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Desarrollo de un ensayo de bioluminiscencia fácil y de alto rendimiento con

Vibrio fischeri para determinar la toxicidad crónica de las muestras


contaminadas

Abstract.
Las pruebas de toxicidad crónica con la bacteria luminiscente, Vibrio fischeri, han
demostrado recientemente ser un bioensayo adecuado para el monitoreo de la
calidad del agua. La evaluación de la toxicidad generalmente se basa en la
determinación de la EC50 en momentos específicos, lo que puede llevar a pasar
por alto la naturaleza dinámica de la respuesta de luminiscencia y limitar la
información con respecto a los posibles mecanismos de acción de los compuestos
objetivo. Este estudio investigó varios enfoques (estándar, integral y la inhibición de
la tasa de luminiscencia) para evaluar la toxicidad crónica de tres compuestos
objetivo (atrazina, trimetoprima y acetamiprid) utilizando un método basado en placa
de 96 pocillos. El ensayo de toxicidad crónica y los métodos utilizados para el
cálculo de EC50 proporcionados en este trabajo dieron como resultado un método
de alto rendimiento de pruebas de toxicidad crónica e indicaron EC50 más bajos
que los valores proporcionados por los métodos estándar de corto plazo, lo que
indica una mayor toxicidad. Este estudio enfatiza la necesidad de pruebas de
toxicidad crónica adicionales para evaluar aún más la toxicidad de compuestos o
muestras desconocidas.
Palabras clave
Toxicidad crónica · Contaminantes de preocupación emergente · Ensayo de alto
rendimiento · Vibrio fischeri
Introducción
El riesgo asociado con contaminantes de preocupación emergente (CEC) como
pesticidas, biocidas, productos farmacéuticos y productos de cuidado personal en
el medio ambiente es un problema creciente de preocupación mundial ya que estas
sustancias se han detectado a concentraciones de μg / L en el medio ambiente
acuático (Halling-Sørensen et al. 1998). Estos compuestos generalmente no se
eliminan de manera eficiente durante el tratamiento convencional de aguas
residuales y finalmente se descargan en las aguas receptoras (Kümmerer 2003).
Para facilitar el desarrollo y la operación de tecnologías de tratamiento de aguas
residuales que minimizan el riesgo ambiental asociado con la descarga de aguas
residuales tratadas, se requieren métodos de prueba rápidos, simples y confiables.
La bacteria luminiscente marina Vibrio fischeri ya se ha utilizado comúnmente en
varios protocolos de pruebas biológicas para la investigación de respuestas tóxicas
agudas. La prueba de bacterias bioluminiscentes según EN ISO 11348 se ha
comercializado como Microtox® por Modern Water y se aplicó para determinar la
toxicidad aguda de numerosos contaminantes (de García et al. 2016). Otros
ensayos comercializados basados en este microorganismo son LUMIStox,
ToxScreen y Tox Alert. Las pruebas de inhibición de la bioluminiscencia a corto
plazo son herramientas útiles para evaluar el impacto ecotoxicológico de los tóxicos
de acción inespecífica, pero su baja sensibilidad se debe al corto tiempo de
exposición (5 a 30 minutos) y al enfoque de prueba actual
El uso de cubetas para luminómetros estándar limita su uso.
El protocolo estándar de Microtox es simple y relativamente rápido, pero tiene una
cantidad limitada de procesamiento de muestras y requiere suministros
relativamente caros (es decir, cultivos y diluyentes liofilizados), por lo que
permanece como un sistema de rendimiento medio bajo. Existen numerosos
informes sobre la toxicidad aguda de los CEC con V. fischeri, pero solo un puñado
de informes investigaron los efectos crónicos con este organismo de prueba
(Backhaus et al. 1997; Froehner et al. 2000, 2002; Gmurek et al. 2015; Majewsky et
al . 2014; Menz et al. 2013).
La aplicabilidad de una prueba de toxicidad crónica utilizando V. fischeri en una
manera de alto rendimiento ya se ha demostrado (Froehner et al. 2002; Gmurek et
al). pero la mayoría de los estudios solo han analizado puntos finales específicos
(es decir, inhibición de la luminiscencia después de una cantidad específica de
tiempo de incubación), que ignora la naturaleza dinámica de la respuesta durante el
período de exposición (generalmente 24 h). Las respuestas de toxicidad
dependientes del tiempo pueden proporcionar información adicional sobre los
posibles mecanismos de acción de las sustancias e ideas sobre la posible toxicidad
retardada de las sustancias. En el presente trabajo, revisamos el uso de V. fischeri
para investigar la toxicidad crónica y consideramos varios métodos para calcular la
concentración efectiva a la mitad de la respuesta máxima (EC50) a partir de los
datos recopilados durante 20 h (período durante el cual se puede mantener un
cultivo saludable) , para reemplazar el enfoque de punto de tiempo actualmente
utilizado. El análisis dependiente del tiempo de la inhibición de la luminiscencia
también se usó para discutir los mecanismos potenciales de acción de los
compuestos objetivo. Por lo que sabemos, los efectos crónicos de trimetoprima
(TMP), atrazina (ATZ) y acetamiprid (ACD) en V. fischeri presentados no se han
informado en ningún otro lugar. El procedimiento de análisis bacteriano sensible, de
