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BIOQUÍMICA

 
 
Profesor:  Mario  Cas4llo  Ruiz  
E-­‐mail:  mhcas4lr@gmail.com  
 
Coordinador:  Daniel  Cabrera  
E-­‐mail:  daniel.cabrera@ubo.cl  
Ciné4ca  enzimá4ca  
Ciné,ca(Enzimá,ca(
•  Determina(la(can,dad(de(producto(generado(por(una(reacción(
enzimá,ca(en(un(,empo(determinado.(
(
•  Para(una(reacción(enzimá,ca(la(velocidad(de(reacción(es:((
((((((((
(
( (E(((+(((S((( ( ( (((E?S ( ( ((E(((+(((P( v(=(kcat([E?S](
(
kcat(o(número(de(recambio(se(define(como(la(can,dad(de(substrato(
transformado(en(la(unidad(de(,empo(por(una(can,dad(dada(de(
enzima.((
Orden  de  la  reacción  
Orden(de(la(Reacción(
Orden(cero(

Orden(uno(

•  Reacción(de(Orden(uno:(la(velocidad(es(proporcional(a(la(
can,dad(de(substrato.(
•  Reacción(de(Orden(Cero:(la(velocidad(es(constante(y(no(depende(
de(la(can,dad(de(substrato.((
Porqué  la  velocidad  llega  a  ser  
¿Por(qué(la(velocidad(llega(a(ser((
constante?  
constante?(

La(velocidad(máxima((Vmax)(depende(de(la(can,dad(de(enzima(
presente(
Ec  de  Michaelin-­‐Menten  
Ecuación(de(Michaelis?Menten(

(E(((+(((S((( ( ( (((E?S ( ((E(((+(((P(

v(=((Vmax$[S](
(((K $+([S]$(
m

Ecuación(de(Michaelin?Menten(

Vmáx:(corresponde(a(la(velocidad(máxima.(
(
Km:(Constante(de(Michaelis.((
Constante  de  Michaelin  
Constante(de(Michaelis(
k1( k2(
(E(((+(((S((( ( ( (((E?S ( ((E(((+(((P(
k?1(

Km(=((k?1(+((k2(
((( Si(la(constante(de(velocidad(k2(<<<(k?1((
( (((((k1( ((

Km(=(((k?1(((((
( La(Km(es(una(medida(de(la(afinidad(que(
((k1( presenta(la(enzima(por(el(substrato((

Mientras(menor(sea(el(valor(de(Km(mayor(será(la(afinidad(de(la(
enzima(por(su(substrato(
KmKm:   Situaciones  especiales  
:(Situaciones(especiales(((
•  [S](=(Km(
v(=((Vmax$[S](
(((K $+([S]$(
m

si(Km(=([S](

v(=((Vmax$(
((((((2(

La(Km$representa(la(concentración(de(substrato(a(la(cual(se(
ob,ene(la(mitad(de(la(velocidad(máxima.((
KKm:  
m
Situaciones  especiales  
:(Situaciones(especiales(
•  [S](>>>(Km(
(
v(=((Vmax$[S]( v(=((Vmax$[S](
( (((K $+([S]$( (((((((([S]$(
m
(
( v(=((Vmax$(
•  Km(>>>([S]( ((

v(=((Vmax$[S](
( (( (K $$(
m
Eficiencia  catalí4ca    
Eficiencia(Catalí,ca(
•  Es(una(constante(que(permite(determinar(y(comparar(la(
eficiencia(catalí,ca(de(enzimas.((

EC=(((kcat(((((
(
((Km(

•  Una(enzima(será(mas(eficiente(cuando(su(kcat(es(elevado(y/o(su(
Km$es(pequeña.(
(( ((

(
Gráfica  Michaelin-­‐Menten  
Gráfica(de(Michaelis?Menten(
•  En(la(representación(de(Michaelis?Menten(se(gráfica(la(V(vs([S](

