Terapia génica

Dra. Minerva Aurora Hernández

Gallegos
 Definición
• . La terapia génica se puede definir como
el conjunto de técnicas que permiten
vehiculizar secuencias de ADN o de ARN
al interior de células diana.
 Objetivo
Modular la expresión de determinadas
proteínas que se encuentran alteradas,
revirtiendo así el trastorno biológico que ello
produce
En función del tipo celular diana, existen dos
modalidades de terapia génica:
• 1) Terapia génica de células germinales
• 2) Terapia génica somática:
 Terapia génica de células
germinales
Aquella dirigida a modificar la dotación
genética de las células implicadas en la
formación de óvulos y espermatozoides y,
por tanto, transmisible a la descendencia.
Este tipo de terapia génica no ha sido
aplicada en seres humanos por cuestiones
éticas.
 Terapia génica de células
germinales
• La terapia génica de la línea germinal humana no ha sido
practicada debido a las limitaciones de la tecnología de
manipulación de las células germinales y a considerandos éticos,
en especial el peligro de la modificación del acervo genético de la
especie humana, y el riesgo de potenciación genética, que derivaría
en prácticas de eugenesia por selección artificial de genes que
confiriesen caracteres ventajosos para el individuo.
 Terapia génica somática
• Por consenso general entre los
investigadores y con la legislación actual,
basada en motivos éticos y de seguridad,
solamente se llevan a cabo protocolos
clínicos en este tipo de terapia génica.
 Terapia génica somática
Aquella dirigida a modificar la dotación
genética de células no germinales, es decir,
de las células somáticas o constituyentes
del organismo.
La modificación genética no puede
transmitirse a la descendencia.
 Por otra parte, y en función de la estrategia
aplicada, la terapia génica también puede
clasificarse en:
• 1) Terapia génica in vivo
• 2) Terapia génica ex vivo
 Terapia génica in vivo

• Agrupa la técnicas en las que el material

genético se introduce directamente en las
células del organismo, sin que se
produzca su extracción ni manipulación in
vitro.

Modelo de transferencia génica in vivo mediado por

liposomas catiónicos: introducción del gen que
codifica el regulador transmembrana de la fibrosis
quística (CFTR).
Modelo de transferencia génica in vivo mediado por
liposomas catiónicos: introducción del gen que
codifica el regulador transmembrana de la fibrosis
quística (CFTR).
 Terapia génica in vivo
• Ventaja de las técnicas in vivo sobre la terapia génica in
vitro es su mayor sencillez.
• Desventajas: tienen el inconveniente de que el grado de
control sobre todo el proceso de transferencia es menor,
la eficiencia globales también menor (dado que no
pueden amplificarse las células transducidas) y,
finalmente, es difícil conseguir un alto grado de
especificidad tisular
 Terapia génica ex vivo
Comprende todos aquellos protocolos en los
que las células a tratar son extraídas del
paciente, aisladas, crecidas en cultivo y
sometidas al proceso de transferencia in
vitro.

Modelo de transferencia génica ex vivo:

introducción del gen que codifica el receptor
de LDL en el tratamiento de la
hipercolesterolemia familiar monogénica.
Modelo de transferencia génica ex vivo:
introducción del gen que codifica el receptor
de LDL en el tratamiento de la
hipercolesterolemia familiar monogénica.
 Terapia génica ex vivo
Una vez que se han seleccionado las
células que han sido efectivamente
transducidas, se expanden en cultivo y se
introducen de nuevo en el paciente.
 Ventajas y desventajas
• Ventajas: son el permitir la elección del tipo de célula a
tratar, mantener un estrecho control sobre todo el
proceso, y la mayor eficacia de la transducción genética.
• Desventajas: tienen mayor complejidad y altos costes de
los protocolos, así como la imposibilidad de transducir
aquellos tejidos que no son susceptibles de crecer en
cultivo; además, existe siempre el riesgo inherente a la
manipulación de las células en cuanto a problemas de
contaminación
 Terapia génica
• La terapia génica es la corrección de un
defecto genético causante de enfermedad

• Procesos genéticos y bioquímicos básicos de

la célula
• Replicación del DNA
Bases genéticas • Activación de un gen
• Transcripción y procesamiento del mRNA
• Traducción del mRNA en Proteína
• Degradación del RNA
• Tráfico intracelular de proteínas programación
de la división y muerte de una célula
 Los genes Conjunto genoma
fabricación de proteínas específicas
por una célula

“genética”
“zonas” delimitadas de los
cromosomas, hechos de DNA y La producción de proteínas
residen en el núcleo de todas como a cuestiones de
las células de un organismo. herencia.