bajo costo y alto rendimiento y los métodos de cálculo de EC50 propuestos descritos
en este trabajo proporcionan una herramienta de detección ecotoxicológica sólida
para monitorear la eficiencia de las tecnologías de tratamiento, la detección
temprana de la formación de productos de transformación potencialmente tóxicos,
así como El cribado preliminar de nuevos productos químicos.
Materiales y métodos
Productos químicos: la atrazina (ATZ, 99.1%) y la trimetoprima (TMP,> 98%) se
compraron a Sigma-Aldrich. Se adquirió acetamiprid (ACD,> 98%) de Santa-Cruz
Biotechnology. Los productos químicos utilizados en el medio de cultivo se
adquirieron de Fisher Scientific: cloruro de sodio, tripton, extracto de levadura;
Sigma-Aldrich: cloruro de potasio y cloruro de magnesio; y EMD Chemicals: glicerol.
Los disolventes portadores utilizados para preparar las soluciones madre de CEC
fueron metanol de grado LC-MS (MeOH) y dimetilsulfóxido (DMSO) adquiridos de
Fisher Scientific y Sigma-Aldrich, respectivamente. Se prepararon soluciones madre
de ACD (1000 mg / L) y TMP (1000 mg / L) en MeOH y se preparó ATZ (5000 mg /
L) en DMSO al 10% en MeOH (v / v). Todas las existencias se almacenaron a -20 °
C hasta el momento de la experimentación.
Cultivo y conservación a largo plazo del organismo de prueba: para cultivar los
organismos de prueba que se usarán para la prueba de toxicidad, las bacterias
luminiscentes liofilizadas (V. fischeri, NRRL-B11177, ATCC 49387) se rehidrataron
primero en 1 ml de agua de mar completa (SWCM). SWCM consistió en 20,0 g / L
NaCl, 2,0 g / L MgCl · 6H2O. y 0,3 g / L KCl. Las bacterias rehidratadas (0,5 ml) se
transfirieron luego a 100 ml de medio de agua de mar suplementado con nutrientes
(NSSWM) y se incubaron a 22 ° C y 150 rpm durante aproximadamente 24 h (o
hasta que se alcanzó la fase de crecimiento exponencial según lo determinado por
la densidad óptica a 600 nm) . NSSWM consistió en SWCM complementado con
5.0 g / L de triptono, 5.0 g / L de extracto de levadura y 3.0 g / L de glicerol. Las
muestras (10 ml) de este caldo líquido incubado que contenía V. fischeri crecido se
transfirieron luego a tubos de centrífuga de poliuretano de 15 ml y se centrifugaron
a 5000 rpm durante 5 minutos. Luego se decantó el sobrenadante y los sedimentos
de bacterias restantes se resuspendieron con 1 ml de glicerol al 30% / NSSWM (v /
v) y se colocaron en 1,5 ml de cyrovials para ser congelados en nitrógeno líquido y
se almacenaron a -80 ° C hasta el momento de experimentación. Preparación del
organismo de prueba para pruebas de toxicidad crónica: para realizar ensayos de
toxicidad crónica, un cyrovial que contiene los cultivos conservados de V. fischeri
se descongelaron en agua con hielo y se transfirió un volumen de 250 µL de este
cultivo a 50 ml de medio de crecimiento (NSSWM) y se incubó a 22 ° C y 150 rpm
durante aproximadamente 10–12 h (o hasta y densidad óptica (OD) de 1–1.5). Para
mantener un cultivo saludable que muestre una respuesta de luminiscencia estable,
se realizó una dilución cada 12 h usando la siguiente fórmula:
Volumen (ml) de cultivo bacteriano que se agregará a 50 ml de NSSWM = 0.1
OD600 nm
Este enfoque se utilizó para obtener una densidad celular inicial estandarizada en
los medios de crecimiento. Cada 12 h de incubación, además de las mediciones de
OD, también se realizaron mediciones de luminiscencia al transferir 200 µL de
muestras a placas de micropocillos Costar 96 opacas negras de poliestireno y se
midieron mediante un detector Multimodo Beckman-Coulter DTX 800 para asegurar
que las bacterias estén en su Fase exponencial tardia (LEPC).
Preparación de las placas de dilución y ensayo: antes de exponer las bacterias
a los contaminantes objetivo para las pruebas de toxicidad, se preparó una placa de
dilución (Fig. 1). La muestra (200 µL) o la solución madre de compuestos se colocó
en el pozo A1 en la placa de dilución. El pocillo A2 contenía 140 µL y los pocillos A3
– A12 contenían 180 µL del disolvente portador respectivo (MeOH o 10% DMSO /
MeOH). Se transfirieron un volumen de 60 µL de A1 a A2 y un volumen de 20 µL de
A1 a A3. A partir de A2, los pocillos de número par se diluyeron en serie por un
factor de 10 y, de manera similar, los pocillos de números impares se diluyeron en
serie por un factor de 10 a partir de A3.
Después de la dilución en serie, todos los pozos en la fila A contenían un volumen
final de 180 µL excepto A1 (120 µL). Finalmente, se transfirieron 10 µL de cada
pocillo en la placa de dilución (para ATZ) y 25 µL (para ACD y TMP) al pocillo
correspondiente en la placa de ensayo opaca negra (filas B, C y D). También se
transfirieron 10 o 25 µl del respectivo portador disolvente a todos los pocillos de la
fila F en la placa de ensayo como control de disolvente (C1 en la Fig. 1). Los
disolventes se dejaron evaporar antes de la adición del cultivo de V. fischeri. Para
estandarizar la densidad celular inicial en cada pocillo, se midió la densidad óptica
de LEPC y se usó la siguiente fórmula para producir el cultivo de placa preparada
(PRC).
Volumen (mL) de LEPC que se agregará a 50 mL de NSSWM = 0.4 / OD600 nm