A(par,r(de(esta(gráfica(no(
V(
es(posible(determinar(
parámetros(ciné,cos(como(
la(Vmax(y(la(Km.$(

S(

¿Cómo(podemos(calcular(los(parámetros(ciné,cos(de(una(
enzima?((
Representación(de(Lineweaver?
Representación  de  Lineweaver-­‐-­‐-­‐  Burk  
Burk(
(
•  Es(una(representación(gráfica(que(permite(calcular(parámetros(
ciné,cos(como(la(Km$y(la(Vmax.(

•  Consiste(en(el(recíproco(de(la(ciné,ca(de(Michaelis?Menten.((

((( 1 ( (Km$$$$$$1((((((((((1((((((((((((((((((
=( +(
V ( (Vmax$$[S]((((((((Vmax((((((((((((((((((
Representación(de(Lineweaver?
Burk(
Representación   de  Lineweaver-­‐-­‐-­‐  Burk  
(
•  En(la(representación(de(Lineweaver?Burk(se(gráfica(la(1/V(vs((((((
1/Km.(

1 ( (Km$$$$$$1((((((((((1((((((((((((((((((
+(
=(
((( V ( (Vmax$$[S]((((((((Vmax((((((((((((((((((

(
Pendiente:(Km/Vmax(
(
Intercepto(eje(Y:(1/Vmax(
(
Intercepto(eje(X:(1/Km(
(
(
Ejercicio  
•  La  Tripsina  es  una  pep4dasa  que    es  producida  por  
el  páncreas.  Se  determino  la  velocidad  de  reacción  
de  la  tripsina  frente  a  dis4ntas  concentraciones  de  
proteína  (substrato).  

[S]  nM   V  (nM/min)  


0,1   0,20  
0,5   0,95  
1   1,82  
5   6,67  
10   10,00  
50   16,67  
100   18,18  
•  Graficando  V  vs  [S]  
Ejercicio  
20,00  
[S]  nM   V  nM/min    
 
 
0,1   0,20   15,00  

Velocidad  (nM/min)  
 
0,5   0,95    
 
1   1,82   10,00  
 
 
5   6,67    
5,00  
10   10,00    
 
50   16,67    
0,00  
100   18,18   0   20   40   60   80   100   120  
[S]  nM  

La  enzima  exhibe  una  ciné4ca  del  4po  Michaelis-­‐-­‐-­‐    Menten.  


•  Graficando  1/V  vs  1/[S]  
Ejercicio  
1/[S]  (nM)   1/V  (nM/min)  
6,0  
10   5,050  
2   1,050  
4,0  
1   0,550   1/V  
0,2   0,150   2,0  

0,1   0,100  
0,02   0,060   0,0  
0   2   4   6   8   10   12  

0,01   0,055   1/[S]  


Ecuación  de  la  Recta  y=mx  +  b  
Pendiente:   y2    –  y1   Km  (1/V2)  –  (1/V1)   Km   0,055  -­‐-­‐-­‐    5,05   0,5  
=   =   =   =  
x2    –  x1   Vmax   (1/[S]2)  –  (1/[S]1)   Vmax   0,01  -­‐-­‐-­‐  10  

Intercepto eje y:   b  =  y  -­‐-­‐-­‐    mx  

1   1   Km  1  
=   -­‐   =   5,05    -­‐-­‐-­‐    0,5  x    10   =  0,05   Vmax   =  20  nM/min  
Vmax   V   Vmax   [S]  

Km  
Km   =    Vmax   x     Pendiente  
Km  =    20    x     0,5  

Km  =  
   10  nM  
Utilización de los parámetros de la
Ecuación de Michaelis-Menten

Por medio de la
determinación de la Km
podemos saber la afinidad
que tendrá una enzima
por un determinado
sustrato.

