Resumen

La escisión en embriones del erizo de mar, Arbacia punctulata, consiste en ocho divisiones
muy rápidas que requieren una síntesis continua de proteínas para sostenerlas. Esta
síntesis está programada por ARNm maternos almacenados, que codifican tres o cuatro
proteínas particularmente abundantes cuya síntesis es apenas detectable en el óvulo no
fertilizado. Una de estas proteínas se destruye cada vez que las células se dividen. Los
huevos del erizo de mar Lytechinus pictus y los oocitos de la almeja surfera Spisula
solidissima también contienen proteínas que solo se producen después de la fertilización y
se destruyen en ciertos puntos del ciclo de división celular. Proponemos llamar a estas
proteínas las ciclinas.

Introducción
La fertilización de los huevos o la maduración meiótica de los ovocitos en muchos
organismos se acompaña de un aumento en la tasa de síntesis de proteínas programada
por el ARNm materno (Woodland, 1982). Además, los cambios en el patrón de síntesis de
proteínas se encuentran en casi todos los casos estudiados recientemente :; la lista incluye
estrellas de mar (Rosenthal et al., 1982), almejas (Rosenthal et al., 1980), ranas (Woodland.
1982) y ratones (Schultz y Wassarman, 1977; McGaughey y Van Blerkom, 1977; Braude et
al., 1979 ). Los erizos de mar parecen ser la excepción, según los estudios de Carefu de
Brandhorst (1976). Utilizó geles bidimensionales para analizar patrones de síntesis de
proteínas en huevos de Lytechinus pictus antes y después de la fertilización, y no encontró
diferencias cualitativas. Sin embargo, estudios más recientes han demostrado que hay al
menos cierta regulación de la traducción cualitativa en los erizos, ya que el ARNm para las
histonas se almacena aparentemente en el pronúcleo femenino (Venezky et al., 1981) y no
se traduce hasta después de la primera escisión (Wells et al, 1981) Ni el papel del mRNA
maternal ni las razones de la existencia de estos ejemplos sorprendentes de control de la
traducción son claros (Gross, 1968: Colman, 1983). Sin embargo la inhibición de la síntesis
de proteínas en huevos de erizo de mar fertilizados por emetina o puromicina a 10^-4 M
(Hultin, 1961: Hogan y Gross, 1971) bloquea el desarrollo en la etapa de "veta", en la que el
núcleo está particularmente bien marcado y rodeado de discos apilados de membranas.
llamadas láminas anulares (Wagenaar y Mazia, 1978; Kessel, 1968). Tales inhibidores
permiten la fertilización normal, el flujo pronuclear y la replicación del ADN, pero previenen
completamente la descomposición de la envoltura nuclear, la condensación del cromosoma
y la formación del eje mitótico (Wagenaar). y Mazia, 1978) Si la adición de emetina se
retrasa hasta aproximadamente la mitad del ciclo celular (alrededor de 30 minutos en
embriones de Arbacia que se desarrollan a 19 ° C), la envoltura nuclear se rompe
normalmente, los cromosomas se condensan, se forman los husos y las células se dividen,
aunque no se separan normalmente después de la citocinesis. La interpretación más simple
de estos resultados es que una o más de las proteínas cuya síntesis está especificada por
el ARNm materno es absolutamente requerido para la división celular durante la escisión

'Dirección actual: MRC Laboratory of Molecular Biology. Hills Road, Cam Bridge, Inglaterra.
Dirección actual: Departamento de Anautomía. Harvard Medical School, Bos ton,
Massachusetts 02115 Dirección actual: Bioscience Center, University of Minnesota, St.
Paul. Minnesota 55455 Dirección actual: Scripps Insiltutlion of Oceanography. La Jolla,
California 92093 UA a quien debe dirigirse la correspondencia. Dirección actual:
Departamento de Bioquímica. Pista de tenis carretera. Cambridge CB2 10W Inglaterra

