sulfitos por Destilación Directa_____ 29
2.3.3 Método 3 Determinación de sulfitos por Destilación Rápida._____30
2.4 Parámetros de validación________________________________30
2.4.1 Precisión_____________________________________________31
2.4.2 Especificidad__________________________________________32
2.4.3 Limite de detección____________________________________ 33
2.4.4 Límite de cuantificación________________________________ _33

2.4.5 Veracidad____________________________________________33
2.4.6 Sensibilidad___ _______________________________________35
2.4.7 Robustez_____________________________________________36
2.5 Incertidumbre de la medición_____________________________ 38
2.6 Análisis estadístico_____________________________________ 39
Capitulo 3 Resultados y Discusión______________________________ 41

3.1 Precisión____________________________________________ 41
3.1.1 Método 1 Microdifusion_________________________________ 41
3.1.2 Método 2 Destilación Directa_____________________________42
3.1.3 Método 3 Destilación Rápida ____________________________ 43
3.2 Límite de cuantificación ________________________________ 47
3.2.1 Método 1 Microdifusion _________________________________ 47
3.2.2 Método 2 Destilación Directa ____________________________ 47
3.2.3. Método 3 Destilación Rápida ____________________________ 47
3.3 Veracidad______________________:_____________________ 48
3.3.1 Método 1 Microdifusion ________________________________ 48
3.3.2 Método 2 Destilación Directa ____________________________51
3.3.3 Método 3 Destilación Rápida ___________________________ 54
3.4 Sensibilidad__________________________________________ 57
3.4.2 Método 3 Destilación Rápida __________________________ 58
3.5 Robustez____________________________________________60
3.5.2 Método 3 Destilación Rápida ___________________________ 62

3.6 Evaluación de la incertidumbre de cada método de ensayo ____ 64
3.7 Análisis integral de los métodos seleccionados ______________ 64
Conclusiones _______________________________________________66
Recomendaciones___________________________________________ 67
Referencias bibliográficas
Anexos
INTRODUCCIÓN
La pesca se considera como una de las profesiones más antiguas y es concebible que desde
tiempos remotos el hombre pescara para obtener parte de su alimentación. Aunque la cosecha
mundial de los recursos vivientes proviene de casi todas las aguas, el océano produce la mayor
cantidad, y los peces marinos encabezan la producción; un cálculo aproximado indica que el
90% de los peces y mariscos son extraídos directamente del océano o de los ríos cuando las
especies marinas dejan el mar para ir a desovar (Baisre, 2004).
En la actualidad, aproximadamente el 75% del peso del pescado y de los mariscos que se
capturan en todo el mundo se utiliza como alimento, por ser productos altamente nutritivos con
gran porcentaje de proteína animal fácilmente digerible (Baisre, 2004).
En Cuba, la obtención de los recursos pesqueros de su plataforma submarina y aguas oceánicas

adyacentes, y la explotación de diferentes ramas de la Acuicultura; constituyen actualmente
importantes actividades que, desde el punto de vista económico, son de las fundamentales y,
sobre todo, más eficaces fuentes generadoras de divisas del país (Baisre, 2004); mostrando una
tendencia creciente en los últimos años, siendo sus principales rubros exportables los productos
de langosta, camarón de mar y de cultivo. Además, se incursiona en la exportación de peces
frescos, pescado congelado y en diferentes formatos, jaiba y moluscos (Cubamar, 2006); donde
una cuestión relevante es la relativa a las exigencias de inocuidad y calidad para los productos
pesqueros, las que se incrementan en la actualidad (García, 2006).
Por ende, la importancia de la pesca está dada por su contribución en la oferta de estos
alimentos a la población y por sus exportaciones que aseguran ingresos para la economía del
país (CUBAMAR, 2009).
Formando parte del Ministerio de la Industria Alimentaria, la Industria Pesquera de Cuba opera
con cinco grupos empresariales que agrupan a 75 empresas distribuidas a todo lo largo y
ancho del archipiélago; dirigiendo la captura, cultivo, procesamiento y comercialización de los
recursos pesqueros sobre bases sostenibles (García, 2006; CUBAMAR, 2009).
1
INTRODUCCIÓN
El valor extraordinario que desde el punto de vista económico poseen muchos de los recursos
pesqueros de la plataforma submarina nacional y aguas oceánicas adyacentes, y la capacidad
de pesca que se ha creado en Cuba después de 1959, han influido sobremanera en el hecho
de que la mayor parte de los recursos pesqueros estén completamente explotados e, incluso,
que unos pocos hayan sido sobre explotados. La industria pesquera tradicional está integrada
por cooperativas de pescadores; no obstante, el Gobierno ha favorecido el desarrollo de una
gran flota pesquera. En 2001 la captura total fue de 110.330 toneladas siendo el marisco una
de sus mayores exportaciones (Baisre, 2004).
El pescado y los mariscos frescos son los productos que el hombre ha aprovechado como
alimento desde épocas muy remotas, sin embargo su susceptibilidad a la descomposición ha
sido una de las restricciones que han limitado su comercialización y aprovechamiento
(Cifuentes y col., 2006).
La problemática del ennegrecimiento de los crustáceos causado por el proceso de melanosis,

tanto en congelación como conservados en hielo, ha sido una de las principales líneas de
trabajo de la industria procesadora de mariscos. Esto unido a la necesidad de encontrar un
preservante que no perjudique la salud del consumidor, ha constituido esfera de trabajo de
numerosos investigadores a nivel mundial y en Cuba (Pérez, 1983).
El llamado pardeamiento enzimático o la formación de melanina, se produce como

consecuencia del ataque de una tirosinasa especifica a la tirosina, acelerándose con los
procesos de deshidratación y refrigeración de los crustáceos (Pérez, 1983).
Para ello se ha llevado a cabo la utilización de sulfito de sodio o potasio y ácido bórico en
crustáceos, dirigida a la prevención y control de la melanosis, que es uno de los mayores
problemas relacionados con su comercialización (EUSKADINET, 2006).
En Cuba, un trabajo realizado en el Centro de Investigaciones del MIP demostró la eficacia del
metabisulfito de sodio o potasio en comparación con un antioxidante comercial: Biostop MC, el
cual arrojó similares resultados que el primero; comprobándose que el costo e inestabilidad de
este último son mayores (Nodarse y col., 1979).
2
INTRODUCCIÓN
A nivel mundial están normados los niveles de metabisulfito a utilizar para camarón y langosta;
igualmente la industria pesquera en Cuba controla la cantidad exacta de este aditivo en las
normas de proceso respectivas. El problema consiste entonces en controlar que se cumplan,
determinando el residual de sulfito en el producto terminado destinado al consumo y que no
exceda los límites establecidos; por constituir el sulfito un producto tóxico para el ser humano
cuando se ingiere en cantidades superiores a 120 partes por millón (ppm), además de la
afectación de las características físicas que sufre el camarón o la langosta cuando el
tratamiento es excesivo (Pérez, 1983). Este parámetro forma parte importante del control diario
de la calidad de los productos terminados, así como también de productos en proceso y
materias primas utilizadas en el flujo productivo.
En tal sentido juegan un papel fundamental los laboratorios de control de la calidad que a
través del monitoreo, ensayo y control de las especificaciones contribuyen a garantizar la
calidad de estos productos.
Dada la importancia que han alcanzado las producciones de mariscos y su exportación en

Cuba, el avance científico técnico alcanzado por la esfera del control de la calidad total, su
gestión y la voluntad común entre todos las entidades del MINAL de lograr certificar sus
sistemas por las Normas ISO 9000:2000; sus laboratorios realizan un esfuerzo de conjunto
para demostrar la validez de sus ensayos.
En tal sentido se plantearon los siguientes objetivos para la realización de este trabajo:
Como objetivo general:
9 Evaluar el cumplimiento de los principales criterios de validación de tres métodos analíticos

utilizados en la determinación de residual de metabisulfito en mariscos.
3
INTRODUCCIÓN
Como objetivos específicos:
9 Evaluar la precisión de los métodos utilizados a través del cumplimiento de los parámetros
de validación establecidos para la repetibilidad y la reproducibilidad.
9 Determinar los límites de cuantificación y la veracidad como criterios de la calidad analítica

de estos métodos .
9 Analizar la especificidad, sensibilidad y robustez en los métodos que satisfagan los

criterios de precisión y veracidad.
9 Determinar la incertidumbre de cada método de ensayo para las diferentes matrices

utilizadas.
4
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
Capítulo 1 Revisión Bibliográfica
1.1 La pesca y su industrialización
La pesca, como industria, alcanza cada día mayor importancia debido a que es un sector
productor de alimentación primaria basada en recursos acuáticos, por lo que el manejo del
comercio de los productos que se obtienen puede mantenerse estable al encontrar menos
influencias restrictivas como la propiedad privada del recurso; que se presenta en la mayoría
de las que están basadas en recursos continentales (Cifuentes y col. 2006).
En Cuba, el valor extraordinario que desde el punto de vista económico poseen muchos de los
recursos pesqueros de su plataforma submarina y aguas oceánicas adyacentes, y la capacidad
de pesca que se ha creado en el país después de 1959, han influido sobremanera en el hecho de
que la mayor parte de nuestros recursos pesqueros estén completamente explotados e, incluso,
que unos pocos hayan sido sobre explotados (Baisre, 2004). Por ello se han encaminado grandes
esfuerzos y recursos para la introducción al país de las diferentes ramas de la Acuicultura, como
una solución inteligente y productiva para la escasez y dificultades que afronta hoy la pesquería
marítima, y sobre todo como alternativa para aumentar el pescado en la dieta poblacional.
1.1.1 Principales rubros exportables
Las exportaciones de recursos marinos constituyen una fuente apreciable de divisas para el país
mostrando una tendencia creciente en los últimos años, siendo sus principales rubros los
productos de langosta, camarón de mar y de cultivo. Además, se incursiona en la exportación de
peces frescos, pescado congelado y en diferentes formatos, jaiba y moluscos (Cubamar, 2009).
Entre los productos más sobresalientes que exporta Caribex se encuentran la langosta y el
camarón. Cuba es el segundo exportador a nivel mundial de la especie de langosta Panulirus
argus, con reconocido prestigio en esta esfera. Las diferentes formas de presentación de la
langosta que se comercializan son: viva; entera precocinada; entera precocinada fresca; en
mitades; entera cola; entera cruda; masa, cabeza y rejo; masa y antena; y en bloques al vacío.
En cuanto al camarón, de gran atractivo comercial, se presenta como: camarón entero
5
congelado, camarón cola congelado, camarón pelado y glaseado, y camarón con valor agregado
(estilo Mariposa, Tail off, Tail on, entre otras). También se comercializan esponjas, ancas de rana
y aletas de tiburón, entre otros recursos (García, 2006).
Una cuestión relevante es la relativa a las exigencias de inocuidad y calidad para los productos
pesqueros, que se incrementan en la actualidad. En general, se considera que si Cuba cumple
con los requisitos para exportar productos pesqueros a los países de la Unión Europea, de hecho
también cumple con las regulaciones estadounidenses (García, 2006) y por ende estará
preparada para ampliar su radio de acción hacia el continente americano: Canadá, Estados
Unidos, Argentina, países caribeños entre otros.
1.2 Crustáceos. Generalidades
Los crustáceos se encuentran entre las especies de mayor interés para la industria pesquera
cubana. A este grupo pertenecen todos aquellos animales que poseen el cuerpo cubierto por un
caparazón muy duro de naturaleza quitinosa, el cual necesitan mudar, periódicamente, para
poder crecer. Las especies o grupos más importantes son: la langosta, los camarones, el
cangrejo moro, el cangrejo de tierra y la jaiba.
1.2.1 Langosta
Aunque solo una especie resulta de interés para la pesca, en Cuba existen 4 especies de
langosta de roca o langostas espinosas. Una de estas, de tamaño más pequeño, habita aguas
profundas y solo es observada, ocasionalmente, por buzos o en los estómagos de algunos
meros. Las otras tres especies pertenecen todas al mismo genero y son: la langosta guinea
(Panulirus guttatus), muy común en zona poco profundas, particularmente en las zonas de
rompientes, escondida entre las solapas de las rocas; la langosta verde (Panulirus laevicauda)
que, aunque tiene importancia comercial en Brasil, es muy rara en Cuba y solo se le ha visto en
la costa sur, cerca de la influencia de tierra firme; y la langosta común o langosta del Caribe
(Panulirus argus), que constituye el principal recurso pesquero de Cuba, tanto por su valor
económico, como por su abundancia.
6
1.2.1.1 Caracterización física
De forma general la estructura física de la langosta se compone de la siguiente forma:

Cefalotórax 66,00% y Abdomen (cola) 34%. Un análisis tomando el cefalotórax de la langosta
como el 100% en peso de tejido fresco indicó la distribución reflejada en el Anexo 1 (Pérez y
Wong, 2002).
El peso del cefalotórax representa un 65,61% del peso total fresco, dependiendo del tamaño y
sexo del ejemplar. El valor más frecuente es de 67,8% en machos y 63,3% en hembras. Sobre
la base de estos datos se puede conocer el monto total de desperdicios de la producción
langostera (Pérez y Wong, 2002).
1.2.1.2 Caracterización nutricional
La langosta Panulirus argus, considerada como alimento, constituye el primer renglón de

exportación de la Industria Pesquera de Cuba y es considerada como una buena fuente de
divisas (Pérez y Wong, 2002).
En el Anexo 1, igualmente se indican resultados de la composición química de la langosta

observándose que posee un elevado contenido en proteínas, con valores superiores a los
reportados para la langosta americana, de 18,8%, mientras que el contenido en lípidos es inferior
al hallado para esta especie, de 0,8%. Lo que pudiera deberse a diferencias entre especies,
debidas a diversas temperaturas en sus hábitat (Pérez y Wong, 2002).
Muchos de los elementos minerales que posee este crustáceo son indispensables para la
nutrición humana. Los alimentos de origen marino son generalmente buenas fuentes de estos
ya que son los océanos los receptores finales de los iones disueltos. Los resultados de algunos
macro y micro elementos en el músculo de la langosta se muestran en el Anexo 1 (Pérez y
Wong, 2002).
1.2.2 Camarón
7
La pesca del camarón representa el 3.3 % de las capturas cubanas. Estas especies viven en
fondos fangosos y fango-arenosos, a profundidades no mayores de 50 m, en aquellas zonas
costeras que reciben los aportes de los ríos, aunque los juveniles dependen de la influencia del
agua dulce y, por eso, se encuentran en algunas lagunas costeras y en otras zonas estuarias
muy próximas a la costa. Los camarones se alimentan de crustáceos pequeños y de otros
organismos diminutos, que viven en la película superficial del fango y, a su vez, son depredados
por numerosos peces, entre los que se destacan: róbalos, corvinas, biajaibas y abacerotes
(Baisre, 2004).
Existen dos variedades básicas de camarón en el mercado mundial de hoy: el camarón marino,
que crece naturalmente en las aguas del mar (frías o tropicales) y el camarón de cultivo que se
desarrolla en granjas destinadas para estos fines (Flores, 2001). Las dos especies de importancia
comercial para la pesca son el camarón blanco (Litopenaeus schimitti) y el camarón rosado
(Fafantopenaeus notialis). Ambos se diferencian en cuanto al comportamiento y vulnerabilidad a
las arte de pesca, ciclo de vida y tipo de alimentación, pero sin grandes diferencias (Baisre,
2004). Mientras, en la Acuicultura cubana se desarrolla el cultivo de la especie Penaidae
Vanamei, con grandes avances productivos y calidad comparable al camarón marino (Anexo 2).
1.2.2.1 Caracterización física
El camarón tiene como características comunes a los crustáceos la presencia de un esqueleto

externo segmentado formado por quitina, impregnado de carbonato de calcio. Esta especie es un
decápodo macruro, omnívoro, aunque tiene preferencias por la dieta carnívora, que vive en
aguas templadas. El cefalotórax y el abdomen, conocidos como cabeza y cola respectivamente,
son las partes que componen dicho crustáceo. La cola se encuentra después del cefalotórax,
está constituida fundamentalmente por músculos formados con fibras cruzadas y representa la
porción que mayoritariamente se consume. (Coll, 1991; Carrillo y Vega, 2002). El cefalotórax, que
no se utiliza como alimento en muchos países, contiene un alto nivel de enzimas digestivas, lo
que se evidencia por la rápida auto digestión de los enlaces o eslabones que lo unen al abdomen
(Nolasco, 2002).
8
1.2.2.2 Caracterización nutricional
En su composición elemental media el camarón se aproxima a cualquier pescado blanco, dado

su aspecto clásico de pescado no graso: 78-84% de agua; 15 - 20% de proteínas según mudas,
especie, estado sexual, etc., pero siempre con un bajo contenido en grasa, que se expresa en la
mayoría de las muestras en alrededor del 1% (López, 1990). (Anexo 3).
1.2.3 Especificaciones de calidad de los crustáceos
Las especificaciones de calidad correspondientes a los productos crustáceos elaborados en la