La función
1) expresar o “fabricar” la proteína
parala cual encierran información y Definen un tipo celular
2) perpetuar esa información concreto con una estructura y
durante la división celular. función propias.
 Enfoques de la terapia génica
tienen como objetivo la corrección de un defecto genético en
células somáticas, es decir, en las células que no son ni
espermatozoides ni óvulos.

la corrección del defecto genético no se transmite a los

descendientes
Se aplica sobre enfermedades hereditarias bien definidas
cuyo defecto genético reside en un único gen, las llamadas
Somática
enfermedades monogénicas.
hemofilias, fenilcetonuria, deficiencia de ADA (adenosina
desaminasa), fibrosis quística, distrofia muscular,
hipercolesterolemia familiar, etc.

Enfermedades hereditarias cuyo defecto genético es fácilmente

confirmable en los portadores, y altera el funcionamiento de un
tipo celular concreto y más o menos accesible a los genes
terapéuticos externos
 Las enfermedades provocadas por la alteración de más de un
gen, o por la falta de coordinación de varios genes
(poligénicas)

Somática

Son lógicamente más complejas de abordar y de momento se

desestima la terapia génica para su posible tratamiento.
 EJEMPLO
La división celular incontrolada y/o la
ausencia de muerte celular programada
(controlados genéticamente y
regulados por más de un gen)

la acumulación de errores o mutaciones

durante la vida del individuo en más
El cáncer es una excepción de un gen de los que controlan la división
y la muerte en una misma célula somática
y ésta acaba generando el tumor.

el cáncer es estrictamente una

enfermedad poligénica.

la terapia génica se ha utilizado en ciertos

modelos de tumores con el fin desactivar
el suicidio de las células cancerosas.
 ENFERMEDADES GENÉTICAS: Clasificación
según el número de genes alterados y origen del
gen Nucleares
Nucleares
• - Enfermedades cromosómicas: afectan a
múltiples genes.
• - Enfermedades monogénicas: un único
gen alterado (~ 8.000 descritas).
• - Enfermedades poligénicas: varios genes.
Mitocondriales
• Uno o varios genes alterados.
TIPOS DE INTERVENCIÓN EN
TERAPIA GÉNICA
• TRANSFERENCIA GÉNICA
– La terapia génica requiere que se transfieran
eficientemente los genes clonados a células
enfermas, de manera que los genes introducidos
sean expresados en cantidad adecuada.
– Tras la transferencia génica, los genes insertados se
pueden llegar a integrar en los cromosomas de la
célula, o bien quedar como elementos genéticos
extracromosómicos (episomas).
 Genes integrados en
cromosomas
La ventaja
Puede perpetuarse por replicación cromosómica tras la división celular.

Como las células de la progenie también contienen los genes

introducidos, se puede obtener una expresión estable a largo plazo. Por
lo que a clave es dirigir la modificación a las células madre (una
población minoritaria de células precursoras indiferenciadas que dan
lugar a las células diferenciadas maduras del tejido).
Las células madre no sólo dan lugar a las células maduras del
tejido, sino que al mismo tiempo se renuevan ellas mismas.
Se trata de una población inmortal de células a partir de
la cual deriva el resto de células del tejido.
La transferencia eficiente de genes a las células
madre y la posterior estable expresión del gen
estable ofrece, por tanto, la posibilidad de curar
un trastorno genético
 Genes integrados en
cromosomas
• Inconvenientes
La inserción suele ocurrir casi al azar: la localización de los genes
insertados puede variar enormemente entre células.
En algunos casos, los genes insertados pueden no expresarse
debido a su inserción en regiones muy condensadas.
En algunos casos, los genes insertados pueden no expresarse
debido a su inserción en regiones muy condensadas.
En algunos casos, los genes insertados pueden no
expresarse debido a su inserción en regiones muy
condensadas.