Según la
determinación de Kcat
podemos saber la
cantidad de unidades
transformadas en
unidad de tiempo.
Factores  que  afectan  la  ac4vidad  
enzimá4ca  
•  Concentración  del  sustrato  
•  Concentración  de  la  enzima  
•  Temperatura  
•  pH  
•  Presencia  de  cofactores  
•  Presencia  de  inhibidores  (competitivo,  no  
competitivo,  mixto)  
Inhibidores  Enzimá4cos  

Son  sustancias  que  alteran  la  ac4vidad  catalí4ca  de  las  


enzimas  disminuyendo  total  o  parcialmente  la  ac4vidad  
de  éstas.  

Bothropoides  jararaca  
Inhibición  enzimá4ca  
Es    de    importancia    comprender    la    manera    en    que    se    inhiben  
las  enzimas  por  los  siguientes  mo4vos;  
 
• El  flujo  de  metabolitos  a  través  de  las  vías  metabólicas  puede  
controlarse  mediante  la  inhibición  enzimá4ca  selec4va.  
• A   través   de   la   inhibición   se   ha   logrado   descubrir
 el  mecanismo  de  acción  de  muchas  enzimas.  
• Los  inhibidores  enzimá;cos  se  emplean  como  fármacos,  
insecticidas  y  armas  químicas  entre  otros.  
Inhibición  enzimá4ca  
La  inhibición  enzimá4ca  puede  ser  de  2  4pos;  
 
Inhibición   Reversible;   Los   inhibidores   reversibles   se   disocian   libremente  
de  las  moléculas  de   enzimas,   ya  que   se  unen   a  esta   por   medio  de  enlaces  
débiles.   Hay   varios   4pos   ciné4camente   dis4ntos,   pero   lo   más   común   es  
hablar  de  inhibición  competitiva,  inhibición  no  competitiva  e  inhibicion  
mixta.  
 
Inhibición    Irreversible;    Es    aquella    en    que    el    inhibidor    se    enlaza    de    tal  
manera      a      la      enzima      que      su      velocidad      de      separación      del      complejo  
[Enzima-­‐Inhibidor]  es  despreciable.  
Algunos    inhibidores    son    análogos    al    sustrato    y    sólo    se    enlazan    al    sitio  
ac4vo   de   la   enzima   adecuada.   Esto   suele    llevar   a   la   modificación    de   un  
aminoácido  del  si4o  ac4vo  en  forma  irreversible.  
Inhibidores  Reversibles  
La  inhibición  reversible  se  caracteriza  por:  
 
•  La  unión  entre  la  enzima  y  el  inhibidor  es  reversible  

•  Existe  un  equilibrio  entre  la  enzima  y  el  sustrato  libre  junto  con  el  
complejo  enzima-­‐-­‐-­‐sustrato.  
Inhibición  compe44va  
Los      inhibidores      compe..vos      son      estructuralmente      similares      a      las      moléculas      de  
sustrato      y      se      unen      al     si4o      activo      de      la      enzima,      es      por      esto      que      se      les      llama  
compe4tivos.       En       determinado       momento,       cualquiera       de       los       dos,       el       inhibidor  
compe4tivo    o    la    molécula    de    sustrato,    se    une    al    sitio    activo    de    la    enzima.    Como    el  
enlace    es    reversible,   se    deduce    que    cuando    aumenta    la    concentración    de    sustrato    la  
mayoría    de    las    moléculas    de    enzima    estarán    presentes    en    forma    de    complejo    ES,  
mientras     que     si    aumenta     la     concentración     de     inhibidor,     el     complejo     EI     (enzima     –  
inhibidor)  predominará.  
Inhibidores  Compe44vos  
•  El   inhibidor   compe44vo,   es   aquel   que   compite   con   el   sustrato  
por   el   si4o   ac4vo   de   la   enzima,   de   esta   forma   impide   la  
formación  de  producto.  
Constante  de  Inhibición  (Ki)  
E  +  I  E-­‐-­‐    I  
 
Ki  =  [E-­‐-­‐      I]  
[E][I].  
•  El  Ki  es  un  indicador  de  la  potencia  rela4va  del  inhibidor.  
– A  mayor  Ki,  existe  una  mayor  afinidad  del  inhibidor  por  la  
enzima.  
 