Industria Pesquera, están basadas en las regulaciones internacionales y nacionales, así como las
condiciones, recursos y estrategias de elaboración del producto a nivel nacional.
La evaluación de estas características se realizará de acuerdo a lo establecido en los

procedimientos para este tipo de ensayo. El incumplimiento de cualquiera de los índices
microbiológicos o químicos ocasiona el rechazo del lote.
El procesamiento de los crustáceos se caracteriza por ser poco automatizado, es decir manual
en casi toda su totalidad; los especímenes son cuidadosa y rápidamente manipulados para evitar
que absorban demasiado calor, como manera de combatir las reacciones de deterioro que en
ellos se presentan.
En la calidad de estos productos influyen fundamentalmente los aspectos microbiológicos y los

químicos. Entre los primeros podemos encontrar la presencia de microorganismos
fundamentalmente coliformes fecales y microorganismos aerobios mesófilos, los que en
determinada concentración pueden provocar cambios en el producto que degradan su calidad.
Químicamente el principal aspecto es el contenido residual de metabisulfito, aditivo que se utiliza
después de la cosecha para acondicionar y proteger la calidad del crustáceo. Un incumplimiento
de cualquiera de ambos aspectos trae consigo el rechazo del producto (NE 1263-009: 2002).
Existen requisitos de calidad para ambas especies de crustáceos, según las normativas
nacionales vigentes (Anexos 4, 5 y 6).
9
1.3 Aditivos alimentarios. Sulfitos
1.3.1 Generalidades
Los aditivos alimentarios son sustancias que se añaden a los alimentos intencionalmente con el
fin de modificar sus propiedades, técnicas de elaboración, conservación o mejorar su adaptación
al uso a que estén destinados (NC 38-02-05: 87; CODEX STAN 192: 95). En ningún caso tienen
un papel enriquecedor del alimento. Algunos aditivos, como la sal o el vinagre, se utilizan desde
la prehistoria. Las consideraciones ligadas a la protección de la salud hacen que los aditivos
estén sometidos a un control legal estricto en todos los países. Los aditivos que más se utilizan
son la sal (cloruro sódico), que no es considerado en general como un aditivo; los mono y
diglicéridos (emulsionantes); el caramelo (colorante); el ácido cítrico (secuestrante y acidificante);
el ácido acético (acidificante y conservante); el bicarbonato sódico (para las levaduras químicas),
el ácido fosfórico y el glutamato sódico (potenciador del sabor) (UNIZAR, 2006).
El peligro de los aditivos o ingredientes usados en los productos de consumo radica en que a
menudo se trata de sustancias extrañas al organismo no investigadas en seres humanos y,
aunque la mayoría sean cancerígenas en altas dosis, se desconoce el efecto epidemiológico de
varias juntas, habiéndose constatado solamente las siguientes reacciones: asma, alergias,
hiperactividad en los niños, nauseas y vómitos, dolores de cabeza, erupciones cutáneas,
hinchazones, visión borrosa, entre otras (UNIZAR, 2006).
La seguridad química de los alimentos incluye, además de contaminantes y nutrientes, la

vigilancia de la exposición a aditivos alimentarios. Entre todos ellos los más utilizados son nitrato,
nitrito y sulfito en la producción, siendo las ingestas mayoritarias de nitrato, procedentes de su
presencia natural en los vegetales (EUSKADINET, 2006).
Mediante los controles analíticos, estos aditivos se vigilan en los alimentos donde su utilización es
habitual, con el fin de comprobar que los niveles empleados están dentro de los permitidos por la
legislaciones nacionales e internacionales. En el caso de los crustáceos se incluye además la
vigilancia del ácido bórico a pesar de que su utilización está prohibida, ya que continúa
utilizándose en algunos casos, al ser un eficaz inhibidor de la melanosis. (EUSKADINET, 2006)
10
1.3.2 Sulfitos como aditivos alimentarios
El termino “sulfitos” incluye al dióxido de azufre y varias sales de sulfito inorgánico (Anexo 7) que
liberan SO2 en las condiciones de uso. Los sulfitos son compuestos polivalentes desde un punto
de vista tecnológico que encuentran aplicación en distintos tipos de alimentos. Entre sus
funciones más relevantes destaca su capacidad de inhibición del pardeamiento enzimático y no
enzimático, el control e inhibición del crecimiento microbiano, la prevención del enranciamiento
oxidativo y la modificación de las propiedades reológicas de los alimentos. Estos aditivos tienen
aplicaciones específicas en relación con cada efecto concreto, pero en la mayoría de los
alimentos se usan con más de una finalidad (EUSKADINET, 2006; Costas, 2009).
Dada la gran reactividad del SO2, una vez adicionado a los alimentos reacciona rápidamente con
distintos constituyentes como compuestos carbonílicos, quinonas, proteínas, vitaminas y
antocianos entre otros, para dar lugar a diferentes combinaciones. Generalmente existe un
equilibrio entre las formas libres y combinadas, aunque algunas de estas últimas son virtualmente
irreversibles. El sulfito combinado predomina en la mayoría de los alimentos, pero las reacciones
adversas se deben sobre todo al sulfito libre (EUSKADINET, 2006).
En productos cárnicos los sulfitos se adicionan a los productos frescos, además de por su
actividad antimicrobiana, por su efecto en la estabilización del color, que permite ampliar su vida
comercial (EUSKADINET, 2006).
1.3.3 Sulfitos para la conservación de crustáceos
Con la finalidad de evitar la aparición de melanosis en productos crustáceos han sido probados
gran número de reactivos tales como ácido ascórbico, ácido sórbico, ácido benzoico, benzoato
sódico y ácido cítrico (Estabilier, 1969). Igualmente Ghanbari (1981) utiliza el ácido hipocloroso
para sumergir a los camarones, aprovechando su acción bactericida.
También Weingantner y col. (1977) recomienda la mezcla de bisulfito e hipoclorito en

concentraciones iguales a 1.25 y 5 % de metabisulfito respectivamente, seguidas del empleo
11
posterior de hipoclorito de sodio para disminuir el sulfito residual y ejercer su efecto bactericida.
Otros autores como Bertullo (1975) recomienda el bisulfito de sodio al 0.01 y 0.1 % o el EDTA al
1% para evitar la formación de la coloración oscura.
De igual forma Barnett (1976) recomienda que soluciones de 3000 ppm durante 30 segundos
puedan dar buenos resultados, reduciendo también las bacterias.
En la Industria Pesquera cubana el aditivo mayormente utilizado para retrasar o inhibir el

proceso de melanosis en los mariscos es el Metabisulfito de Sodio o Potasio; pues actúa de
manera irreversible sobre la enzima polifenoloxidasa; posee así mismo efectos
antimicrobianos, por lo que es considerado un conservante (BDN, 1995; López, 1990).
La melanosis es una coloración desagradable o mancha negra que se inicia en los

segmentos y va de la cabeza a la cola del camarón. Provoca una afectación en el aspecto
del producto, aunque no altera el valor nutricional del mismo (López, 1990; MIP, 1985). Esta
situación disminuye su valor comercial y la aceptación por parte de los consumidores (Otwell,
1992).
La melanosis es ocasionada por la formación de melanina, debido a reacciones enzimáticas

oxidativas, seguidas por una auto oxidación y polimerización, es decir, la melanosis es el
resultado de una serie de reacciones bioquímicas que son iniciadas a partir de la enzima
polifenoloxidasa, que está presente en el caparazón de los crustáceos y por debajo de este,
en forma de pro-enzimas inicialmente inertes. Una vez activada permanece así durante la
refrigeración, se inhibe con la congelación y se desnaturaliza con la cocción (Finne, 1985;
Ogawa, 1987; López, 1990). La polifenoloxidasa cataliza el primer paso del pardeamiento y
es capaz de hidroxilar monofenoles a difenoles, estos últimos por su estructura y
conformación son compuestos fácilmente oxidables a alfa benzoquinonas, las que forman
polímeros complejos pardos y a la vez estables, las melaninas (BDN, 1995). Un uso excesivo
de bisulfitos afecta la calidad del producto, lo que puede detectarse visualmente debido a que
la carne se torna amarillenta y la cáscara adquiere una textura abrasiva o áspera al tacto
(MIP, 1998).
12
1.3.4 Toxicidad de los sulfitos
La toxicidad de los aditivos reside principalmente en la cantidad que de éstos se adicione a los
alimentos. Los aditivos han de ser sustancias perfectamente detectables y medibles en los
alimentos. No han de interaccionar con el envase y han de carecer de toxicidad. (SINEXI S.A,
2006; Serra- Baldrix, 2009).
El anhídrido sulfuroso es uno de los conservantes con una mayor tradición en su uso.
También es el que tiene más siglos de prohibiciones y limitaciones a sus espaldas. Su uso se
conoce desde la Roma clásica en donde se empleaba para la desinfección de bodegas. En el
siglo XV se prohibió su uso en Colonia (Alemania) por sus efectos perjudiciales sobre los
bebedores. (UNIZAR, 2006).
En el organismo humano el sulfito ingerido con los alimentos es transformado en sulfato por
una enzima responsable de la eliminación del sulfito producido en el propio organismo durante
el metabolismo de los aminoácidos que contienen azufre, ésta se encuentra presente sobre
todo en el riñón, hígado y corazón. (UNIZAR, 2006).
Un pequeño porcentaje de los asmáticos, entre el 3 y el 8%, son sensibles a los sulfitos. En
las personas en que esta sensibilidad es más elevada se pueden producir reacciones
perjudiciales, por lo que deben evitar consumir alimentos que los contengan. Se han
observado en algunos casos otros tipos de reacciones frente a los sulfitos usados como
aditivos alimentarios, entre ellos manifestaciones cutáneas o diarrea, especialmente entre
personas con el jugo gástrico poco ácido. En numerosas ocasiones se ha propuesto la
sustitución del anhídrido sulfuroso y de los sulfitos con el fin de evitar los efectos nocivos que
se producen en ciertas personas, esto es prácticamente imposible en la industria del vino,
aunque sí en las demás, especialmente cuando se emplea con fines oxidantes. (UNIZAR,
2006; Consumer, 2008).
Ante los efectos nocivos que pueden producir el anhídrido sulfuroso y los sulfitos en ciertas
personas, se ha planteado reiteradamente su sustitución por otros conservantes; esto es
prácticamente imposible en el caso de su aplicación en la industria del vino, aunque sí en las
13
demás, especialmente en sus aplicaciones como antioxidante. (UNIZAR, 2006; Serra- Baldrix,
2009).
No existen evidencias de riesgo para la población en general cuando los agentes del sulfatado
se utilizan en las cantidades permitidas. Sin embargo, se ha demostrado la existencia de
individuos sensibles en los que la ingestión de sulfito provoca la aparición de asma, a veces
acompañada de signos característicos de una reacción alérgica. Las reacciones a alimentos
sulfitados dependen del umbral de sensibilidad del individuo, de los niveles de sulfito residual
y del tipo de alimento. (EUSKADINET, 2006).
En la actualidad se permite la utilización de sulfito sódico, sulfito ácido de sodio, metabisulfito

sódico y metabisulfito potásico en dosis máximas de 100 mg/kg en la parte comestible del
producto crudo y de 30 mg/kg en la parte comestible del producto cocido, expresado como
SO2. (EUSKADINET, 2006).
1.3.5 Métodos para determinación de sulfitos en alimentos
En la literatura se registran diversos métodos para la determinación de sulfitos; y

específicamente en Cuba se han introducido ensayos que permiten la determinación de este
analito en matrices orgánicas. A continuación se relacionan algunos de ellos.
Método AOAC. Determinación de Sulfitos en alimentos (Monier-Willians): método

aplicable para concentraciones superiores a 10 ppm de sulfitos en alimentos y aplicable
en presencia de otros compuestos volátiles de azufre. Se fundamenta en la liberación de
dióxido de azufre (SO2) al acidificar la muestra con ácido clorhídrico, la que
posteriormente es hervida bajo reflujo en una atmósfera de nitrógeno (N2). El dióxido de
azufre liberado es destilado y recogido en una disolución de peróxido de hidrógeno al
3%, el cual es valorado con una disolución patrón de hidróxido de sodio (AOAC, 1994).
Método Tsukuda. Determinación de SO2 por microdifusión: El método se basa en la

determinación de residuo de sulfito a través de una doble descomposición del complejo
de sal sódica de cloro y mercurio. Posteriormente se mide el desarrollo de color de la
muestra con para-rosanilina (NC 80-06-1:82).
14
Método de destilación directa: los iones sulfitos obtenidos a partir del metabisulfito
sometido a un medio ácido son destilados y posteriormente valorados con una disolución
de yodo (0,05 N) en presencia de almidón como indicador (De Vries y col., 1986).
A este método se le realizó un estudio de correlación con el método Tsukuda, en el

Centro de Investigaciones Pesqueras (CIP) (González y col., 1998). Dicho estudio
reveló una correlación estadísticamente significativa (nivel alto 99.8% y nivel bajo
98.6%; α=0.05).
Método de destilación rápida: Se determina el dióxido de azufre mediante un proceso de

digestión ácida de la muestra y destilación del dióxido de azufre, el cual es recogido
sobre una solución recibidora de hidróxido de sodio; finalizando con una valoración
redox con solución de yodo.
Los métodos Tsukuda (NC 80-06-1: 82) y Monier-Willians (AOAC, 1994) son más costosos
(Anexo 8 ) y su duración se encuentra generalmente entre tres y ocho horas, por tanto, se
dificulta mucho poder reportar los valores de los productos elaborados diariamente en la
Industria.
Diferentes laboratorios han desarrollado variantes del método publicado en la AOAC,