La terapia génica ex vivo ofrece al menos la oportunidad de

seleccionar las células en las que la integración ha tenido
éxito, gracias a que se amplifica a estas células en cultivo y
se comprueba si sus fenotipos presentan alguna evidencia
obvia de transformación neoplásica, como paso previo a su
re-administración al paciente.
 Genes no integrados
• Algunos sistemas de transferencia génica están diseñados para
insertar genes en células donde pueden quedar como elementos
extracromosómicos (episomas) y tener una expresión elevada.
– las células están dividiéndose activamente, el gen introducido puede no
segregar igualmente a las células hijas, por lo que la expresión a largo plazo
puede ser un problema.
– Para que surja la posibilidad de curar un trastorno genético puede ser remota:
harán falta tratamientos repetidos de terapia génica.
– Por ejemplo, las terapias génicas contra el cáncer suelen implicar la
transferencia y expresión de genes a células cancerosas con la intención de
eliminarlas. Una vez eliminado el tumor, el gen terapéutico puede no ser
necesario nunca más.
Mecanismos de modificación
del gen
 Protocolo de Terapia génica
• Aprobados en los Estados Unidos hasta 1999.
• a la corrección de genes defectuosos
• lograr que la células neoplásicas o infectadas sean vulnerables al
ataque del sistema inmune de los pacientes.
Métodos de transferencia
génica
 INTRODUCCIÓN
• Para alcanzar un determinado efecto biológico en
terapia génica es necesario introducir de manera eficaz
la secuencia génica de interés en la célula diana y
conseguir su expresión.
• Estos objetivos suponen contar con un adecuado
sistema de vehiculización o transferencia y al mismo
tiempo, disponer de promotores adecuados para
conseguir la máxima expresión del gen insertado en la
célula.
Métodos de transferencia
génica
 Métodos de transferencia génica
físico-químicos
• Fueron los primeros en ser desarrollados.
• En estos métodos el ADN foráneo o
exógeno está integrado en un plásmido,
que es una molécula de ADN que puede
ser mantenida de manera episómica, es
decir, de forma estable e independiente
del genoma de la célula huésped.
Métodos de transferencia génica
físico-químicos o no virales
Métodos de transferencia génica
físico-químicos o no virales
Transfección mediada por
agregados inorgánicos
 Precipitados con fosfato de
calcio
• Los coprecipitados de fosfato de calcio
(hidroxiapatita) y de ADN purificado se
han empleado para la transferancia y
expresión de información genética en
células en cultivo.
• Mediante este técnica se demostró que
era posible integrar ADN exógeno a los
cromosomas.
 Precipitados con fosfato de
calcio
• Una solución salina tamponada con
HEPES y que contiene iones fosfato se
combina con una solución de cloruro de
calcio que contiene el DNA a transfectar
 Precipitados con fosfato de
calcio
• Cuando ambas se combinan, se forma un precipitado
fino formado por el calcio cargado positivamente y el
fosfato cargado negativamente, que el DNA en su
superficie. Esta suspensión se añade a las células que
se quieren transfectar (normalmente un cultivo celular en
monocapa). Las células toman parte del precipitado, y
junto con él, el DNA.
Precipitados con fosfato de
calcio
Basado en la obtención de un precipitado entre
el cloruro de calcio y el DNA en una solución
salina de fosfatos. En esta situación co-
precipitan formando unos agregados que son
endocitados/fagocitados por las células.
Aparentemente el agregado con calcio protege
al DNA de la degradación por las nucleasas
celulares. El tamaño y la calidad del precipitado
es crítico para el éxito del proceso, que se ve
afectado por factores tales como pequeños
cambios en el pH de la solución,
etc...
Transfección mediada por
polímeros catiónicos
acoplados o a grupos no
lipídicos
MÉTODO DEL DEAE
DEXTRANO
Basado en la obtención de complejos entre
la resina DEAE y el DNA.
Los polímeros de DEAE dextrano o
polybreno tienen una carga que les
permite unirse a las muy negativamente
cargadas moléculas de DNA. El DNA
acomplejado se introduce en las células
mediante choque osmótico mediante
DMSO o glicerol. El uso de DEAE dextrano
se limita a las transfecciones transientes.
Liposomas, policationes
lipídicos comerciales y
polietilenimina
POLIMEROS
(POLIAMIDOAMINAS Y
LIPOPOLIAMINAS)
 Liposomas (lipofección)
• Son un vehículo para transportar agentes
farmacológicamente activos o información
genética.
• Liposomas comerciales:
– Lipofectin
– Tfx-50
– Transfectam

https://www.youtube.com/watch?v=ZQhmir
CciX8
 Liposomas (lipofección)

• Liposomas sensible a pH (liposomas negativamente cargados).

• No forman complejos.
• El ADN queda atrapado en la fase acuosa interior del liposoma.