En este artículo se muestran diferencias significativas entre los patrones de síntesis de

proteínas en huevos de Arbacia punctulata antes y después de la activación por
espermatozoides o agentes partenogenéticos. Lo mismo ocurre en huevos de Lytechinus
pictus. Además, uno o dos de estos roteins cuya tesis se activa fuertemente después de la
fertilización parece ser destruida más o menos completa cada vez que los embriones se
dividen. Dos proteínas con propiedades similares se encuentran en la almeja Spisula
solidissima

Resultados La síntesis de proteínas en los huevos de erizo de mar puede activarse

mediante ciertos tratamientos partenogenéticos, así como mediante la fertilización. Por
ejemplo, tanto 10 uM A23187 como 10 mM NH4Cl activan la síntesis de ADN y proteínas
(von Ledebur-Villiger 1972, Steinhardt y Epel, 1974) a través de NH⁴CI eleva la tasa de
síntesis de proteínas a solo aproximadamente la mitad del valor que obtendría después de
la activación por A23187 o fertilización (Epel et al, 1974; Winkler et al, 1980). Ni los huevos
tratados con ionóforo ni los activados con amoníaco se dividen, a menos que reciban un
tratamiento adicional, como una exposición breve al agua de mar hipertónica o D²0. En
estas circunstancias, una proporción de los embriones activados partenogenéticamente
forman ásteres funcionales y posteriormente se dividen (Loeb, 1913; Dirksen, 1961;
Kuriyama y Borisy, 1978: Mazia, 1978).

Se producen nuevas proteínas después de la activación o fertilización de los huevos de

erizo de mar.
La Figura 1 compara Los patrones de síntesis de proteínas en huevos de Arbacia no
fertilizados, fertilizados y activados partenogenéticamente. Se añadió 35S-metionina a las
suspensiones de huevos, partes de las cuales luego se fertilizaron o activaron. Las
muestras se extrajeron a intervalos de 10 minutos para el análisis en geles
unidimensionales como se describe en Procedimientos experimentales.
Existen diferencias claras entre los patrones de proteínas elaborados antes y después de la
activación. . El cambio más sorprendente es la aparición de las nuevas bandas prominentes
A, B. y C después de la fertilización o activación con A23187, tal como ocurre en Spisula
(Rosenthal et al., 1980). Sin embargo, una inspección más cercana revela otras
características interesantes, de las cuales la más inesperada es el comportamiento de la
proteína A, que en adelante llamaremos "ciclina". Es la proteína más fuertemente marcada
en los primeros tiempos después de la fertilización, pero a los 85 minutos de la fertilización
(carril g, fertilizada) casi ha desaparecido. Se vuelve más fuerte nuevamente en los carriles
h y i, solo para declinar nuevamente en el carril k. Estas oscilaciones en el nivel de ciclina
son extremadamente reproducibles, como se puede ver en las Figuras 2, 3 y 6, que
muestran un comportamiento similar en diferentes lotes de huevos de Arbacia fertilizados.

La ciclina no oscila después de la activación partenogenética.

Aunque la síntesis de ciclina está fuertemente inducida por A23187. o tratamiento con
NH4CI de huevos no fertilizados, bajo ninguna de estas circunstancias su nivel oscila de la
misma manera que en los huevos fertilizados. Probablemente esto se deba a que los
huevos no se dividen, un punto agrandado debajo