Monier -Williams, incorporándole nuevos componentes, cambio de concentración de las
soluciones o sustitución de soluciones valorantes para la determinación final. Tal es el caso
del método propuesto por el Laboratorio Antártida de España (IT-ANT-10. 1/3, 2004)
(Anexo 8).
1.4 Acreditación del Sistema de Gestión de la Calidad
1.4.1. Aspectos generales
La acreditación es una actividad mediante la cual un organismo de tercera parte

debidamente acreditado otorga reconocimiento formal a un laboratorio (de ensayo o
15
calibración), un órgano de inspección o un órgano de certificación, los cuales deben

demostrar su competencia técnica y que cumplen con todas las regulaciones nacionales e
internacionales; así como brindar a sus clientes confianza y credibilidad en los resultados
de sus servicios, ambas, premisas fundamentales para el intercambio de productos y
servicios (ONARC, 2005).
En lo que respecta a la economía nacional se refrenda la competencia técnica de las

entidades evaluadoras de la conformidad (laboratorios, órganos de inspección) y el
reconocimiento nacional e internacional de la calidad de los productos y servicios como
medida para elevar la eficiencia y facilitar el comercio. En tanto para la entidad acreditada
coadyuva al reconocimiento nacional e internacional del resultado del servicio que presta
incrementando sus posibilidades de mercado y con esto lograr fortalecer su imagen
corporativa (ONARC, 2005).
Los cambios que ocurren en el ámbito mundial, las economías cada vez más globalizadas
y los imperativos de las corrientes neoliberales, imponen la necesidad de transformaciones
en los diferentes sectores económicos, políticos y sociales de nuestro país, capaces de
demostrar la competitividad de las organizaciones (Pazos y Sosa, 2006).
En Cuba se han dado importantes pasos de avances en tal sentido, que responden al
acelerado desarrollo de la acreditación en los niveles internacionales y regionales, como
una necesidad de propiciar el reconocimiento de la capacidad técnica en consonancia con
las exigencias del mercado (Pazos y Sosa, 2006).
Para la acreditación de un laboratorio este debe tener acreditado al menos un ensayo de

los que en el se realizan, generalmente los ensayos seleccionados están relacionados con
los productos de mayor importancia para la entidad involucrada. En la acreditación de un
ensayo químico es de gran importancia que el mismo esté validado (Pérez, 2005).
1.4.2 Validación de métodos de ensayo
La validación de métodos analíticos es aquel proceso por el cual se establece, a través de

estudios de laboratorio, que la capacidad del mismo satisface los requerimientos para las
aplicaciones analíticas deseadas; o sea, no es más que las mediciones realizadas para
16
comprobar y describir que un método opera en todo momento de acuerdo con las
expectativas y los requisitos impuestos respecto a su exactitud, uso, implantación y fuentes
de error, siendo lo suficientemente fiable para los intereses analíticos que se persiguen.
(Gil, 1995; IUPAC, 2002, NC TS 368:2004).
En algunos sectores, principalmente en el de la alimentación, la Ley prescribe el uso de

métodos completamente certificados para la determinación de los requisitos de control de
calidad (FAO, 1997), de ahí que sean varios los autores (Amarán, 2001; León, 2003; Luis,
2002; Machin, 2004; Ramírez, 2004; De Armas, 2003) que han trabajado el tema de
validación, pues para la utilización de métodos analíticos de ensayo en un laboratorio, estos
deben presentar como característica principal la obtención de resultados confiables.
Sin embargo, no solo la validación de un método de ensayo es útil para aquellos

laboratorios que dentro sus perspectivas a mediano plazo está lograr el reconocimiento de
su competencia técnica; también puede beneficiar a aquellos que necesiten proporcionar un
alto grado de confianza y seguridad en el método analítico y/o deseen conocer
profundamente las características de comportamiento de los métodos que utilizan (Delgado
y Aguilar, 2004).
Los métodos de ensayos expuestos en la literatura científica o en otros documentos

altamente calificados son diseñados bajo condiciones que muchas veces son inalcanzables
en nuestros laboratorios y es necesario adecuarlos a nuestras condiciones reales, es por
ello que la validación de esos métodos se convierte en una necesidad imprescindible
(Delgado y Aguilar. 2004).
La validación es un proceso y no un evento aislado (OMS, 1992) e implica un estricto

cumplimiento de las Buenas Prácticas de Laboratorio que según la ISO 5725-1:1994 debe
contemplar los siguientes aspectos:
17
Personal suficiente y adiestrado.

Instalaciones adecuadas.
Correcta organización.
Métodos analíticos actualizados y probados.
Equipos y medios de medición calibrados.
Procedimientos adecuados para la toma de muestra.
Utilización de reactivos de calidad y soluciones valoradas idóneas.
Utilización de reactivos de calidad y soluciones valoradas idóneas.
Verificación – Supervisión de los resultados analíticos obtenidos.
Higiene y seguridad.
Adecuada información y comunicación de los resultados obtenidos.
Auto inspección.
En Cuba en los últimos años se han intensificado los estudios referentes a la validación de
métodos analíticos aplicados en el análisis químico de los alimentos, de ahí que ya se
cuente con la Norma Cubana NC TS 368:2004: Guía para la validación de métodos de
ensayos químicos para alimentos.
Los pasos a seguir según NC TS 368:2004 para el desarrollo de la validación de un método

analítico son:
1. Diseño de un protocolo de validación o verificación.
2. Determinación de la especificidad y la curva patrón.
3. Determinación de la precisión, expresada como repetibilidad y reproducibilidad.
4. Determinación de la veracidad.
5. Determinación del rango de trabajo / rango de medición.
6. Determinación del límite de detección.
7. Determinación del límite de cuantificación / límite de determinación.
8. Determinación de la robustez.
9. Determinación de la sensibilidad.
10. Evaluación de los resultados, desde el paso 2 al 8, contra el protocolo.
11. Documentación del trabajo en un informe.
De manera general el protocolo de validación debe fundamentarse en los siguientes
elementos (NC TS 368: 2004):
• Necesidades del cliente.
18
• Expectativa analítica.
• Condiciones del laboratorio, las cuales tienen un impacto sobre la validación o
verificación, tales como el ambiente de trabajo y el equipamiento disponible, por
ejemplo.
Se consideran seis categorías diferentes de métodos de ensayo aplicables en los
laboratorios químicos. Estas categorías se fundamentan en la documentación disponible
sobre el grado de validación del método. Para cada categoría considerada se recomienda
establecer un determinado trabajo de validación, consistente en la medición de diferentes
parámetros en consecuencia con el grado de estudio que presenta el método. (NC TS-
368:2004).
1.4.2.1 Tipos de validación
La validación de procesos en general se divide en tres tipos, los cuales abarcan varias
formas como la revalidación, que también se realiza a los métodos analíticos. Estos tres
tipos de validación son la prospectiva, la concurrente y la retrospectiva (USPC, 1986;
Guerra, 1999).
PROSPECTIVA: se aplica a nuevos métodos durante la etapa de desarrollo y es el

resultado de un análisis de riesgo del proceso. También puede realizarse cuando se prevé
efectuar cambios en el método que puedan afectar las características del ensayo.
CONCURRENTE: se lleva a cabo durante una producción normal donde los aspectos
críticos se hayan evaluado en la etapa de desarrollo. La evaluación de los resultados se
emplea para establecer las especificaciones de los controles de calidad de proceso y de
producto final.
RETROSPECTIVA: se aplica a los métodos no validados inicialmente y de los que se

posee documentación suficiente para comprobar si el proceso se encuentra apto. Esta es la
vía más común de validar las técnicas analíticas que han sido llevadas a cabo
rutinariamente sin haber sido validadas anteriormente.
19
Se puede considerar que los métodos de ensayo químico se agrupan generalmente en dos
grandes categorías, atendiendo al tipo de analito a determinar (Godshall y col., 1998).
¾ Cuantificación de un componente mayoritario (tipo I)
¾ Cuantificación de una traza o componente minoritario (tipo II)
1.4.3 Parámetros fundamentales de la Validación. (NC TS-368:2004)
1.4.3.1 Precisión
Precisión es el grado de concordancia entre resultados analíticos independientes obtenidos

bajo condiciones específicas. La precisión depende solamente de la distribución de los
errores aleatorios y no está asociada con el valor verdadero. Se expresa generalmente
como la desviación típica del resultado analítico.
Una baja precisión produce una elevada desviación típica. La precisión es una
característica importante en la evaluación de todos los métodos cuantitativos.
La precisión de un método depende mucho de las condiciones bajo las cuales ha sido
estimada. Las condiciones de repetibilidad y de reproducibilidad representan
evidentemente condiciones diferentes, mientras que la reproducibilidad interna cae dentro
de estos dos extremos.
1.4.3.1.1 Repetibilidad
Es la precisión de un método que se lleva a cabo de forma repetida bajo las mismas
condiciones (ISO 5725-1, 1994; ISO 5725-3, 1994; Peris, 1993; NC TS-368:2004).
Refleja la precisión de un método cuando se desarrolla bajo las mismas condiciones,

utilizando la misma muestra analizada por el mismo analista, en el mismo laboratorio, con
los mismos equipos y reactivos y durante una misma sesión de trabajo en un período corto
(NC TS-368:2004; Calpena y col., 1991).
20
1.4.3.1.2 Reproducibilidad
Es la diferencia entre los resultados de mediciones del mismo mensurando llevadas a cabo
bajo condiciones de medición diferentes (ISO, ISBN 92-67-10175-1:1993; NC TS-
368:2004). Se estima sobre la base de resultados obtenidos cuando el método se ha
utilizado para analizar idénticas porciones de ensayo en diferentes laboratorios empleando
diferentes equipos (NC TS-368:2004; Calpena y col., 1991).
Reproducibilidad interna: Diferencia entre los resultados de las mediciones del mismo
mensurando llevadas a cabo en el mismo laboratorio, utilizando el mismo método, pero
ejecutados en diferentes momentos por diferentes analistas empleando, por ejemplo,
diferentes lotes o reactivos. Se expresa con los mismos parámetros matemáticos que la
repetibilidad (NC TS-368:2004; Calpena y col., 1991; NC Proyecto 2001).
El coeficiente de variación en el estudio de la reproducibilidad debe ser igual o mayor que el

obtenido en el estudio de repetibilidad para la misma cantidad o concentración debido a la
mayor fuente de error que existe en la reproducibilidad (Calpena y col., 1991).
1.4.3.2 Especificidad
Es la habilidad de un método analítico para distinguir el analito a determinar en presencia

de interferencias (NC TS-368:2004; IUPAC, 2002).
1.4.3.3 Linealidad
Es la capacidad de un método analítico de obtener resultados linealmente proporcionales a

la concentración de analito en la muestra, dentro de un intervalo determinado (Castro y col.,
1989; NC TS-368:2004). Se determina mediante el tratamiento matemático de los
resultados obtenidos en el análisis del analito a diferentes cantidades o concentraciones. La
selección del rango y del número de puntos experimentales está estrictamente relacionada
con la aplicación del método (Gil, 1995; USPC, 1990; Peris, 1993).
21
Los métodos gravimétricos y volumétricos, entre los que se encuentran algunos métodos
analíticos importantes como materia seca, ceniza, grasa y nitrógeno Kjeldahl, no requieren
la evaluación de la linealidad (NC TS-368:2004).
1.4.3.4. Sensibilidad
La sensibilidad de un método es una medida de la magnitud de respuesta causada por

cierta cantidad del analito. Se representa por el coeficiente angular de la curva patrón (NC
TS-368:2004).
1.4.3.5. Veracidad
Veracidad es la concordancia entre el contenido verdadero de un analito específico en la

muestra y el resultado del análisis. Indica la capacidad del método analítico para obtener
resultados lo más próximos posibles al valor verdadero (Calpena y col., 1991; NC TS-
368:2004). Una definición alternativa acerca de la veracidad, según la NC TS-368:2004
consiste en el:
Grado de concordancia entre el contenido verdadero del analito en la muestra y la media

obtenida como resultado de realizar varias determinaciones.
Debe hacerse una distinción entre los diferentes métodos analíticos, sobre la base de si hay
o no métodos de referencia disponibles y/o materiales de referencia certificados, así como
esquemas de ensayos de aptitud (NC TS-368:2004).
La ventaja de utilizar ensayos de recuperación para la determinación de la veracidad del

método, consiste en la representatividad de la matriz, además, la técnica puede ser
utilizada para todos los analitos y con la mayoría de las matrices siempre que el analito esté
disponible en el laboratorio como un compuesto sintético estable, aunque la mayor
limitación es que pudieran presentarse diferencias en la forma química entre el analito
presente en la muestra auténtica y el compuesto sintético añadido. Los resultados se
22
expresan como el por ciento de recobrado o recobrado de la cantidad de analito presente

en la muestra con cantidades de sustancias conocidas (NC TS-368:2004; De Veer, 1997).
1.4.3.6 Rango de concentración o de medición
Es el rango de concentración del analito que reúne los requisitos de calidad del método,
experimentalmente demostrado (NC TS-368:2004).
Todos los métodos tienen una sensibilidad limitada que restringe el rango de concentración
para el cual el método es aplicable. El límite inferior para cuantificaciones reales se define
como el límite de cuantificación; el límite superior de cuantificación es especialmente
importante en métodos que incluyen la estandarización.
1.4.3.7 Límite de detección
Es la cantidad o el contenido de un analito que corresponde a la señal de medición más

baja que con cierta confianza estadística puede ser interpretada como un indicador de que
el analito está presente en la solución, pero no necesariamente permitiendo su exacta
cuantificación (NC TS-368:2004).
El límite de detección es muy importante en el análisis elemental de trazas, mas por otro
lado, es generalmente innecesario estimar este límite cuando se evalúan métodos para la
determinación de componentes principales de los alimentos (NC TS-368:2004).
23
1.4.3.8 Límite de cuantificación
El límite de cuantificación de un procedimiento analítico es la cantidad más baja de analito

en una muestra que puede ser cuantitativamente determinada con cierta confianza. A este
límite también se le llama límite de determinación. (NC TS-368:2004).
Cuando se evalúan métodos cuantitativos, es importante definir y estimar la concentración

más baja que puede ser medida con una precisión suficientemente definida. (NC TS-
368:2004).
1.4.3.9 Robustez
La robustez se define como la influencia que ejercen sobre la sensibilidad de un método

analítico desviaciones menores en las condiciones experimentales del mismo. Aunque no
debe considerarse equivalente a la reproducibilidad, representa el grado de reproducibilidad
de un método sometido deliberadamente a pequeñas variaciones para conocer su
estabilidad frente a ellas. Se dice que un método es robusto si no es apreciablemente
influido por las nuevas condiciones. (NC TS-368:2004; Peris, 1993).
1.4.4 Incertidumbre de las mediciones
La incertidumbre de la medición puede ser expresada como una incertidumbre típica de la

medición, definida como “incertidumbre de la medición del resultado considerando una
desviación típica” o como una incertidumbre de la medición expandida, definida como “una
cantidad que define el intervalo sobre el resultado, que incluye una amplia porción de la
variación en la que es probable que se encuentre el analito presente en la muestra, y la cual
es obtenida multiplicando la incertidumbre típica de la medición por el factor de cobertura”.
Usualmente este factor de cobertura es igual a 2, en algunos casos puede utilizarse un
factor igual a 3. La utilización de un factor de cobertura igual a 2 corresponde a un nivel de
confianza de 95 % y un factor de cobertura igual a 3, a un nivel de confianza de más del 99
% (NC TS 367:2004).
24
De forma general se define como: Ëstimado aplicado a un resultado de un ensayo que

caracteriza el recorrido de valores dentro de los cuales se supone que se encuentra el valor
verdadero¨. (NC-ISO 3534-1, 1999).
Es importante comprender la diferencia entre error de la medición e incertidumbre de la

medición. El error es la diferencia entre lo medido y su valor verdadero. La incertidumbre es
la variación que resulta de la medición de la concentración del analito en el material de
ensayo (muestra). El error es una diferencia mientras que la incertidumbre es un intervalo.
Para cuantificar el error de la medición debe conocerse el valor verdadero o el valor
convencional, mientras la estimación de la incertidumbre de la medición no requiere que
sea conocido el valor verdadero (NC TS 367:2004).
25
MATERIALES Y MÉTODOS
Capítulo 2 Materiales y Métodos

La metodología de trabajo seguida para la validación de métodos para la determinación de
sulfitos en marisco se refleja en el esquema presentado en la figura 1.
Selección de productos Langosta

Camarón
Validación de métodos
Microdifusión.
Método 1 Destilación Rápida.
Método 3
(NC 80-06-1:82) Destilación Directa. (IT-ANT-10. 1/3, 2005)
Método 2
Parámetros a evaluar (De Vries y col., 1986)