Fig. 1 Dilución y preparación de la placa de ensayo para la experimentación de


toxicidad crónica.
Este enfoque propuesto proporciona una densidad celular inicial estandarizada y
una respuesta de luminiscencia inicial consistente de alrededor de 1000 unidades
de luz relativa (RLU). Después de la evaporación de los solventes portadores, se
agregaron 200 µL de PRC a los pocillos en la placa de ensayo opaca negra, la placa
se cubrió con una película permeable (membrana de sellado Breathe-Easy) para
permitir la difusión de oxígeno y facilitar la respiración aeróbica de las bacterias. La
luminiscencia en cada pocillo se registró durante 20 h cada 15 min (agitación
durante 15 s antes de cada medición para evitar la sedimentación de las bacterias
y para homogeneizar la mezcla en cada pocillo). Los pocillos en las filas B, C, D de
la placa de ensayo contenían muestras de dilución en serie de 12 puntos de
contaminantes objetivo (S) en PRC; mientras que la fila F se reservó para el control
del solvente evaporado en PRC (C1) y la fila G contenía solo el PRC (C2). Por lo
tanto, cada placa de ensayo contenía tres réplicas de muestra y dos controles
negativos con 12 réplicas. En el caso de ATZ, la placa de ensayo contenía un 0,5%
(v / v) de DMSO en todos los pocillos de control de muestra y disolvente, para los
compuestos restantes no quedaba disolvente portador residual en la placa de
ensayo. Para TMP y ACD, C1 y C2 no mostraron una diferencia considerable en la
luminiscencia; sin embargo, para ATZ, la presencia de DMSO dio lugar a una mayor
luminiscencia que la de C2. Por estas razones, se comparó la luminiscencia de
todas las muestras con la del control de solvente (C1). Los efectos crónicos del
DMSO en concentraciones variables sobre la bioluminiscencia de V. fischeri se
discuten más adelante.
Análisis de datos: la evolución de la luminiscencia en función del tiempo para el
control del solvente (es decir, el control negativo) y para una muestra representativa
(por ejemplo, 25 mg / L de ATZ) se representa en la Fig. 2a. La Figura 2b-d muestra
el porcentaje de inhibición de la luminiscencia (I) calculada utilizando tres
estrategias diferentes. En todos los casos, la luminiscencia disminuye rápidamente
durante las 5 h iniciales, ya que las bacterias necesitan alcanzar una densidad
celular crítica antes de exhibir luminiscencia (es decir, detección de quórum).
Fig. 2 a Datos sin procesar que muestran cómo la luminiscencia varía con el tiempo
durante la prueba de toxicidad crónica de ATZ (el recuadro muestra la evolución de
la luminiscencia dentro de las primeras 5 h de la prueba). Cálculo del porcentaje de
inhibición utilizando el método estándar b, el método integral c y la velocidad inicial
de inhibición de la luminiscencia.
Por lo tanto, los valores de luminiscencia registrados durante esta ventana de
tiempo no se tuvieron en cuenta al calcular el porcentaje de inhibición. La Figura 2b
muestra cómo se determinó el porcentaje de inhibición para cada punto de tiempo
independientemente, definido como cálculo de inhibición estándar, y se calculó
usando (Ec. 3):