 
•  La  inhibición  va  a  depender  de  la  concentración  de  inhibidor,  de  
sustrato  y  de  las  afinidades  rela4vas  que  tengan  el  sustrato  y  el  
inhibidor  por  el  si4o  ac4vo  
Inhibidores  Compe4vos  
•  Son  compuestos  que  4 enen  una  estructura  
química  y/o  geométrica  similar  al  sustrato.  

•  Ejemplo:  El  Metotrexato  es  un  inhibidor  


reversible   de   la   enzima dihidrofolato-­‐-­‐  
reductasa  
Representación  de  los  Inhibidores  
Compe44vos  

v   1/v  

Km   Km    ap   [S]   -­‐-­‐-­‐1/Km      -­‐-­‐-­‐1/Km  ap   1/[S]  

•  La  inhibición  compe44va  incrementa  el  valor  de  Km  


• No  modifica  la   Vmax   de  reacción  solo  se  necesita  una  
concentración  más  alta  de  sustrato  para  alcanzarla.  
Ejemplo  de  Inhibición  Compe44va  
Inhibidores  No  Compe44vos  
Los  inhibidores  no  compe44vos  se  unen  a  un  lugar  dis4nto  al  
si4o  ac4vo,  por  lo  cual  no  compiten  con  el  sustrato.  
 
 
 
•  El   inhibidor   no   compe44vo  
modifica   la   forma   del   si4o  
ac4 vo   lo   que   impide   la  
interacción  de  la  enzima  con  el  
sustrato.  
Representación  gráfica  de  los  Inhibidores  
No  Compe44vos  
1/v  
v  

K   [S   -­‐-­‐-­‐1/Km   1/[S]  
m   ]  

•  La  inhibición  no  compe44va  no  modifica  el  valor  de  Km,    pero  
reduce  la  Vmax.  
Mecanismos  de  Inhibición  Enzimá4ca  

Modificación  
Irreversible  
Covalente  
Inhibidores  Irreversibles  
•  Reaccionan  con  la  enzima  formando  un  enlace  covalente,  lo  cual:  
–  Bloquea  la  unión  del  sustrato.  
–  Inhibe  la  ac4vidad  de  la  enzima.  
•  Inhiben  de  forma  permanente  a  la  enzima.  
–  Se  requiere  la  síntesis  de  novo  de  enzima  para  superar  la  inhibición.  
Ejemplos  de  Inhibidores  Irreversibles  
•  Fármacos  como  la  Penicilina,  la  Aspirina  y  el  Disulfiram  son  
inhibidores  irreversibles  de  la  ac4vidad  de  enzimas.  

–  La  Penicilina  es  un  inhibidor  de  la  transpep4dasa,  encargada  de  la  síntesis  
de  la  pared  bacteriana.  
–  La  Aspirina  es  un  inhibidor  de  la  COX,  enzima  que  produce  mediadores  
proiinflamatorios.  
–  Disulfiram  es  un  inhibidor  de  la  aldehído  deshidrogenasa,  una  enzima  que  
par4cipa  en  el  metabolismo  del  alcohol.  

•  Compuestos  tóxicos  como,  los  gases  nerviosos  (DFP)  o  los  


metales  pesados  actúan  como  inhibidores  irreversibles  
Mecanismos  moleculares  que  regulan  
la  actividad  enzimá4ca  
Dentro    de    la    célula    la    actividad    enzimática    será    regulada    por    uno    o    mas    de    
los  siguientes  mecanismos.  
 
• Expresión  de  la  proteína  enzimática  a  consecuencia  de  los  cambios  genéticos.  

• Activación  o  inactivación  de  modo  irreversible  por  enzimas  proteolíticas.  

• Activación  o  inactivación  de  modo  reversible  por  modificaciones  covalentes  


(ej.,  fosforilación).  