Precisión
Parámetros a evaluar
Límite de Cuantificación Precisión
Veracidad Parámetros a evaluar Límite de Cuantificación
Precisión Veracidad
Límite de Cuantificación Sensibilidad
Veracidad Robustez
Sensibilidad
Robustez
Determinación de la incertidumbre de los métodos
Análisis estadístico de los resultados obtenidos
Figura 1 Esquema de trabajo para la validación de métodos para la determinación de

sulfitos en mariscos
26
En la figura anterior se reflejan los parámetros evaluados en cada método según sus
características, así como el orden de realización de dichos parámetros, tomando como
guía lo que se establece en la NC TS- 368:2004.
2.1. Productos seleccionados para el estudio
Los productos estudiados en el presente trabajo fueron langosta en sus diferentes

formatos (entera, cola y pre-cocinada), cuyas muestras se tomaron de la Empresa
Industrial Batabanó; así como, camarón cola pelado y glaseado elaborado en la Empresa
Procesadora de Alimentos Ärgelio Reyes Aguiar¨ (PRODAL). Estos productos son de las
producciones de mayor importancia, no sólo para las entidades en cuestión, sino para el
país, atendiendo a lo expresado en el capítulo 1 Revisión Bibliográfica; sirviendo de base
para la determinación del residual de metabisulfito por los métodos antes descritos en el
presente trabajo.
2.1.1. Langosta
Para la langosta el contenido máximo residual de metabisulfito permitido, es 100 ppm en

producto crudo, y 30 ppm en producto cocido (NC 114: Langosta. Especificaciones. 2001);
su determinación se realiza mediante el método por microdifusión (De Vries, 1986) en el
Centro de Investigaciones Pesqueras y las industrias relacionadas.
Las muestras de este producto fueron utilizadas en los ensayos realizados para la
validación del método por Microdifusión (AOAC, 1994) y método por Destilación Rápida
(IT-ANT-10. 1/3, 2004).
2.1.2. Camarón cola pelado y glaseado
El camarón cola pelado y glaseado es elaborado a partir de la materia prima camarón de

cultivo. El contenido residual de metabisulfito en el producto constituye una de las
especificaciones físico químicas de calidad (Anexo 6), este no puede exceder las 100 ppm
27
(NE 1263-009: 2002); su determinación se realiza mediante el método por destilación

directa (De Vries, 1986) en PRODAL.
2.2 Muestras evaluadas
Para la realización de los análisis se tomaron muestras de crustáceos correspondientes al

monitoreo de control de la calidad, estando conformadas algunas de ellas por la mezcla de
masa correspondiente a varias muestras de una misma especie. De la muestra bien
homogenizada de no menos de 200 gramos, se pesó la cantidad necesaria.
Las muestras de cada producto utilizadas cumplieron con los criterios de calidad según las
normas NC 114:02 y NC 115:02, establecidas en Cuba.
Las muestras se tomaron de producciones de langosta cola, entera y precocida, y

camarón cola pelado y glaseado según lo planteado en NC ISO 2859-1:2003.
Se utilizaron muestras de langosta entera sin tratamiento para la evaluación de los

parámetros de validación que las requieren (veracidad y límite de cuantificación). En igual
caso, para uso de muestras de camarón sin tratamiento se realizaron varios lavados al
producto hasta obtener concentraciones lo más próximas a cero, según lo recomendado en
NC TS-368: 2004.
2.3 Métodos de ensayo a evaluar
2.3.1 Método 1 Determinación de residual de sulfitos por Microdifusión (NC 80-06-1:82)
Este es el método vigente para mariscos y sus productos derivados. Su principal utilización
se lleva a cabo en el Centro de Investigaciones Pesqueras, como parte del monitoreo y
control sanitario que se realiza por este centro, laboratorio de referencia de dicho
ministerio, durante casi 20 años de trabajo. (González y col., 1998). Se decide la
validación de este método a partir de que no existen experiencias anteriores de este
proceso realizadas con todas las especificaciones que exige la norma al respecto. (NC TS-
368:2004).
28
El residual de sulfito se determina de la doble descomposición del complejo de sal sódica

de cloro y mercurio por el método de microdifusión (NC 80-06-1:82), midiendo la
absorbancia del color desarrollado por la muestra con disolución de p-rosanilina a una
longitud de onda de 560 nm. Es un método cuya duración se extiende aproximadamente a
6 h, posibilitando a la vez evaluar una cantidad de muestras limitada por la cantidad de
placas de microdifusión y el volumen de los equipos que se emplean en la técnica, que a la
vez permitan su análisis simultáneo. (Ver Anexo 8).
Actualmente, algunas empresas procesadoras de mariscos del país presentan dificultades

para su realización y en ocasiones se encuentran imposibilitados de llevarla a cabo, debido
entre otros factores a la carencia del equipamiento y materiales necesarios
(espectrofotómetros, reactivos, celdas de microdifusión, centrífugas, etc.); impidiendo así
se tomen medidas efectivas en las industrias para controlar el tratamiento químico
efectuado a los mariscos.
2.3.2. Método 2 Determinación de sulfitos por Destilación Directa
A nivel mundial se realiza el control del residual de SO2 en la planta productiva empleando
varias técnicas que se fundamentan en la valoración yodométrica; la cual a pesar de no
resultar muy exacta como el método de Microdifusión establecido en el MIP, pudiera ser
empleada con resultados satisfactorios en el monitoreo de este aditivo en la industria.
(González y col., 1998).
El método (Anexo 8) se basa en la extracción del dióxido de azufre total contenido en la

muestra mediante una destilación directa en medio ácido y posterior valoración
yodométrica; es decir, los iones sulfitos obtenidos a partir del metabisulfito sometido a un
medio ácido son destilados, el producto de esta destilación es posteriormente valorado con
una disolución de yodo (0,05 N) en presencia de almidón como indicador (De Vries, 1986).
Es un método elemental que utiliza solo cristalería convencional con una duración
aproximada de 30 minutos.
29
Este no se encuentra normalizado para el objetivo propuesto, sino que se utiliza

mayormente para la determinación de sulfitos en verduras, vinos y frutas.
La evaluación del método de determinación de metabisulfito por destilación directa

responde a la necesidad actual de la industria de contar con métodos eficaces y de
ejecución rápida, máxime en un laboratorio donde diariamente se analizan un gran número
de muestras.
2.3.3. Método 3: Determinación de sulfitos por Destilación Rápida
En principio es similar al método anterior (Anexo 8), se determina el dióxido de azufre

mediante un proceso de digestión ácida de la muestra y destilación del sulfito, el cual es
recogido sobre una solución recibidora de hidróxido de sodio; determinándose la
concentración del analito mediante una valoración con solución de yodo. La variante se
fundamenta en la utilización de un equipo de destilación a vapor para la obtención del
sulfito a valorar; lo cual ahorra tiempo (aproximadamente la destilación dura 6 minutos), y
permite el análisis casi simultáneo de un sin número de muestras, con una eficiencia
promedio entre 80 y 90%. (IT-ANT-10.1/3 Antártica. 2005).
2.4 Parámetros de validación
El proceso de validación para todos los métodos de ensayo se realizó según lo establecido
en la NC TS- 368:2004. Los parámetros de validación o criterios de calidad analítica a
evaluar en cada caso se decidieron según las características de cada método, atendiendo
a su clasificación según la Norma Cubana (Tabla 1).
30
Tabla 1. Parámetros de validación, según la clasificación de los métodos estudiados por la

NC TS- 368:2004, y productos evaluados, en cada caso
Método de ensayo Parámetros a evaluar Producto
1. Microdifusión Precisión
Método bien establecido pero no validado. Limite de cuantificación Langosta

(verificación) Veracidad
Precisión
2. Destilación Directa Limite de cuantificación
Método desarrollado internamente Veracidad Camarón
(validación completa) Sensibilidad
Robustez
Precisión
3. Destilación Rápida Limite de cuantificación
Método desarrollado internamente Veracidad Langosta
(validación completa) Sensibilidad
Robustez
2.4.1. Precisión
Se procedió midiendo la repetibilidad y la reproducibilidad como desviación típica relativa
(RSD) o coeficiente de variación que viene dado por:
RSD (%) = (s / x ) * 100
x : media de las determinaciones

s : desviación típica o estándar
Donde:
(
∑ ix − x )2
s=
n −1
x i: valor puntual de cada determinación
n: número de determinaciones
31
En la determinación de metabisulfito, la reproducibilidad sólo se evaluó intralaboratorio, con

20 determinaciones para el método 1, 30 determinaciones para el método 2; 22 y 15
determinaciones para el método 3, correspondiente a los niveles alto y bajo
respectivamente; siguiendo en este caso, la recomendaciones del fabricante del equipo
Vapodest utilizado, con respecto a los resultados poco uniformes que se han obtenido para
la determinación de sulfitos a bajas concentraciones. (IT-ANT-10.1/3, 2005). Por lo cual
como niveles alto de concentración se tomaron los valores de 35 ppm en la
reproducibilidad y 70 ppm en la repetibilidad, así como valores bajos de 18 y 10 ppm
respectivamente.
Las diferencias en la cantidad de ensayos a realizar son consecuencia de la cantidad de

muestra disponible para la realización de cada estudio.
Para la repetibilidad se efectuaron determinaciones en rápida sucesión y por el mismo
analista, realizándose 15 en los métodos 1 y 2. En la técnica 3 se realizaron 16 réplicas
para cada nivel de concentración.
En la evaluación de la precisión se tomaron como criterios de validación los expresados a

continuación, atendiendo a los niveles de concentración a determinar según lo establecido
por la NC TS 368:2004:
Desviación estándar < 3
Desviación típica relativa de la repetibilidad (RSDr): 7-5
Desviación típica relativa de la reproducibilidad (RSDR): 8-11
2.4.2. Especificidad
Este parámetro de validación no se evaluó para las técnicas analíticas de determinación de
residual de metabisulfito, pues las sustancias que, según Koltov y col. (1957), suelen
interferir en valoraciones yodométricas, no forman parte de la composición de la muestra
en estudio.
No obstante lo planteado con anterioridad, pudiese ser que como consecuencia de la
hidrólisis ácida que tiene lugar, existiese una liberación de H2S procedente de
32
determinadas especies químicas azufradas componentes del producto, que influya

significativamente en los resultados del análisis. En tal caso los resultados del método
arrojarían como reporte el contenido total de sulfitos en la muestra, lo cual es el objetivo del
ensayo; resultando no determinante el origen de los analitos a cuantificar.
2.4.3 Limite de detección

Este parámetro de validación no se evaluó, pues sólo se busca un residual que no debe
ser superior a 100 ppm; el hecho de que exista poco analito en la muestra nunca va a
provocar un rechazo del producto terminado.
2.4.4. Límite de cuantificación
En todos los métodos se procedió a la evaluación de 21 muestras blanco, cuyo análisis de

los resultados consistió en la determinación de la desviación típica de los resultados y su
multiplicación por 10, para obtener el valor más bajo de analito que puede ser determinado
con un 95 % de confianza. Es importante destacar que en los métodos 1 y 3 se utilizaron
muestras blanco a partir del producto cola langosta sin tratamiento químico con
metabisulfito. Mientras que para el método 2 se realizaron lavados sucesivos con agua
destilada del producto camarón pelado, hasta obtener valores de residual de metabisulfito
menores de 10 ppm.
2.4.5. Veracidad
El estudio de este parámetro de validación se llevó a cabo en diferentes niveles de

concentración atendiendo a las posibles concentraciones de analito en los productos.
A las muestras blanco se añadió patrón de bisulfito hasta obtener niveles de concentración
determinados. La tabla 2 muestra las combinaciones realizadas.
33
Tabla 2. Datos obtenidos para las concentraciones de metabisulfito a evaluar en el estudio

de la veracidad en los diferentes métodos.
Niveles de
Concentración Cantidad de
concentración
Métodos del Blanco patrón añadida
obtenidos
(ppm) (ppm)
(ppm)
Microdifusión 3.34 18.06 25
(1) 3.49 54.18 50
4.8 8.0 12
Destilación
29.76 20.0 50
Directa (2)
29.76 70.0 100
7.70 23.0 30
Destilación
7.70 43.0 50
Rápida (3)
7.70 93.0 100
Nota: ppm- partes por millón
En la evaluación de los tres métodos se realizaron por triplicado cinco determinaciones en

cada punto según lo establecido en NC TS-368: 2004, calculándose en cada caso la
concentración media recuperada.
En cada nivel se calculó el porcentaje de recuperación del analito (NC TS-368: 2004)
según la fórmula:
⎡ (ce − com) ⎤
% Recuperación = ⎢ ⎥ * 100
⎣ ca ⎦
donde:
ce = cantidad ensayada (muestra con analito añadido)
com = cantidad original en la muestra (sin analito añadido)
ca = cantidad de analito añadido
En cada punto se aplicó la prueba t-Student para demostrar si los recobrados obtenidos
eran o no significativamente diferentes de 100 (NC TS-368: 2004); para ello se utilizó la
expresión:
34
| 100 − R | n
texp =
CV
donde:
R = % de recuperación media.
n = número de determinaciones.
CV = coeficiente de variación del % de recuperación en cada determinación.
El valor experimental de t (texp) se comparó con el valor t de la tabla (t(1-α),ν) donde α=0.05 y
ν = n-1.
Adicionalmente se realizó un análisis estadístico de regresión lineal para establecer la
linealidad entre la masa en miligramos de analito añadidos y los recuperados.
2.4.6. Sensibilidad
Debido a que la determinación de Residual de metabisulfito opera a concentraciones muy

bajas, al nivel de las partes por millón, se decidió evaluar la sensibilidad del método a partir
del coeficiente angular de la curva patrón correspondiente, el cual se determinó por el
método de los mínimos cuadrados.
Para el método por destilación directa, se procedió utilizando siete puntos de medición
diferentes, entre 12,8 y 110,8 ppm de metabisulfito, decididas atendiendo a la
concentración máxima permitida de este aditivo en el producto, 100 ppm y los valores
comúnmente encontrados del residual en el producto. Las determinaciones se realizaron
por duplicado sobre muestras blanco, a las cuales se les añadió el analito en
concentraciones exactamente distribuidas cubriendo completamente el rango de trabajo
expresado anteriormente.
En cuanto al método por destilación rápida se utilizó la metodología descrita con
anterioridad con la variante de la utilización de una solución de trabajo a una concentración
dada y la adición cada vez más creciente de mililitros de la misma al tubo de análisis. El
35
fabricante del equipo Gerhardt, establece un recobrado del equipo de hasta un 80%. (IT-
ANT-10.1/3, 2005).
Los resultados se representaron gráficamente y se obtuvo la ecuación de la regresión

lineal del tipo y = bx + a, así como los coeficientes de correlación y de determinación
como una medida de la distribución (r>0.999), tal como plantea NC TS-368:2004.
2.4.7 Robustez
En la robustez se analizan ciertos cambios en algunas de las condiciones del método. Los
cambios son pequeños y del orden que muy bien podrían existir entre un laboratorio y otro.
Durante la evaluación de la robustez para la determinación de residual de metabisulfito

por el método de Destilación Directa, se estudiaron los factores:
A: volumen de agua en balón de destilación (mL)

B: volumen de ácido añadido (mL)
C: volumen de agua en el recogedor (mL)
D: temperatura a la cual se llevó a cabo la destilación (3: Temperatura alta; 4:
Temperatura media)
E: analista que realizó el ensayo (analista 1; analista 2)
F: comienzo de la agitación (P: desde que comenzó a decolorarse la solución; L: dos
minutos luego de comenzar a decolorarse la solución)
G: solución de yodo (N: solución preparada recientemente; V: preparada y utilizada por
varios días sin recalcular concentración)
36
En el caso del método por Destilación Rápida fueron:
A: Volumen de solución de HCl (mL).