(3)
donde t es el tiempo de medición, Lc, t es la media de los valores de luminiscencia
de los controles de solvente después de t horas, Ls, t es la luminiscencia observada
de una muestra particular después de t horas e Istd, t es el porcentaje de inhibición
estándar a Tiempo dado para una muestra particular. La Figura 2c ilustra cómo se
determinó el porcentaje de inhibición para cada punto de tiempo usando el área
debajo de las curvas, denominado cálculo de inhibición integral, y se calculó usando
(Ec. 4):

(4)
donde de manera similar a (Eq. 3) t es el tiempo de medición, Ac, t es el área bajo
la curva de la media de los valores de luminiscencia del solvente que controla hasta
t horas, As, t es el área bajo la curva de la Luminiscencia observada de una muestra
en particular hasta t horas e Iintegral, t es el porcentaje de inhibición integral hasta
un tiempo específico para una muestra en particular. Ac, t y As, t se calcularon
utilizando la regla trapezoidal. Finalmente, la Fig. 2d muestra cómo la velocidad
inicial de luminiscencia de una muestra que contiene un tóxico difiere de la del
control de solvente. El porcentaje de inhibición que utiliza estas tasas iniciales se
menciona aquí como cálculo de inhibición de tasa y se calculó utilizando (Ec. 5):

/(5)

donde mc es la velocidad inicial de luminiscencia calculada a partir de la pendiente


de la media de los valores de luminiscencia de los controles con solvente, ms es la
velocidad inicial de luminiscencia calculada a partir de la pendiente de la
luminiscencia observada de una muestra particular e Irate es la inhibición de la
velocidad inicial de luminiscencia. La estimación de las pendientes para cualquier
curva en particular se determinó utilizando un código de Matlab que realiza el
siguiente análisis.
Para cada dos puntos de datos en la curva Fig. 2c, se calcula el valor de una
pendiente. Una vez que se logran diez pendientes positivas consecutivas, el valor
final de este rango se toma como la estimación inicial del valor de la pendiente. Esta
estimación se compara con todas las demás pendientes calculadas previamente y
el límite inferior se determinó una vez que se detectó una disminución del 50% en
la pendiente y, de manera similar, el límite superior se determinó una vez que la
pendiente aumentó en un 50%. Utilizando este rango final de puntos de datos, se
realizó un análisis de regresión de línea para finalizar la estimación de la pendiente
(es decir, la tasa inicial de luminiscencia). La concentración efectiva que muestra
una inhibición del 50% (EC50) para los tres métodos propuestos anteriormente se
calculó a partir del ajuste logístico logístico de la curva de concentración-efecto
(ecuación 6) de la inhibición representada en función de la concentración logarítmica
(mg / L) utilizando Prisma ( Software GraphPad):

donde I es el porcentaje de inhibición, Inferior es la inhibición mínima (establecida


en 0%) La máxima es la inhibición (establecida en 100%) C es la concentración de
tóxico (mg / L) y EC50 es la concentración efectiva (mg / L) a I = 50%. Usando los
métodos de cálculo estándar (Eq. 3) e inhibición integral (Eq. 4), se puede calcular
una EC50 en diferentes puntos de crecimiento de tiempo, mientras que el valor de
EC50 calculado usando los valores obtenidos del cálculo de inhibición de tasa arroja
una estimación global del EC50. Para evaluar si los valores logEC50 de mejor ajuste
diferían entre los conjuntos de datos, se utilizó la función incorporada de la prueba
F de Sumas de cuadrados adicionales en el software GraphPad. La hipótesis nula
se estableció en "LogEC50 igual para todos los conjuntos de datos" y la hipótesis
alternativa se estableció en "LogEC50 diferente para cada conjunto de datos". La
hipótesis nula se rechazó si el valor de p era inferior a 0,05.

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