Aplicaciones:
1.- Pueden transferir moléculas negativa- o positivamente cargadas. 2.-
Ofrecen un grado de protección al ADN de procesos degradativos.
3.- Pueden llevar trozos grandes de ADN.
4.- Pueden ser dirigidos específicamente a tejidos u órganos
POLIMEROS (POLIAMIDOAMINAS Y
LIPOPOLIAMINAS)
• Diferencia: Presentan diferencias a en sus
estructuras químicas
• Similitud: alta eficiencia de ADN a las
células
– Ambas continen residuos protonables aun pH
fisiológico. Lo que permite el control de pH en
el endosoma, por lo que puede proteger al
ADN de la degradación del ADN del sistema
lisosomal.
 Lipofectin
• Es una preparaión de liposomas
catiónicos compuesta por un lípido cragdo
positivamente. Mezcla de cloruro de N-[1-
(2,3-dioleyiloxy))propil]-N-N-N-trimetil
amonio (DOTMA) y (L-dioleoil
phosphatidilethanolamina(DOPE).
Lipofectin
Tfx-50
Transfectam
Polietilenimina
 Transfección mediada por
efectos físicos o mecánicos
 Fusión de protoplastos
• El método consiste en obtener
protoplastos de bacterias que llevan alto
número de copias del plásmido de interés
y fundirlos directamente con las células de
mamíferos en cultivo.
• La técnica de fusión de protoplastos surge como
especialidad o aplicación a partir de las técnicas de
aislamiento y cultivo de protoplastos, que permiten la
obtención de células desprovistas de pared celular
gracias a la acción de enzimas líticos (celulasas,
pectinasas) obtenidos de microorganismos
(Aspergillus sp.; Trichoderma viride; Rhizopus sp.), y su
posterior crecimiento (división celular, formación de
microcallos y regeneración de plántulas por vía
organogénica o embriogénica).

http://slideplayer.es/slide/2373144/
https://www.youtube.com/watch?v=tCl1WQ
fNJCU
 Electroporación
Con esta metodología, se busca
permeabilizar las membranas,
mediante el aumento significativo de la
conductividad eléctrica, causado por
un campo eléctrico aplicado
externamente. Las membranas, se
desestabilizan originando una pérdida
temporal de la permeabilidad
produciendo poros reversibles, por los
que se produce el paso de
macromoléculas, fuga de iones,
escape de metabolitos y mayor
absorción de DNA, por parte de las
células (Krassowska &Filev, 2007;
Foxet al. 2006).

https://www.youtube.com/watch?v=-
z9yiCu2JjM
https://www.youtube.com/watch?v=EjK
sAerMJ9M
Las ventajas de esta técnica son que
permite la transfección de líneas
celulares recalcitrantes a otros
métodos (se requiere de su
optimización para cada tipo celular), se
aplica a millones de células a la vez y
habitualmente la eficiencia de
transfección celular es del 100% de las
células que sobreviven al pulso
eléctrico.

En términos generales la mayor

desventaja de la electroporación es su
costo, ya que la mayoría de los
equipos comercialmente disponibles
son caros, en el orden de los miles de
dólares, además de los accesorios
como cubetas y adaptadores que
también lo son (7).
 Transferencia por microinyección
• Microinyección
Es una de las técnicas más precisas para la
introducción de DNA foráneo o de
macromoléculas dentro de los
compartimentos intracelulares específicos
de las células.
 Transferencia por microinyección
• Utiliza microcapilares o microagujas de
vidrio y sistemas de microscopia para
depositar el DNA foráneo, en el interior de
células vegetales.
• Además, el hecho que junto al DNA
desnudo se puedan inyectar otros
elementos genéticos, como plastidios,
mitocondrias y cromosomas.
 Transferencia por microinyección
• El equipo que se requiere para realizar el
proceso de microinyección es llamado
micro manipulador, compuesto por un
microscopio y por los accesorios de guía,
para realiza desplazamientos (Sharma et
al. 2002; Holm et al. 2000).
• https://www.youtube.com/watch?v=EjKsA
erMJ9M
• https://www.youtube.com/watch?v=xHvyIC
RM6FQ
 Bombardeo con
microproyectiles (Biobalística)
Esta técnica, se basa en la utilización de
microproyectiles recubiertos del DNA que se
desea transferir, que son disparados sobre
los tejidos vegetales a altas velocidades,
atraviesan la pared y la membrana celular y
llevan al interior de la célula los genes de
interés para su posterior integración en el
genoma vegetal (Sanford, 2000; Martínezet
al. 2004; Vasil, 2007).
Este sistema de transformación Para que los micro-proyectiles puedan
requiere de un dispositivo mecánico atravesar las membranas celulares y llegar
que permita realizar el bombardeo al núcleo de las células blanco, deben ser
de los tejidos vegetales. impulsados a velocidades supersónicas

por explosión de Por liberación de gas

pólvora seca, por comprimido a alta presión
variación de fuerza de (aire, helio, CO o N ).
2 2
aceleración, a través
de descarga eléctrica o

https://www.youtube.com/watch?v=wz0TNj
UkzVg
 Biobalística
Los microproyectiles empleados son
partículas aproximadamente esféricas
(microesferas), elaboradas de materiales
densos, como el oro o tungsteno,
de diámetro variados, que pueden ir desde
los 0,4 μm hasta 4 μm.

https://www.youtube.com/watch?v=nxjIbBi
udp0
El casete de expresión con los genes de
interés puede ir o no en un vector, ya que no
es requerido para el proceso de
transformación. El casete de expresión debe
ser adherido a los microproyectiles y, para
esto, se han diseñado varias metodologías,
entre las más utilizada es la que emplea
cloruro de calcio y espermidina, para la
precipitación del DNA sobre los
micorproyectiles.