B: solución de yodo (N: solución preparada recientemente; V: preparada y utilizada
por varios días sin recalcular concentración).
C: Peso muestra (g).
D: Tiempo de destilación (s).
E: Potencia de vapor (%).
G: Cambio de bureta (bureta de 25 ml- bureta de 10 mL).
F: Volumen de solución de NaOH (mL).
En la tabla 3 se presenta el diseño general de una matriz para la evaluación de la robustez,

según NC TS 368:2004.
Además se calculó la diferencia para cada factor, según las siguientes expresiones:
DA = ¼(s+t+u+v) - ¼(w+x+y+z) = A-a
DB = ¼(s+t+w+x) - ¼(u+v+y+z) = B-b
DC = ¼(s+u+w+y) - ¼(t+v+x+z) = C-c
DD = ¼(s+t+y+z) - ¼(u+v+w+x) = D-d
DE = ¼(s+u+x+z) - ¼(t+v+w+y) = E-e
DF = ¼(s+v+w+z) - ¼(t+u+x+y) = F-f
DG = ¼(s+v+x+y) - ¼(t+u+w+z) = G-g
Se determinaron los factores con diferencias significativas que influyen en los resultados
del ensayo, comparando los valores obtenidos de la diferencia para cada factor con la
expresión Sr√2; donde Sr es la desviación típica de la repetibilidad.
37
Tabla 3. Principio de descripción de una prueba de robustez según la norma NC TS-

368:2004
Factor Nº de la combinación o determinación

evaluado 1 2 3 4 5 6 7 8
Aóa A A A A a a a a
Bób B B b b B B b b
Cóc C c C c C c C c
Dód D D d d d d D D
Eóe E e E e e E e E
Fóf F f f F F f f F
Góg G g g G g G G g
Resultado s t u v w x y z
2.5 Incertidumbre de la medición

Para hacer posible la estimación de la incertidumbre de la medición se procedió calculando
la desviación típica de la reproducibilidad interna (NC TS 367:2004). Procedimiento que se
sigue de forma similar en todos los métodos.
Se llevaron a cabo determinaciones replicadas en muestras auténticas de cada uno de los
productos utilizados en el estudio. Se efectuaron treinta determinaciones a diferentes
tiempos, utilizando diferentes analistas.
Se calcularon s y RSD a partir de:
∑ (x − x)
2
s
s = RSD =
i
; 100
n −1 x *
38
donde:
s = desviación típica de la reproducibilidad interna

x = valor medio
i = 1, 2, …n
n = número de determinaciones
n
Se considera que la sumatoria Σ queda acotada como sigue: ∑

i =1
La incertidumbre fue expresada como una incertidumbre de la medición expandida (U)

utilizando el factor de cobertura recomendado (k =2) en NC TS 367:2004, lo que se
corresponde con un nivel de confianza de 95 %.
La incertidumbre de la medición expandida está dada por:
U = k x RSD x C;
donde:
k: factor de cobertura.
RSD: desviación típica relativa de la reproducibilidad.
c: concentración del analito.
2.6 Análisis estadístico
El procesamiento de los datos y la obtención de gráficos se llevó a cabo empleando los

programas de cómputo SigmaStat Versión 3.1 y SigmaPlot Versión 9.0.
En cada uno de los criterios de validación se emplearon y calcularon los estadígrafos

establecidos en la NC (NC TS- 368:2004).
39
Los resultados de la reproducibilidad (precisión) y la veracidad se procesaron además

mediante análisis de varianza simple y pruebas de comparación de medias ISO 3301:1975
para un nivel de significación α = 0,05.
40
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Capítulo 3 Resultados y Discusión
3.1. Precisión
3.1.1 Método 1 Microdifusión
En las tablas 4 y 5 se resumen los resultados obtenidos del estudio de la precisión del
método por Microdifusión, para lo cual se evaluaron los parámetros repetibilidad y
reproducibilidad.
Tabla 4. Resultados de la evaluación de la repetibilidad del método por Microdifusión

para la determinación de sulfitos en langosta
Indicadores Valor del indicador Criterios de Validación*

Media de los resultados 11,06
Desviación estándar (s) 0,94 s<3
Desviación típica (RSDr) 8,5 5-7
* Según NCTS 368:2006.
Se observa que la repetibilidad resultó no ser adecuada, según NCTS 368:2006.

Aunque la desviación estándar (s) es reducida dando una medida adecuada de
dispersión de los resultados de las réplicas alrededor de la media estadística; la
desviación típica relativa (RSDr) se encontró fuera del rango recomendado en dicha
norma. Siendo el parámetro RSDr un criterio de dispersión relacionado con el tamaño
de la media, a mayor RSD más impreciso es el mismo.
La evaluación de la reproducibilidad arrojó los resultados reflejados en la tabla 5,

presentando un comportamiento similar al estudio de la repetibilidad, con la variante
adicional del aumento de la desviación estándar, lo cual se explica por la mayor
variación de los factores que inciden sobre la realización del análisis: diferentes
analistas, soluciones, patrones y muestras, entre otros. Ambos resultados denotan que
el método es impreciso.
41
Tabla 5. Resultados de la evaluación de la reproducibilidad del método por

Microdifusión para la determinación de sulfitos en langosta
Indicadores Valor del indicador Criterios de Validación*
Media de los resultados 9,94
Desviación estándar (s) 1,13 s<3
Desviación típica (RSDR) 11,31 8 - 11
3.1.2 Método 2 Destilación Directa
Las tablas 6 y 7 resumen los resultados obtenidos del estudio de la repetibilidad y la

reproducibilidad en la determinación de metabisulfito de sodio en camarón por el método
Destilación Directa. Se puede observar (tabla 6) que la repetibilidad resultó ser
satisfactoria, ya que cumplió con los criterios de validación establecidos para este
parámetro según la NC TS-368:2004. La reducida desviación estándar, como se
mencionó, da la medida de una adecuada dispersión de los resultados de las réplicas
alrededor de la media; por otra parte la desviación típica relativa (RSDr) que relaciona
esta dispersión con la media también se encontró en el rango recomendado en la norma
cubana.
Tabla 6. Resultados de la evaluación de la repetibilidad del método por Destilación

Directa en camarón
Indicador Valor del indicador Criterio de validación*
Media 29,23
Desviación estándar 1,652 s<3
RSDr 5,65 5-7
42
En la tabla 7 se observa que también se obtuvieron resultados satisfactorios para la

reproducibilidad, cumpliéndose los criterios de validación recomendados por la NC TS-
368:2004 e IUPAC (2002); el valor de RSDR se encuentra por debajo de 8, quedando fuera
de los límites recomendados; pero al ser un criterio de dispersión, la obtención de una
RSDR más pequeña, denota que el método es más preciso que los valores mínimos
exigidos para reproducibilidad.
Tabla 7. Resultados de la evaluación de la reproducibilidad por Destilación Directa

para la determinación de sulfitos en camarón
Indicador Valor del indicador Criterio de validación*
Media 29,76
Desviación estándar 2,25 s<3
RSDR 7,55 8-11
*Según NCTS 368:2006.
3.1.3 Método 3 Destilación Rápida

Las tablas 8 y 9 resumen los resultados obtenidos del estudio del repetibilidad y
reproducibilidad en la determinación de sulfito por el Método 3, para niveles bajo y alto de
concentración correspondientes a 8,43 y 66,67 mg/kg (ppm) respectivamente.
Tabla 8. Resultados de la evaluación de la repetibilidad del método por Destilación

Rápida para la determinación de sulfitos en langosta
Valor del indicador Criterios de Validación*
Indicadores
Nivel bajo Nivel alto
Media de los resultados 8,43 66,67
Desviación estándar (s) 0 1,70 s<3
Desviación típica (RSDr) 0 2,55 5-7
43
Tabla 9. Resultados de la evaluación de la reproducibilidad del método por Destilación

Valor del indicador Criterios de Validación*
Indicadores
Nivel bajo Nivel alto
Media de los resultados 16,48 32,60
Desviación estándar (s) 1,79 2,96 s<3
Desviación típica (RSDr) 10,9 9,10 8-11
Estos resultados se corresponden con los valores aceptables recomendados para la

repetibilidad y la reproducibilidad en los rangos de trabajo según la NC TS- 368:2004,
existiendo el mismo comportamiento en los dos niveles de concentración estudiados.
En algunos trabajos de validación en alimentos (León, 2003; De Armas, 2003),

también se ha verificado la reproducibilidad mediante análisis de varianza (ANOVA).
Este procedimiento es muy potente para detectar diferencias entre grupos, por
ejemplo: entre analistas, entre laboratorios, en días diferentes, equipos diferentes,
etc.
Es importante aclarar que esta prueba estadística no está establecida como de

obligatorio cumplimiento en la norma cubana de validación para los métodos de
ensayo en alimentos (NCTS 368:2006). No obstante, como un criterio adicional para
valorar la reproducibilidad se realizaron para estos tres métodos analíticos, análisis de
varianza para la reproducibilidad entre laboratorios. Los resultados de estos se
resumen en las tablas 10-12.
44
Tabla 10. Análisis de varianza para la reproducibilidad del método 1 Microdifusión
Fuentes de Sumas de Grados de Cuadrado F p

variación Cuadrados Libertad Medio Relación de
varianzas
Total 262,05 13 - - -
Entre 156,73 1 156,73 19,72 0,0008
laboratorios
Error 95,32 12 7,94 -
Leyenda: F: relación de varianzas p: probabilidad del error. Existen diferencias significativas si

p < 0,05.
En el método 1 por Microdifusión (tabla 10) se obtuvo que el estadígrafo de F es

significativo (p< 0,05) lo cual indica que la varianza entre laboratorios es
significativamente mayor que la del error experimental, por lo que se corrobora la
imprecisión en la reproducibilidad de este método aspecto importante a considerar para
la aplicación en la práctica de esta técnica analítica. Si se observa en el Anexo 8, este
método es una técnica colorimétrica que requiere una mayor manipulación y el empleo
de un equipo de medición, aspectos que pueden estar afectados por errores
accidentales que influyen en la precisión de las mediciones.
En los métodos 2 y 3, por Destilación Directa y Rápida respectivamente, los

estadígrafos de Fisher no son significativos (p >0,05), lo cual indica que la varianza o
variabilidad entre laboratorios es significativamente menor que la del error experimental
(tablas 11 y 12). Al no detectarse diferencias significativas se confirma que la
reproducibilidad de estas dos últimas técnicas de análisis realizadas en diferentes
laboratorios es satisfactoria.
45
Tabla 11. Análisis de varianza para la reproducibilidad del método 2 Destilación

Directa

variación Cuadrados libertad Medio Relación
de varianza
Total 29 - - -
Entre 8,533 1 8,533 1,73 0,198
laboratorios
Error 137,89 28 4,290 -

p < 0,05.
Tabla 12. Análisis de varianza para la reproducibilidad del método 3 Destilación

Rápida

variación Cuadrados libertad Medio Relación de
varianza
Total 0,0327 17 - -
Entre 0,0090 2 0.0045 2,475 0,117
laboratorios
Error 0,0237 15 0,0018

p < 0,05.
46
3.2 Límite de cuantificación
Según la norma cubana para la validación de métodos de ensayo en alimentos (NCTS
368:2006), el límite de cuantificación se calcula multiplicando la desviación estándar

de los ensayos en blanco por 10.
3.2.1 Método 1 por Microdifusión
Para este método los resultados del cálculo del parámetro límite de cuantificación
demuestran que 1,30 ppm es la cantidad más baja que se cuantifica por esta técnica
analítica con un 95 % de confianza, ya que la desviación estándar (s) de los ensayos
en blanco fue 0,130.
3.2.2 Método 2 por Destilación Directa
En este caso como la desviación estándar de los blancos arrojó un valor de 1,265, el
límite de cuantificación para este método corresponde a 12,65 ppm, y esta es la
cantidad más baja que se puede cuantificar por este método analítico, con un 95 % de
confianza.
3.2.3 Método 3 por Destilación Rápida
En caso del método 3, los resultados demuestran que 16,43 ppm es la cantidad más
baja que se cuantifica ya que la desviación estándar de los blancos fue de 1,643.
Resultado similar (20 mg/kg) se ha reportado para el método de Monier – Williams
para la sensibilidad (AOAC, 1994).
Como se ha visto los tres métodos objeto de validación cumplen con los requisitos de
determinar residual de sulfito en cantidades menores a las 30 ppm (mg/kg) expresado
como SO2, este valor esta establecido como límite permisible en la parte comestible
47
del producto cocido (EUSKADINET, 2006), es por ello que se ha tomado como
referencia para el límite de cuantificación.
3.3 Veracidad
3.3.1 Método 1 por Microdifusión
Por tratarse de un método colorimétrico, fue necesario primeramente evaluar el

cumplimiento de la linealidad de la curva patrón. Los resultados de la curva patrón se
muestran en la figura 3 donde se observa aparentemente una buena linealidad ya
que todos los puntos caen en la recta o muy próximos a ella.
Figura 3. Curva patrón de la determinación colorimétrica de sulfitos del método por

Microdifusión.
48
El ajuste de la curva a una línea recta se puede comprobar también mediante análisis
de varianza de la regresión lineal, tal como se muestra en la tabla 13. Como se
aprecia la regresión es significativa (p < 0, 05) lo cual indica que la curva patrón es
perfectamente lineal.
Tabla 13. Análisis de varianza para la regresión lineal del método 2 Destilación Directa
Sumas de Cuadrado
G.L F P
cuadrados medio
Regresión 0,672280 1 0,672280 3151,313 0,0000
Error 0,000853 4 0,000213
Total 0,673133 5
p < 0,05.
La linealidad de la curva de calibración de este método analítico se corrobora ya que se

cumplen todos los criterios establecidos para la linealidad en la norma cubana (Tabla
14).
Tabla 14. Resultados obtenidos para la linealidad curva patrón del método por
Microdifusión
Indicador Resultados obtenidos Criterios de validación*

Ecuación de la recta y = 0,0653 x +0,0133 Y= bx+a
Coeficiente de
2
0,998 ( 99,8%) r2> 98%
determinación (r )
r (n − 2)
Prueba de correlación tcal = tcal > ttab
(1 − r 2 )
lineal (tcal) ttab = 1,895
tcal = 187,10
Coeficiente de correlación
0,998 R > 0,99
(R)
Según NCTS 368:2004.
49
Ahora bien, para determinar la veracidad como tal del método de Microdifusión, se
evaluó solo para 2 niveles de concentración de metabisulfito: 25 y 50 ppm, utilizando
solución patrón de Na2S2O5 al 85 porciento de pureza. En todos los casos los
resultados demostraron que el porciento de recuperación (R) obtenido para cada nivel
de concentración quedó incluido en el rango de 80-110 %, por lo que fue suficiente
ensayar el procedimiento sólo tres veces (NC TS 368:2006). Los principales
resultados se reflejan en la Tabla 15.
Tabla 15. Resultados de la evaluación de la veracidad del método por Microdifusión

para la determinación de sulfitos en langosta
Cantidad Cantidad
R media Criterio de
Niveles añadida recuperada s texperimental
(%) Validación*
(mg) media (mg)
25 18,06 15,97 88,48 5,83 6,76

texp < t(1-α),ν
tteo = 2,145
50 54,18 50,88 93.77 4,51 5,01
Donde: R- Por ciento de recuperación.
s – Desviación estándar.
CV – Coeficiente de variación de los porcientos de recuperación.
Aunque el porcentaje de recuperación en ambos niveles fue elevado, el valor

calculado de texp incumple con el criterio de validación, lo que permite plantear que
existen diferencias significativas entre los valores reales en las muestras y los
resultados determinados por el método en estudio. Estos resultados pudieran ser
atribuidos al elevado coeficiente de variación (6,8 y 5,0 respectivamente, para cada
nivel en estudio). Las causas de estas altas variaciones pueden ser factores como
laboriosidad de la técnica y las consecuentes pérdidas de analito durante el ensayo,
50
pero no se deben al método colorimétrico como tal pues su curva patrón si se

demostró que era lineal (tablas 13 y 14).
También se observa en la tabla 15 que a niveles altos de concentración, el grado de

recuperación es mayor, demostrando que la sensibilidad del método es mayor a altas
concentraciones de analito.
En esta oportunidad no fue posible analizar la linealidad del sistema mediante ANOVA
o los criterios de linealidad establecidos; esto se debe a que solo se determinó la
recuperación para dos niveles del analito (25 y 50) y aunque estén muy replicadas las
determinaciones individuales solo hay dos puntos y se requieren como mínimo tres.
3.3.2 Método 2 por Destilación Directa
La veracidad en este método se evaluó por la recuperación adicionando al blanco,

patrón del analito en tres niveles (12, 50 y 100 ppm) y determinando el analito
recuperado. Los resultados se muestran en la tabla 16.
Tabla 16. Resultados de la evaluación de veracidad del método por Destilación Directa
Cantidad Cantidad
Niveles R media Criterio de
añadida recuperada s texperimental
(ppm) (%) Validación*
(ppm) media (ppm)
12 8,0 7,6 92,0 3,04 3,15

texp < t(1-α),ν
50 20,4 19,2 94,1 2,75 2,85
tteo = 4,303
100 70,8 67,52 95,3 2,84 2,91
Según NCTS 368:2004.
Se obtuvo en todos los casos que el porcentaje de recuperación obtenido para cada
nivel quedó incluido en el rango 80-110% por lo que fue suficiente ensayar el
procedimiento solo tres veces tal como se estipula en la norma (NC TS-368:2004).
51
Como se aprecia en los tres niveles se cumple el criterio de validación exigido en la

norma para la veracidad, que t calculada sea menor que la t tabulada.
En la figura 4 se muestra la representación gráfica de la recta correspondiente a la

ecuación de regresión lineal obtenida como resultado del tratamiento estadístico de los
datos de la recuperación. Es importante aclarar, que no se debe confundir la linealidad
de una curva patrón o de un método de análisis con la obtenida en el proceso de
validación de la recuperación para valorar la veracidad.
metabisulfito recuperado (mg) = -.0810 + .95818 * metabisulfito añadido (mg)