• Regulación  alostérica  moduladora  de  la  actividad  de  las  enzimas  clave  a  través  
de  la  fijación  reversible  (feedback  regulation)  de  pequeñas  moléculas.  

•   Degradación  de  las  enzimas  por  proteasas  intracelulares  


Regulación  por  expresión  génica  
Suele       darse   principalmente  en  
procariontes,   donde   genes  
relacionados   en  una   vía  
metabólica      están      regulados      por  
los  sustratos  de  dichas  enzimas.  
 
Uno  de   los   sustratos   de   las   enzima  
actúa    como    modulador    alosterico  
de  la  actividad  de  algún  regulador  
de  la  expresión  génica.  
Ac4vación  o  inac4vación  por  acción  de  
proteasas  
Algunas      enzimas      se      producen  
como      una      forma      inactiva      que  
deben    ser    procesadas    por    otra  
enzima   antes    de  poder  
activarse.   Estas  proteínas  se  
llaman   proenzimas   o  
zimógenos.   Para  activarse,   los  
zimógenos   sufren    un  ataque  
hidrolí4co   que    origina    la  
liberación   de  uno    o    varios  
péptidos.   El   resto   de   la   molécula  
proteica  adopta  la  conformación  
y    las    propiedades    de    la    enzima  
activa.  
Regulación  por  modificaciones  
covalentes  
Diversos  tipos  de  modificación  covalentes;  
 
Fosforilaciones:     Son     llevadas     a     cabo     por     enzimas     quinasas     que     fosforilan     en  
residuos  de  Ser,  Thr,  Tyr,  Lys  e  His.  Su  efecto  puede  ser  de  activación,  inactivación,  
cambio  de  sensibilidad   o  cambio  de  estructura  cuaternaria.  En  general  suelen  ser  
reversibles.  
 
Adenilacion:    Proceso    en    el    cual    se    consume    ATP    para    unir    un    grupo    ADP    a    la  
enzima  y  producir  su  activación.  
 
Interconversión    disulfuro-­‐ditiol.    La    interconversión    de    grupos    di4oles    (–SH)    de  
cadenas  laterales  de  cisterna  en  disulfuros  (-­‐S-­‐S-­‐)  por  oxidación  es  un  proceso  de  
enorme  importancia  en  la  regulación  enzimática  en  plantas.  
 
Uridilación-­‐desuridilación:   Proceso   similar   a   la   adenilacion   pero   con   consumo   de  
UTP                                 para                                 unir                                 UDP                                 a                                 la                                 enzima.  
Regulación  alosterica  y  Feedback  
regula4on  
La   regulación  alosterica  ocurre  comúnmente  
en    vías    metabólicas    secuenciales    donde    el  
producto       de       una       reacción       actúa       como  
regulador      alosterico      de      una      enzima      que  
cataliza  un  paso  previo  en  la  vía.  
 
El         modulador         alosterico         suele         ser         el  
producto      de      la      reacción      enzimática      mas  
lenta  de  la  vía,  y  actúa  sobre  etapas  iniciales  
de      la      vía      para      evitar      la      acumulación      de  
sustrato.  
Regulación  por  degradación.  

La  disponibilidad  de   las  


enzimas             se             regula  
finalmente      por      medio  
de    su    degradación.    Así  
previniendo                                  su  
excesiva  acumulación   o  
presencia        cuando        no  
son  necesitadas.  
Resumen  
•  Las  enzimas  4 enen  múl4ples  mecanismos  de  regulación.  

•  La   ac4vidad  de  las  enzimas  puede  ser  inhibida  por   compuestos  


naturales  o  sinté4cos.  
– Existen  mecanismos  reversibles  e  irreversibles  de  inhibición  
enzimá4ca.  
 
 
•  Los  mecanismos  de  inhibición  pueden  ser  dilucidados  mediante  
el   análisis   de   los   cambios   de   los   parámetros   ciné4cos   de   las  
enzimas.