(Bhat &Srinivasan, 2002; Altpeteret al. 2005;

Sanford, 2000; Rao et al. 2009).
Todo el sistema Tras el bombardeo, el DNA
funciona en un vacío se desprende de los
moderado para evitar microproyectiles, debido a
el rozamiento con el las modificaciones del
aire, condiciones que entorno iónico.
las células vegetales
soportan durante uno De acuerdo con la localización
o dos minutos. de los microproyectiles en la
célula, el DNA se puede integrar
de forma estable en núcleo,
cloroplastos o mitocondrias de
las células vegetales, mediante
recombinación al azar.
Finalmente, los tejidos son
colocados en condiciones
adecuadas para la
regeneración de plantas,
mediante técnicas de
cultivo de tejidos vegetales.
Cabe anotar que los tejidos
vegetales empleados son
sometidos a un tratamiento
osmótico pre y pos
bombardeo, con el fin de
evitar el daño de las células
por el procedimiento
El mecanismo de disparo se
basa en una pistola especial
que lanza las partículas a más
de 400 m/s sobre el tejido de
forma, que penetran sin destruir
la membrana celular.

En este método de transformación, las

construcciones genéticas son más
simples, incluyen los genes de interés
y de selección con sus secuencias
reguladoras respectivas, pueden ir
incluidas en plásmidos o en forma de
molécula lineal
Esta técnica fue propuesta, Entre las desventajas se
inicialmente, para introducir encuentran:
material genético en el genoma
porcentaje de éxito variable; es frecuente
nuclear de plantas superiores, pero la inserción de varias copias del casete de
en los últimos años se ha usado expresión variando desde 1 hasta 20, que
para pueden ir en tandem, causando
transformar bacterias, protozoos, silenciamiento génico; muchas veces no
hongos, algas, insectos, tejidos se consigue una introducción estable del
animales y plantas in vivo. Además, transgen; se presentan rearreglos en el
en la actualidad, constituye el único DNA transferido que difieren en tamaño; se
método de transformación, que puede presentar daño en los tejidos; el
sistema es cotoso
permite transformar organelos
celulares (Mohan Babuaet al. 2003; (Hansen &Wright, 1999; Veluthambiet al.
Larik et al. 2004). 2003; Danilova, 2007).
 Inyección directa de ADN
desnudo
• Esta estrategia supone la inyección
directa de ADN sin ningún revestimiento
lipídico o proteico en el interior de la
célula.
• La especificidad en protocolos in vivo
sigue resultando un problema aunque esta
variante terapéutica ha sido utilizada con
cierto éxito en la inmunización contra
enfermedades o contra ciertos tipos de
cáncer
Inyección de ADN plasmídico desnudo

• Fácil de realizar.
• Los tejidos que muestran expresión del transgen después de
inyección de ADN plasmídico incluyen timo, piel, músculo cardíaco y
esquelético.
• El ADN plasmídico no sufre cambios en el patrón de metilación
sugiriendo que no se ha replicado después de la inyección y tampoco
se integra en el genoma.
• La preinyección de soluciones de sacarosa en el músculo
incrementa algo los niveles de expresión del transgen.
• El músculo de primates parece ser menos eficiente en la
incorporación del ADN que el músculo de roedores. Tamaño del ADN:
2-19 kilobases.
• El ADN desnudo posee la cantidad
mínima de ADN para evitar su
degradación y pérdida durante la división
celular, quedando protegido en el interior
de la célula por elementos que permiten
su replicación en cada división celular
como si fuese un minicromosoma artificial.
 ~ Vectores ~
• Métodos virales: • Métodos no virales:
· Retrovirus. · Bombardeo de
· Adenovirus. partículas.
· Virus · Inyección directa de
Adenoasociados ADN.
(VAA)
· Liposomas
· Herpes Virus. catódicos.
 Tipos de virus usados:

Retrovirus Adenovirus

Virus de Herpes Virus Adenoasociados

~ Propiedades Del Método Viral ~
Ex Vivo In Vivo

Vector Viral Vector No Viral