Correlation: r = 0.99999
18
16
14
metabisulfito recuperado (mg)
12
10
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
metabisulfito añadido (mg) 95% confidence
Figura 4. Curva de recuperación de sulfitos del método por Destilación Directa
Como se aprecia existe una buena linealidad. No obstante para verificar los criterios que
definen la linealidad de la recuperación en la tabla 16 se resumen los principales
elementos para conocer la correlación existente entre las cantidades medias
52
recuperadas y las añadidas. El porcentaje de recuperación (R), en todos niveles fue

elevado y el valor calculado de texp también cumplió con el criterio de validación
establecido para la veracidad, lo que permite plantear que no existen diferencias
significativas entre los valores reales en las muestras y los resultados determinados por
el método en estudio, de ahí que este posea una exactitud satisfactoria.
Tabla 16. Resultados obtenidos en el estudio de la linealidad del porcentaje de

recuperación del método por Destilación Directa

Ecuación de la recta Y = 0,95818x-0.0810 Y= bx+a
Coeficiente de determinación (r2) 0,9999 (99,9 %) r2≥ 98 %
r (n − 2)
Prueba de correlación lineal tcal = tcal > ttab
(1 − r 2 )
(tcal) ttab = 1,895
tcal = 187,10
Coeficiente de correlación (R) 0,9998 R > 0,999
• Según NCTS 368:2004.
Se observa que el valor de R, está muy cercano al máximo posible (1), lo cual indica que
existe un alto grado de correlación entre las variables metabisulfito de sodio añadido y
metabisulfito de sodio recuperado, con una probabilidad elevada de que exista dicha
relación. El alto coeficiente de determinación (r2), por otra parte, indica que la variable
metabisulfito de sodio añadido explica en un 99,99% la varianza total del metabisulfito de
sodio recuperado (NC TS-368:2004).
Los resultados obtenidos permiten expresar que existe una buena correlación entre ppm
de metabisulfito de sodio añadidos y ppm recuperados, por lo que se demuestra la
satisfactoria veracidad del método. No obstante otro criterio que corrobora la linealidad es
el análisis de varianza, cuyos resultados se muestran en la Tabla 17. Como se puede
observar la regresión lineal es significativa p < 0,05, luego por esta prueba estadística
53
también se corrobora que existe linealidad entre las variables metabisulfito de sodio
añadido y recuperado.
Tabla 17. Análisis de varianza para la regresión lineal del método 2 Destilación Directa
Sumas de Cuadrado
G.L F P
cuadrados medio
Regresión 8705,02 1 8705,02 8216,68 0,0000
Error 5,297 5 1,059
Total 8710,31 6
p < 0,05.
Como este método utiliza un destilador automático es conveniente aclarar que la

medición de la eficiencia del equipo fue determinada mediante el empleo del reactivo puro
y arrojó un valor de 82,56 %, valor considerado aceptable por el fabricante del equipo (IT-
ANT-10.1/3 Antártica. 2005).
En el estudio de la veracidad del método por Destilación Rápida, también se evaluaron 3

niveles de concentración del analito añadido por duplicado. La tabla 18 muestra los
resultados de los análisis de recobrado. Como se aprecia los mismos se hallaron entre
95,04 y 100,59 %, valores admisibles para elementos traza; además no se detectaron
diferencias significativas entre estos resultados y el valor de 100 para un nivel de
significación α = 0,05 lo cual muestra que el método presenta buenos niveles de
recuperación del analito.
54
Tabla 18. Resultados de la evaluación de la veracidad del método por Destilación

Cantidad Cantidad
R media Criterio de
Niveles añadida recuperada s texperimental
(%) Validación*
(ppm) media (mg)
30 23,0 28,51 95,04 2,07 2,162

texp < t(1-α),ν
50 43,0 49,68 99,35 2,21 0,461
tteo = 2,262
100 93,0 100,59 100,59 2,02 2,123
Tabla 19. Resultados obtenidos en el estudio de la linealidad del porcentaje de

recuperación del método por Destilación Rápida

Ecuación de la recta y = 0,0651 x +0,0979 Y= bx+a
Coeficiente de determinación (r2) 0,986 (98,6%) r2≥ 98 %
r (n − 2)
Prueba de correlación lineal tcal = tcal > ttab
(1 − r )
2
(tcal) ttab = 1,895
tcal = 187,10
Coeficiente de Correlación (R) 0,994 R ≥ 0,99
Tal como se muestra en la tabla anterior, el método 2 de Destilación Rápida cumple con los
criterios de validación en el ensayo de recuperación respondiendo a una línea recta; su
coeficiente de determinación ( r2 ) informa que más del 98 % de las desviaciones se deben
a la regresión lineal, su alto coeficiente de correlación ( R ) indica una alta asociación entre
el volumen de yodo consumido y la cantidad de sulfitos recuperados. Estos resultados se
pueden visualizar en la figura 5.
55
Figura 5. Curva de recuperación de sulfitos del método Destilación Rápida
Como un criterio adicional de la verificación de la linealidad de la recuperación se

realizó el análisis de varianza correspondiente (Tabla 20) obteniéndose también que la
regresión es significativa.
Tabla 20. Análisis de varianza para la regresión lineal del método 3 Destilación
Rápida.
Sumas de Cuadrado
G.L F P
cuadrados medio
Regresión 1,061 1 1,061 353,52 0,001
Error 0,0120 4 0,003 1
Total 1,073 5 0,215
p < 0,05
56
Un análisis parcial de los resultados de validación hasta aquí obtenidos evidencia que el
método 1 de Microdifusión no cumple con criterios fundamentales de validación como son
la precisión y la veracidad, por otra parte ambos métodos de destilación si satisfacen los
tres criterios de validación analizados.
Teniendo en cuenta lo antes mencionado, se decidió no continuar gastando reactivos,

tiempo de trabajo y recursos, con la validación del método por Microdifusión ya que el
mismo no es preciso ni veraz; es por ello que si se desea utilizar en un futuro deberá
someterse a modificaciones y adaptaciones que mejoren sus cualidades analíticas. Por
estos motivos los restantes criterios de validación solo se verificarán en los métodos por
Destilación Directa y Rápida.
3.4 Sensibilidad
En la figura 6 se presenta la recta correspondiente a la ecuación de la curva patrón

realizada añadiendo diferentes masas de patrón de metabisulfito de sodio (0,64 – 5,54) a
muestras blanco de camarón (tabla 8) para evaluar la sensibilidad del método 2.
Según la NC TS 368:2004, la sensibilidad de un método analítico se determina por la

pendiente de la curva en cada punto de la misma, como puede observarse, en este caso la
ecuación de la curva se corresponde con la de una recta por lo que en todos los puntos la
pendiente es constante, en este caso igual a 1,021, lo que demuestra que la sensibilidad del
método es suficiente para determinar sulfito residual a niveles superiores a 30 ppm.
57
me abisu lf ito dete rminado (mg) = -.10 45 + 1.0213 * metabis ulfito en la muestra (mg )
Correlation: r = .99975
6
5
meabisulfito determinado (mg)
0
0 1 2 3 4 5 6
metabisulf ito en la mu estra (mg) 95% confidence
Figura 6. Curva patrón para la determinación de sulfitos por el método de Destilación Directa
Para la estimación de la sensibilidad de este método se procedió de la misma forma, en la

figura 7 se presenta la curva patrón realizada añadiendo diferentes masas de patrón de
metabisulfito de sodio a muestras blanco de langosta. Se aprecia una respuesta lineal y
directamente proporcional para cada concentración de dióxido de azufre ensayada y el
volumen de la solución valorante en el rango de trabajo. La ecuación de la recta es:
y = 0,651 x + 0,0979 y el coeficiente de regresión lineal (R) resultó adecuado con un valor
de 0,994; mientras el coeficiente de determinación (R)2 es de 0,989. El valor del intercepto
de 0,0979 se corresponde con la respuesta positiva obtenida del ensayo en blanco, debido
a que ácido clorhídricos puro presenta trazas mínimas de dióxido de azufre. Dado que las
58
muestras precocinadas pueden presentar valores inferiores a 5 ppm, es importante que el

límite máximo de dióxido de azufre en el ácido utilizado sea mínimo. Experimentalmente se
obtuvieron resultados óptimos cuando el residual en el ácido es menor o igual a 0,05 mg/kg.
Como se ha mencionado, según la NC TS 368:2004, la sensibilidad de un método analítico
se determina por la pendiente de la curva en cada punto de la misma, como puede
observarse en la Figura 7, en este caso también la ecuación de la curva se corresponde con
la de una recta, por lo que en todos los puntos la pendiente es igual y en este caso tiene un
valor de 0,651, lo que demuestra que la sensibilidad del método es satisfactoria.
Linealidad del método
1,6
1,4
Volumen de Iodo consumido
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
Cantidad de recuperada de SO2

mg de SO2 recuperados vs Volumen de iodo consumido en ml
curva de regresion lineal
Figura 7. Curva de regresión lineal del método Destilación Rápida
Ecuación de regresión lineal: mL I2 consumidos = 0,0979 + (0,651 * mg SO2)

donde: r2 = 0,989
59
3.5 Robustez.
Como se planteó en materiales y métodos se elaboraron diferentes matrices para valorar la

robustez tal como lo establece la NC TS-368:2004, en el método 2 las condiciones reales
establecidas se presentan en la Tabla 20.
Tabla 20. Matrices específicas para cada ensayo en la evaluación del Parámetro de
validación Robustez en el Método 2 Destilación Directa
Factores Réplicas de Análisis
alterados 1 2 3 4 5 6 7 8
A 200 200 200 200 203 203 203 203
B 20 20 19 19 20 20 19 19
C 45 50 45 50 45 50 45 50
D 3 3 4 4 4 4 3 3
E 1 2 1 2 2 1 2 1
F P L L P P L L P
G N V V N V N N V

alterados 1 2 3 4 5 6 7 8
A 200 200 200 200 197 197 197 197
B 20 20 21 21 20 20 21 21
C 45 40 45 40 45 40 45 40
D 3 3 4 4 4 4 3 3
E 1 2 1 2 2 1 2 1
F P L L P P L L P
G N V V N V N N V
60
Los resultados obtenidos luego de realizar las determinaciones con los pequeños
cambios efectuados según esas matrices se muestran en las tablas 21 y 22.
Tabla 21. Resultados de la primera matriz diseñada para la evaluación de la

robustez del método por Destilación Directa en camarón
Factores Valores del Concentración
evaluados factor Total Diferencia
A 200 32
0,8
a 203 31,2
B 20 32,8
2,4
b 19 30,4
C 45 31,2
0,8
c 50 32
D 1 30,4
2,4
d 2 32,8
E 3 32
0,8
e 4 31,2
F P 31,2
0,8
f L 32
G N 28,8
g V 34,4 5,6*
*Diferencias significativas para un nivel de α=0,05.
Tabla 22. Resultados de la segunda matriz diseñada para la evaluación de la

robustez del método por Destilación Directa en camarón
Factores Valores del Concentración
evaluados factor Total Diferencia
A 200 32
0,8
a 197 32,8
B 20 32,8
0,8
b 21 32
C 45 32,8
2,8
c 40 32
D 1 33,6
2,4
d 2 31,2
E 3 32
0,8
e 4 32,8
H P 32,8
0,8
h L 32
G N 30,4
g V 34,4 4,0 *
*Diferencias significativas para un nivel de α=0.05.
61
Al comparar los resultados de las diferencias mostradas en las tablas 21 y 22 con el valor
de Sr√2 se obtuvieron diferencias significativos (α=0,05) solo para el factor disolución de
yodo. Esta situación era de esperar, ya que según Koltov y col. (1957), una fuente de error
en los análisis yodométricos es la relativa facilidad con que se sublima el yodo de sus
disoluciones, de ahí que sea necesario estandarizar la disolución de este agente valorante
previo a su utilización o de lo contrario realizar las determinaciones con una disolución de
yodo recién preparada.
3.5.2 Método 3 Destilación Rápida

Para evaluar la robustez del método 3, la matriz de pequeñas variaciones diseñadas se
presenta a continuación (tabla 23):
Tabla 23. Matrices específicas para cada ensayo de robustez en el Método 3

por Destilación Rápida

alterados 1 2 3 4 5 6 7 8
A 10 10 10 10 20 20 20 20
B N N V V N N V V
C 20 50 20 50 20 50 20 50
D 360 360 210 210 210 210 360 360
E 100 90 100 90 90 100 90 100
F 20 5 5 20 20 5 5 20
G 25 10 10 25 10 25 25 10
Los resultados obtenidos luego de realizar las determinaciones por el Método 3 se

muestran en la Tabla 24.
62
Tabla 24. Resultados obtenidos en el estudio de la robustez por el Método de

Destilación Rápida para la determinación de sulfitos en langosta.
Rango Diferenci
Criterio de Resultado de la
Parámetros de a
validación comparación
valores Obtenida
Peso de muestra ( g ) 20-50 12,31 Significativa
Tiempo de destilación (s) 210 -360 4,29 Significativa
Tipo de bureta (mL) 25 - 10 3,23 Menor
Iodo N-V 1,97 Sr √2 = 4 Menor
Vapor 90-100 1,90 Menor
HCL ( mL) 10 -20 -1,00 Menor
NaOH ( mL) 5 -20 -2,27 Menor
Donde Sr: desviación estándar del método al nivel 2 en Repetibilidad
Según se aprecia en la tabla anterior, al comparar la diferencia obtenida con el criterio de

validación de valor Sr√2, se obtuvieron diferencias significativas para un nivel de
confianza de 0,05 correspondientes a los factores peso de muestra y tiempo de
destilación; demostrando así que estos deben controlarse en el proceso rigurosamente,
para evitar la interpretación de resultados erróneos o desviados de las características
reales. Las causas que originan este comportamiento se explican mediante la relación
entre la potencia eficiente del equipo y la temperatura que se aporta a la muestra, la cual
puede determinar un exceso de vapor que arrastre iones sulfito, no dando tiempo a su
disolución en la solución colectora.
Se encontró que el tiempo óptimo de destilación es de 360 s y la cantidad a ensayar debe

estar entre los 20 y 25 + 0,01 g.
El hecho de haber realizado la preparación de las muestras de ensayo a partir de lo

establecido en NC 274:2003 y haber obtenido resultados satisfactorios en los diferentes
63
métodos evaluados, permite expresar que los procedimientos 2 y 3 son válidos para el
objetivo que se persigue.
3.6 Evaluación de la Incertidumbre de cada método de ensayo evaluado
En la tabla 25 se presentan los resultados obtenidos en la medición de la incertidumbre

de los 3 métodos analíticos evaluados con un 95 porciento de confianza, a partir de la
realización de 30 determinaciones bajo condiciones de reproducibilidad interna.
Tabla 25: Resumen de la determinación de la incertidumbre de los métodos

evaluados: Microdifusión (1), Destilación Directa (2) y Destilación Rápida (3)
Métodos Media s RSD U Intervalo de Incertidumbre
1 9,21 2,17 0,2354 4,33 9,21 + 4,33
2 29,76 2,25 0,0756 4,49 29,76 + 4,49
3 15,03 2,57 0,1709 5,13 15.03 + 5,13
En la medición del contenido de metabisulfito en las muestras por los tres métodos
evaluados se obtuvo que el mismo se encuentra por debajo del límite máximo permisible
(30 ppm), aún cuando este se extienda a lo largo de todo el intervalo de incertidumbre, por
lo que no existen riesgos de incumplirse con la especificaciones de calidad establecidas por
los productores y sus normativas internas. De forma general, puede expresarse que la
incertidumbe de los tres métodos no supera los 5,13 ppm.
3.7 Análisis integral de los métodos seleccionados
Como se discutió anteriormente, el Método 1 Microdifusión no cumple con criterios

fundamentales de calidad analítica como son la precisión y la veracidad, por ello en este
método no se llevaron a cabo los restantes criterios de validación y se descartó para su
64
utilización inmediata como control de calidad. Los métodos seleccionados para aplicarse en
la industria pesquera fueron el método 2 por Destilación Directa y el método 3 por
Destilación Rápida.
Ambas técnicas analíticas fueron validados en diferentes matrices, tal como se mencionó
en el capítulo 2 de Materiales y Métodos, por lo que es incorrecto hacer un estudio
comparativo del cumplimiento de los criterios de validación, pero si es importante analizar
de forma individual sus posibilidades de aplicación teniendo en cuenta los reactivos,
equipos que utiliza, tiempo de ensayo, entre otros. Los resultados de este análisis se
muestran en la Tabla 20.
Tabla 26. Análisis integral individual de los métodos seleccionados.

Método 2 Método 3
Indicador
Destilación Directa Destilación Rápida
Precisión:
-Repetibilidad Cumple Cumple
-Reproducibilidad Cumple Cumple
Veracidad Cumple Cumple
Límite de detección Cumple Cumple
Sensibilidad Cumple Cumple
Robustez Cumple Cumple
Cristalería Abundante Mínima
Equipos No Sí (Destilador automático)
Reactivos Iguales reactivos
Tiempo de análisis 2 horas (más lento) 6 minutos (más rápido)
Valoración del costo Menor Mayor
En general como se ha discutido ambos métodos cumplen satisfactoriamente con los

criterios de calidad analítica exigidos en la norma; entre sus diferencias fundamentales se
encuentra la del equipamiento necesario para su desarrollo; el método 3 se hace más
costoso ya que requiere la inversión en un destilador al vapor que tiene la posibilidad de
65
contar con valoración automática. No obstante, al ser el desarrollo de su técnica más

rápida, se hace ideal para el control de la calidad en la industria pesquera, pues al acortar el
tiempo de destilación, disminuye las fugas de sulfito disuelto en el vapor de condensación y
hace mas preciso el resultado.
De igual forma, el método 2 al ser más convencional posibilita su uso en laboratorios menos
sofisticados y a un menor coste de realización; por lo que se considera que ambos pueden
ser utilizados con éxito en la industria en dependencia de las condiciones analíticas con que
se cuente en los laboratorios de control de la calidad.
66
CONCLUSIONES
; Los métodos por Destilación Directa y Rápida resultaron precisos no así el de

Microdifusión que no cumplió con los criterios de validación establecidos para la
repetibilidad y la reproducibilidad.
; Los tres métodos satisfacen el criterio del límite de cuantificación al ser capaces de
determinar residual de sulfito en cantidades menores a 30 ppm. El método de
Microdifusión no cumplió con los criterios exigidos para la veracidad por lo que se
descarta como método analítico para su introducción inmediata en el control de la
calidad de la industria pesquera.
; Los métodos iodométricos por Destilación Directa y Rápida resultaron validados en el

Laboratorio de Calidad de PRODAL y en el Laboratorio de Química del CIP. Ambos
cumplieron con todos los parámetros establecidos en la norma cubana de validación.
Demostrando su factibilidad para ser utilizados en los laboratorios para los ensayos de
rutina en el control de la calidad del residual de metabisulfito en la industria pesquera.
; La incertidumbre de los tres métodos está por debajo del límite máximo permisible,
aún cuando este se extienda a lo largo de todo el intervalo de incertidumbre.
66
RECOMENDACIONES
A fin de continuar la profundización del estudio del residual de sulfito como parámetro
de calidad para la producción o elaboración de productos a base de mariscos, se
propone:
a. Estudiar con profundidad los factores que pueden condicionar el desarrollo de las
técnicas, así como el resultado a obtener en los ensayos que fueron seleccionados en
el presente estudio para el control de la calidad del residual de metabisulfito en
mariscos; a partir del análisis de dos momentos diferentes: incertidumbre del ensayo e
incertidumbre en la acción del analista.
b. Realizar un estudio de correlación estadística entre ambos métodos a fin de

determinar las principales diferencias entre los mismos.
c. Elaborar los procedimientos operacionales de trabajo de estos ensayos para los

laboratorios de la industria pesquera; estableciendo la posibilidad de alternar su uso
en dependencia de as condiciones de trabajo que se tenga en cada instalación.
67
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ANEXOS
Anexo 1
Distribución de las diferentes partes anatómicas de la langosta
Partes del cefalotórax % que representa
Antenas 14,2
Anténulas 0,6
Patas 20,6
Esternón 0,6
Ojos y tallos oculares 0,3
Resto del cefalotórax 54,7
Total 93,0 (a)

(a) El 7% que falta corresponde a órganos como el hepatopáncreas, 3.37%; las
gónadas, 3,16% y los líquidos abdominales
Partes del cefalotórax % que representa
Carne extraída mecánicamente 26,3

Carapacho húmedo semilimpio 62,8
Pérdida mecánica 10,9 (b)
Exoesqueleto desproteinizado 20,0

seco
(b) Esta pérdida se corresponde a los líquidos abdominales y a una

proteolisis que se observa en el hepatopáncreas y tejidos adyacentes debido
enzimas de esta glándula digestiva.
Referencia: Bartullo, V. ¨Tecnología de los productos y sub-productos de pescado, moluscos y

ANEXOS
Anexo 1 continuación
Rendimiento del cefalotórax de ejemplares frescos de langosta

Partes del Cefalotórax % del % del
ejemplar cefalotórax
65,61 ------
Total
Parte comestible 50,00 26,30
Exoesqueleto 16,51 20.00
Gónadas 1,64 2,50
Hepatopáncreas 3,28-3,61 5,0-5,5
Quitina 2,05 3,12
Albúmina 5,00 2,63
Agua 71,9 72,10
Quitosano 2,00 3,00
Clorhidrato de Glucosamina 2,01 3,06
Composición química aproximada del músculo de la cola de langosta

Componentes %±σ
19,90 ± 1,77
Proteínas
Lípidos 0,68 ± 0,13
Humedad 73,56 ± 1,96
Cenizas 1,95 ± 0,02
Carbohidratos 1,80 ± 1,00
Valor energético 92,52 Cal/100g
Contenido en macro y micro elementos esenciales en el músculo crudo de la cola de

langosta (mg/100g)
Elementos X ±σ
Hierro 0,500 ± 0,027
Cobre 0,100 ± 0,24
Sodio 2,26 ± 0,74
Potasio 2,73 ± 0,64
Contenido en Tiamina en el músculo de la cola de langosta cruda

Vitamina x (mg/100g)
Tiamina (B1) 0,05
Referencia: Bartullo, V. ¨Tecnología de los productos y sub-productos de pescado, moluscos y

ANEXOS
Anexo 2
Comparación entre las composiciones químicas del Camarón de mar y el de cultivo
COMPARACIÓN ENTRE PRODUCTOS

Características
Camarón entero cultivo fresco Camarón entero marino fresco
Energía(Kcal/100g) 92 95
Humedad 76.5 76.1
Proteína 20.1 20.3
Lípidos 0.9 0.9
Ceniza 1.6 1.3
Carbohidratos 1.0 1.4
Referencia: Pérez, N. Comunicación personal. Departamento de Control de Calidad. Laboratorios

CubaControl SA. 2005
ANEXOS
Anexo 3
Composición aproximada del Camarón de cultivo
Scientific Name: Penaeidae and Pandalidae NDB No: 15149 (Nutrient values and weights are for edible
portion)
Value per Value per
Nutrient Units Vitamins Units
100 grams 100 grams
Vitamin C, total
Proximates mg 2,0
ascorbic acid
Water g 75,86 Thiamin mg 0,028
Energy kcal 106 Riboflavin mg 0,034
Protein g 20.31 Niacin mg 2,552
Total lipid (fat) g 1,73 Pantothenic acid mg 0,276
Ash g 1,20 Vitamin B-6 mg 0,104
Carbohydrate, by difference g 0,91 Folate, total mcg 3
Fiber, total dietary g 0,0 Folic acid mcg 0
Sugars, total g 0,0 Folate, food mcg 3
Minerals Folate, DFE mcg_DFE 3
Calcium, Ca mg 52 Vitamin B-12 mcg 1,16
Vitamin B-12,
Iron, Fe mg 2,41 mcg 0,0
added
Magnesium, Mg mg 37 Vitamin A, IU IU 180
Phosphorus, P mg 205 Vitamin A, RAE mcg_RAE 54
Potassium, K mg 185 Retinol mcg 54
Vitamin E (alpha-
Sodium, Na mg 148 mg 1,10
tocopherol)
Tocopherol,
Zinc, Zn mg 1,11 mg 0,10
gamma
Copper, Cu mg 0,264 Vitamin D IU 152
Manganese, Mn mg 0,050
Selenium, Se mcg 38,0
Referencia: Base Nacional de datos Nutricionales para referencias estandar (2005). USA.
ANEXOS
Anexo 4
Requisitos de calidad del Camarón. Según NC 115: 2001. Camarón. Especificaciones.
Requisitos de calidad
Requisitos Requisitos Requisitos Requisitos Requisitos
organolépticos físicos higiénicos. microbiológicos químicos.
Aspecto. Los
camarones estarán
limpios, exentos de
Microorganismos
materias extrañas y
Temperatura: aerobios
defectos físicos tales
No será superior mesófilos. Límite
como
a –18 º C en el máximo
semidescabezados,
centro térmico permisible: M= 1 x
melanosis,
del producto. 105 UFC/g
deshidratación,
m= 1 x 104 c= 2
dañados, partidos,
caparazón blando y
no existirá liga ni
alteración del color
Color. Para el
camarón de la El producto se Residual de
Peso neto: Los Coliformes dióxido de
plataforma marina el elaborará
envases y fecales. Límite azufre Límite
caparazón será teniendo en
embalajes máximo máximo
rosado o blanco cuenta lo
tendrán el permisible: M= 2.1 permisible 100
según la especie y el establecido en
contenido NMP/g. m= 0,3 mg/kg.
hábitat y para el la NC 143 y la
declarado. c= 2
camarón de cultivo NC 38-04-02.
será grisáceo según
la especie y el hábitat
Sabor. Característico Clasificación:
a marisco fresco. Los envases
tendrán una
Olor. Característico a
clasificación Estafilococos
marisco fresco. uniforme, cada patógenos. Límite
pieza estará bien máximo
clasificada de permisible:
Textura. Firme, acuerdo a su M=1000 UFC/g.
elástica y caparazón talla, el número m=100 UFC/g.
de piezas varía c= 2
firmemente adherido de acuerdo a
a la masa. esto en cada
envase.
Referencia: NC 115:02. ¨Camarón. Especificaciones de Calidad¨. CEN. Ciudad de la Habana.2002

ANEXOS
Anexo 5
Requisitos de calidad de la Langosta. Según NC 114: 2001. Langosta. Especificaciones.
Requisitos de calidad
Requisitos Requisitos Requisitos Requisitos Requisitos
organolépticos físicos higiénicos. microbiológicos químicos.
Aspecto. El producto Temperatura:
terminado estará No será superior
limpio, exento de a -18 ºC en el
Microorganismos
escaramujos, centro térmico
aerobios
materias extrañas, del producto
mesófilos. Límite
sin manchas ni para los
máximo
deshidratación. Las congelados, de 0
permisible: M= 1 x
piezas no tendrán a 5 º C para los
105 UFC/g
orificios en el frescos y vivos
m= 1 x 104 c= 2
caparazón, ni otros de 15-17 º C
daños que afecten la para la langosta
carne ni la presencia viva en el medio
del producto. de transporte. Residual de
El producto se
Color. Caparazón Coliformes dióxido de
Peso neto: Los elaborará
anaranjado rojizo, fecales. Límite azufre Límite
embalajes teniendo en
variando este tono de máximo máximo
tendrán el cuenta lo
acuerdo con su permisible: M= 2.1 permisible 100
contenido establecido en
hábitat. Carne blanca NMP/g. m= 0,3 mg/kg (crudo),
mínimo la NC 143 y la
o rosada brillante, c= 2 30 mg/kg
establecido. NC 38-04-02.
según la especie. (cocido)
Sabor. Característico Clasificación:
a marisco fresco. Los embalajes
Olor. Característico a tendrán una
Estafilococos
marisco fresco, libre clasificación
patógenos. Límite
de olores extraños. uniforme, cada
máximo
pieza estará bien
permisible:
clasificada de
M=1000 UFC/g.
acuerdo a su
m=100 UFC/g. c=
Textura. Firme y talla, el número
2
elástica. de piezas varía
de acuerdo a
esto en cada
embalaje.
Referencia: NC 114:02. ¨Langosta. Especificaciones de Calidad¨. CEN. Ciudad de la Habana.2002

ANEXOS
Anexo 6
Especificaciones del uso de aditivos en la Industria Pesquera
Aditivos Alimentarios
Homologado con la DIRECTIVA 95/02/EC relativa a aditivos alimentarios de la productos de la
pesca
Dosis máxima mg/kg
o mg/L Criterios de
Producto No E Denominación
Norma realización
95/02/EC
cubana
Quantum safis
Pescados , crustáceos y moluscos (significa que no se
no elaborados incluidos los E330 Ácido Cítrico especifica ningún -
congelados y ultracongelados nivel máximo de su
uso)
Crustáceos frescos, congelados y
150 100
ultracongelados
Hasta 80
150 NC XXX:
unidades
E Metabisulfito 2006 (en
Crustáceos Entre 80 y 120
223 sódico 200 100 aprobación
Paneidae unidades
por la ONN)
Mas de 120
300
unidades
Crustáceos cocidos 50 30
Referencia: Resolución No 108 del 2006. MIP. Cuba

ANEXOS
Anexo 7
Códigos CE de identificación de Sulfitos como aditivos alimentarios
Referencia: Resolución No
++108. Anexo IV.Äditivos Alimentarios¨. MIP. Cuba. 2006
ANEXOS
Anexo 8
Técnicas para el estudio de Validación
I. Determinación de sulfito total en alimentos. Destilación directa (De Vries, 1986).
Fundamento: los iones sulfitos obtenidos a partir del metabisulfito sometido a un medio
ácido son destilados posteriormente con una disolución de yodo (0,05 N) en
presencia de almidón como indicador (De Vries y col, 1986).
Reactivos químicos:
• Disolución de yodo 0,05 N
• HCL concentrado
• Disolución de almidón al 1%
Aparatos, utensilios y medios de medición:

• Matraz de 1000 ml
• Tubo Y
• Embudo de decantación
• Trampa de vapor
• Codo
• Mangueras de caucho
• Vaso de precipitado
• Bureta
• Mechero
• Tanque de gas
• Perlas de vidrio
Procedimiento:
Se pesan 50 g de muestra, se trocean y se añaden en el balón de destilación. Añadir 200 mL

de agua destilada y tres perlas de vidrio, conectar el balón al tubo Y y este al recto del equipo
de destilación. Colocar el embudo de decantación en el ramal recto del tubo Y, al extremo
inferior del refrigerante se adapta una manguera para que los gases burbujeen en 45 mL de
agua destilada con 5 mL de almidón al 1 % que se encuentran en un vaso de precipitados. En
una bureta se añade la disolución de yodo 0,05 N. Una vez conectado el sistema, vaciar 20
mL de ácido clorhídrico concentrado, cerrar la llave del embudo y encender el mechero para
provocar una ebullición rápida. Dejar caer dos gotas de disolución de yodo en el vaso de
precipitados para que la solución tome color azul.
Una vez iniciada la ebullición comenzar a agitar y a medida que el color desaparezca adicionar
gota a gota la disolución de I2 0,05 N. Se considera terminada la valoración cuando el color
azul en la disolución de almidón permanece por 1 minuto. Cálculos:
ANEXOS
ppm de metabisulfito= 1600 x consumo de disolución de I2 0,05 N

peso de la muestra
II. Procedimiento para determinación del dióxido de azufre según el método

Yodométrico por Destilación rápida (IT-ANT-10. 1/3, 2004).
Fundamento:
Determinar el dióxido de azufre mediante un proceso de digestión ácida de la muestra y

destilación del sulfito, el cual es recogido sobre una solución recibidora de hidróxido de
sodio; determinándose la concentración del analito mediante una valoración con solución
de yodo.
Equipamiento:
Máquina de moler (IT/LQ/EQ-)

Balanza técnica con precisión de 0,01g (IT/LQ/EQ-)
Equipo de destilación Vapodest 30 (IT/LQ/EQ-)
Campana de extracción de gases (IT/LQ/EQ-)
Destilador Vapodest 30
Materiales y reactivos:
Ácido clorhídrico
Hidróxido de sodio
Almidón
Yodo metálico o fixanal de yodo 0.05N
Pipetas graduadas de 2, 10 y 20 mL
Bureta ámbar graduada de 25 mL
Erlenmeyer de 250 mL
Preparación de soluciones:
Solución de ácido clorhídrico (35%) (POT/LQ/SOL-)

Solución de hidróxido de sodio (1N) (POT/LQ/SOL-)
Solución de yodo (0,05N) (POT/LQ/SOL-)
Solución de almidón (1%) (POT/LQ/SOL- )
ANEXOS
Procedimiento:
Preparación de la porción de ensayo: Pelar la muestra, quitando la cabeza y el caparazón

y moler la masa hasta conformar una porción de aproximadamente 100g.
• Pesar 20g ± 0,01 de la muestra en un vaso de precipitado y llevarlo al tubo de digestión

del equipo Vapodest.
• Adicionar 20 mL de solución de hidróxido de sodio (1N) en un erlenmeyer de 250 mL
donde se recogerá el destilado y colocarlo en el equipo.
• Programar el equipo con los parámetros de operación que se indican en el Anexo 1 e
iniciar el proceso presionando la tecla “RUN”.
• Al finalizar la destilación, adicionar 8 mL de HCl (35%) al destilado recogido.
• Adicionar 2 mL de solución de almidón (1%) al destilado.
• Valorar con solución de yodo (0,05N) hasta color azul persistente por 30 s.
Presentación de los resultados:
La cantidad de sulfito en la muestra se calcula por la siguiente fórmula.
SO2 = V x N x 32 x 1000
P
Donde:
V: Volumen de la solución de yodo consumida en la valoración (mL)
N: Normalidad de la solución de yodo (0.05N)
32: Peso del equivalente de dióxido de azufre (g)
1000: Factor para expresar la concentración en mg/kg (ppm)
P: Peso de la muestra en g (20)
SO2: Concentración de SO2 en mg/kg (ppm)
La fórmula simplificada siempre que la normalidad de la solución de yodo utilizada sea

0,05 será la siguiente:
m SO2 = V x 1600
P
ANEXOS
III. Determinación de residual de metabisulfito de sodio por microdifusión

(Tsukuda, 1975).
Fundamento:
El residuo de sulfito se determina a través de la doble descomposición del complejo
de sal sódica de cloro y mercurio por el método de micro difusión de Tsukuda.
Posteriormente se mide el desarrollo de color de la muestra con para-rosanilina.
Equipamiento:
- Balanza analítica (IT/LQ/EQ-01).
- Homogenizador (IT/LQ/EQ-18)
- Espectrofotómetro visible (IT/LQ/EQ-20)
- Centrífuga (IT/LQ/EQ-22 ó IT/LQ/EQ-13)
- Máquina moledora (IT/LQ/EQP-21)
- Estufa (IT/LQ/EQP-17)
- Campana de extracción de gases (IT/LQ/EQ-12)
Materiales, reactivos y soluciones:

Materiales
- Pipetas graduadas de 1, 2, 10 y 20 mL
- Bureta ámbar de 25 mL
- Tubos graduados de 5 mL con tapa
- Frasco cónico de 250mL con tapa
- Embudos medianos
- Celdas Conway para micro difusión
- Gradilla
- Vaso precipitado de 50 mL, 250 mL
- Pera de seguridad
- Matraz aforado de 50, 100 y 1000 mL
- Espátula
- Algodón
- Papel de filtración rápido
- Probeta de 50 y 100 mL
- Bandeja
Reactivos
- Cloruro de sodio p.a
- Bicloruro de mercurio
- Glicerol (98%)
- Clorhidrato de para-rosanilina (básica)
- Yoduro de potasio
- Yodo metálico
- Dicromato de potasio
ANEXOS
- Ácido clorhídrico concentrado

- Ácido fosfórico (85%)
Soluciones
- Solución absorbente concentrada y diluida (POT/LQ/SOL-10)
- Solución patrón de dióxido de azufre (POT/LQ/SOL- 13)
- Solución de yodo (0,1N) (POT/LQ/SOL- 06)
- Solución de almidón (1%) (POT/LQ/SOL- 07)
- Solución de formaldehído (0,2%) (POT/LQ/SOL-08)
- Solución de ácido fosfórico (25%) (POT/LQ/SOL-09)
- Solución de tiosulfato de sodio (0,1N) (POT/LQ/SOL- 12)
- Solución de patrón y de trabajo de para-rosanilina (POT/LQ/SOL- 11)
- Reactivo de hermeticidad (ácido fosfórico al 85%)
Procedimiento:
Preparación de la muestra de ensayo.

Se toma una cantidad representativa de la muestra semicongelada de masa del
producto a analizar, se muele y homogeniza bien, formándose una torta que se divide
en 4 partes iguales, tomándose los 2 cuartos opuestos. Esto se repite hasta que
queden aproximadamente de 60 a 80g.
Preparación de la porción de ensayo.

Se pesan 10g ± 0.1 mg de la muestra de ensayo y se le añaden 90mL de solución
absorbente diluida, se coloca en un homogenizador o batidora durante 90 segundos o
en zaranda durante 30 minutos. Se deja reposar en frasco cónico tapado por una hora
agitando cada cierto tiempo.
Se centrifuga a 5000 rpm durante 15 minutos y se filtra a través de un algodón,

conservando el sobrenadante para la determinación. Esta solución se puede
almacenar por 24 horas en refrigeración.
Proceso de micro difusión.

- La celda estará limpia y seca como se establece en el POT/LQ/LIM-02.
- Se cubre la zona esmerilada de la tapa y el fondo de la placa de micro difusión con
reactivo de hermeticidad, para lo cual se emplea una varilla de vidrio envuelta con
algodón.
- Se transfiere 1mL de solución absorbente concentrada en la cámara interna de la
placa, extendiéndola cuidadosamente por toda la superficie con ayuda de la pipeta.
- Se coloca la tapa sobre la placa dejando una pequeña abertura que permita adicionar
las otras soluciones.
- Se transfiere 1 mL de solución de ensayo a la cámara externa y 1,5 mL de solución
absorbente diluida.
ANEXOS
- Se añaden 0,4mL de ácido fosfórico al 25% en la cámara externa, pero del lado
opuesto a donde se adicionó la muestra, cuidando de que no reaccione con ésta.
- Se tapa rápidamente la placa y se agita suavemente para que se mezclen bien las
soluciones de la cámara externa.
- Se deja reposar durante 60 minutos a 37°C o durante 90 minutos a temperatura
ambiente.
Desarrollo de color.
Una vez terminada la difusión se procede a extraer la solución de la cámara interna
con una pipeta o gotero y se transfiere a un tubo de ensayo graduado con tapa.
Se realiza el lavado cuantitativo de la cámara interna repetidas veces con solución
absorbente diluida hasta completar un volumen de 5mL.
Se añade 1mL de formaldehído (0,2%) y 1mL de solución de trabajo de para-
rosanilina, se tapa el tubo y se agitan las soluciones, dejando reposar en la oscuridad
durante 30 minutos.
Medición fotométrica.
Se realiza la lectura en espectrofotómetro visible a una longitud de onda de 560nm
empleando cubetas de 1cm de paso de luz, contra un blanco de reactivos.
Ensayo en blanco.
Se procede igual que en el apartado Proceso de Microdifusión, excepto en la adición
de la muestra.
Preparación de la curva de calibración.

A partir de la solución patrón de dióxido de azufre (POT/LQ/SOL-13) se prepara una
solución de comparación de trabajo, la que debe tener una concentración de
0,006mg/mL, para lo cual se realizará el siguiente ajuste:
• Se prepara una primera dilución que contenga 0.3 mg/mL de dióxido de azufre,
para lo cual se realizará el siguiente cálculo.
0,3 mg/mL ------------- X1

X mg/mL ------------- 100 mL
donde:
X mg/mL concentración de la solución de comparación calculada
X1 alícuota de la solución de comparación a tomar para preparar la primera
dilución.
• Se mide con una pipeta graduada los X1 mL obtenidos en el cálculo anterior y

se diluye en 100 mL de disolución absorbente diluida. De esta dilución se toma
1 mL y se llevan a 50 mL con solución absorbente diluida, obteniendo una
solución de trabajo con una concentración de 0,006 mg/mL de SO2
ANEXOS
• Obtenida la disolución de comparación de trabajo se toman las siguientes

cantidades para confeccionar la curva de calibración:
Volumen Concentración
Volumen de
de la de SO2 de la
disolución de Masa de SO2
solución disolución de
concentración correspondiente
absorbente comparación
0,006 mg/mL ( µg)
diluída para fotometría
SO2 (mL)
(mL) (µg/mL)
0,5 3,0 2.0 0,6
1,0 6,0 1.5 1,2
1,5 9,0 1.0 1,8
2,0 12,0 0.5 2,4
2,5 15,0 - 3,0
Proceso de microdifusión. Se transfiere 1 mL de disolución absorbente concentrada

a la cámara interna de cada una de las celdas de microdifusión y en la cámara externa
las alícuotas de la disolución de trabajo correspondientes, completando hasta 2.5 mL
con disolución absorbente diluida. A continuación se procede igual que en el apartado
7.3
Desarrollo del color. Se procede igual que en el apartado 7.4.
Medición fotométrica. Se procede igual que en el apartado 7.5. Con los datos
obtenidos se construye el gráfico de calibración que corresponderá con una curva
prácticamente lineal; asimismo se calcula la cotangente correspondiente que será
igual a:
Cot = ∑X
∑Y
Donde:
∑ X= µg de SO2
∑Y = d.o. obtenida para cada concentración
ANEXOS
Cálculos e interpretación de los resultados.
La concentración de dióxido de azufre se calcula mediante la siguiente fórmula:

V
Contenido de SO 2 (µg / g) = Cot ⋅ d.o. ⋅ 3 ⋅ M
V4
Donde:
d.o. Densidad óptica obtenida de las muestras.
V3 Volumen total de la muestra (100 mL).
V4 Alícuota de la muestra tomada para la microdifusión ( 1 mL).
M Masa de la muestra (10 g)
Los resultados se expresan en mg/kg y se aproximarán hasta las centésimas.

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UNIVERSIDAD DE LA HABANA

INSTITUTO DE FARMACIA Y ALIMENTOS

Autora: Lic. Aymeé Luis Collantes

Tutores: Dr. C. Manuel Alvarez Gil

El esfuerzo realizado para la culminación de este estudio compromete a muchos

A mis padres por su ayuda, un agradecimiento profundo de mi parte; en especial a

A todos mis compañeros de trabajo en PRODAL, principalmente los técnicos de

A todos los técnicos del Laboratorio de Química del Centro de Investigaciones

A la encomiable labor de Carmen Wong, la china, trabajadora incansable; mujer a

A Lourdes Nodarse, amiga intachable, maestra y guía de muchos jóvenes

Y finalmente dedico este trabajo a la memoria de mi abuelo Antonio Polo Flores,

La afectación de la calidad de los crustáceos debida al ennegrecimiento de su masa corporal

Los objetivos planteados estuvieron dirigidos a evaluar el cumplimiento de los criterios de

1.4.3.1.1 Repetibilidad __________________________________ 20

Capitulo 2 Materiales y Métodos_________________ _________26

2.4.4 Límite de cuantificación________________________________ _33

Capitulo 3 Resultados y Discusión______________________________ 41

3.5.2 Método 3 Destilación Rápida ___________________________ 62

En Cuba, la obtención de los recursos pesqueros de su plataforma submarina y aguas oceánicas

La problemática del ennegrecimiento de los crustáceos causado por el proceso de melanosis,

El llamado pardeamiento enzimático o la formación de melanina, se produce como

Dada la importancia que han alcanzado las producciones de mariscos y su exportación en

Como objetivo general:

9 Evaluar el cumplimiento de los principales criterios de validación de tres métodos analíticos

Como objetivos específicos:

9 Determinar los límites de cuantificación y la veracidad como criterios de la calidad analítica

9 Analizar la especificidad, sensibilidad y robustez en los métodos que satisfagan los

9 Determinar la incertidumbre de cada método de ensayo para las diferentes matrices

Capítulo 1 Revisión Bibliográfica

1.1 La pesca y su industrialización

1.1.1 Principales rubros exportables

1.2 Crustáceos. Generalidades

1.2.1.1 Caracterización física

De forma general la estructura física de la langosta se compone de la siguiente forma:

1.2.1.2 Caracterización nutricional

La langosta Panulirus argus, considerada como alimento, constituye el primer renglón de

En el Anexo 1, igualmente se indican resultados de la composición química de la langosta

1.2.2.1 Caracterización física

El camarón tiene como características comunes a los crustáceos la presencia de un esqueleto

1.2.2.2 Caracterización nutricional

En su composición elemental media el camarón se aproxima a cualquier pescado blanco, dado

1.2.3 Especificaciones de calidad de los crustáceos

Las especificaciones de calidad correspondientes a los productos crustáceos elaborados en la

La evaluación de estas características se realizará de acuerdo a lo establecido en los

En la calidad de estos productos influyen fundamentalmente los aspectos microbiológicos y los

1.3 Aditivos alimentarios. Sulfitos

La seguridad química de los alimentos incluye, además de contaminantes y nutrientes, la

1.3.2 Sulfitos como aditivos alimentarios

1.3.3 Sulfitos para la conservación de crustáceos

También Weingantner y col. (1977) recomienda la mezcla de bisulfito e hipoclorito en

En la Industria Pesquera cubana el aditivo mayormente utilizado para retrasar o inhibir el

La melanosis es una coloración desagradable o mancha negra que se inicia en los

La melanosis es ocasionada por la formación de melanina, debido a reacciones enzimáticas

1.3.4 Toxicidad de los sulfitos

En la actualidad se permite la utilización de sulfito sódico, sulfito ácido de sodio, metabisulfito

1.3.5 Métodos para determinación de sulfitos en alimentos

En la literatura se registran diversos métodos para la determinación de sulfitos; y

Método AOAC. Determinación de Sulfitos en alimentos (Monier-Willians): método

Método Tsukuda. Determinación de SO2 por microdifusión: El método se basa en la

A este método se le realizó un estudio de correlación con el método Tsukuda, en el

Método de destilación rápida: Se determina el dióxido de azufre mediante un proceso de

Diferentes laboratorios han desarrollado variantes del método publicado en la AOAC,

1.4 Acreditación del Sistema de Gestión de la Calidad

Capitulo 2 Materiales y Métodos_________ _26