Activación de Amoníaco no Activa la Síntesis de Todas las Proteínas

Como se mencionó anteriormente, la activación de los huevos con bases débiles como el
NH4+ causa solo la mitad de la estimulación de la síntesis de proteínas que el A23187 O la
fertilización da. ¿Esto se debe a que la síntesis de todas las proteínas está activada a la
mitad o porque la mitad de las proteínas están activadas por completo? La Figura 1 muestra
que la proteína B no apareció después de la activación del amoníaco, aunque es una de las
más fuertemente marcadas en los huevos fertilizados y activados por ionóforos. En la mayor
parte, sin embargo, todas las proteínas se sintetizan con menos fuerza que en las
activaciones que implican la liberación de calcio intracelular. La síntesis de algunas
proteínas detiene la fertilización Varias proteínas, como los ejemplos marcados X, Y y Z en
la Figura 1, se producen en el óvulo no fertilizado, pero son muy difíciles de detectar
después de la fertilización, aunque continúan produciéndose en amoniaco activado. huevos.
Estas comparaciones se realizan más fácilmente al examinar los últimos tres carriles de la
Figura 1, en los cuales las exposiciones a la luz de los carriles finales (k) de los huevos no
fertilizados (U) y fertilizados (F) se combinan con el carril final activado con amoníaco. La
disminución de la síntesis en las bandas de prefecilización es más fácil de ver en la Figura
7, que muestra un experimento similar en Lytechinus pictus. La ciclina se destruye
periódicamente en un punto particular del ciclo celular La figura 2 correlaciona las
oscilaciones en el nivel de ciclina con el ciclo de escisión. El experimento se realizó de la
misma manera que el anterior, excepto que muestras adicionales de la suspensión de
huevos fertilizados se fijaron en glutaraldehído al 1% para un examen posterior bajo el
microscopio. La línea discontinua en la Figura 2 denota el índice de edad de escisión,
medido como se describe en Procedimientos experimentales. Las otras dos curvas
muestran las intensidades relativas de ciclina y proteína B, determinadas por la
densitometría de las autorradiografías. La etiqueta se acumula más o menos temprano en la
proteína B, mientras que la ciclina (banda A) cae precipitadamente al inicio de la escisión,
solo para aumentar y fallar nuevamente durante el segundo ciclo celular. La etiqueta en la
proteína C también aumentó linealmente, pero los datos se han omitido en esta figura para
mayor claridad de presentación.

La fluctuación cíclica en ciclina se debe a la destrucción periódica y la síntesis continua.

La oscilación en el nivel de ciclina se logró mediante una síntesis continua puntuada por la
destrucción en un cierto punto del ciclo celular. Para verificar el patrón de proteínas, se
examinó el patrón de la tesis de proteínas durante pulsos sucesivos de 10 minutos, al
mismo tiempo. el tiempo para realizar un experimento de etiquetado continuo en una
muestra paralela del mismo lote de huevos fertilizados. La Figura 3 muestra el experimento
de etiquetado continuo a la izquierda y el experimento de etiquetado a pulso a la derecha; a
representa una etiqueta continua de 26 min en el panel izquierdo y un pulso de 15 a 25 min
en el panel derecho; muestra de 36 min en el carril ba continua o un pulso de 25 a 35 min, y
así a intervalos de 10 minutos: los huevos comenzaron a dividirse en el carril e. Mientras
que el etiquetado continuo muestra la desaparición habitual (de ciclina justo antes de la
ruptura. El experimento de marcaje por pulsos muestra que la velocidad de síntesis de la
ciclina permanece prácticamente igual en todo el primer ciclo celular). Este resultado se
confirma en la Figura 4, que muestra la cuantificación de la intensidad. de las bandas en el
etiquetado del pulso (experimento. Uno esperaría que la mayoría de las proteínas se
comportaran como la proteína C, y mostrara un aumento lineal en la tasa de síntesis con el
tiempo. Del mismo modo, el comportamiento de la banda H, que es casi seguro La histona
está de acuerdo con los hallazgos de Wells y otros (1981) (su síntesis es apenas detectable
antes de la primera escisión, la tierra aumenta rápidamente en la etapa de dos células. El
comportamiento de la ciclina (la banda A muestra una tercera forma en que el ARNm puede
ser reclutado, por su tasa de síntesis aumenta muy rápidamente después de la fertilización,
con solo un aumento relativamente pequeño a partir de entonces. No parece haber ninguna
variación significativa en su tasa de síntesis correlacionada con el ciclo de división celular.
Este resultado sugiere (que las variaciones en la intensidad de la ciclina reveladas por un
marcador continuo se deben a su destrucción por proteólisis periódica, y no a periódicas)
(síntesis combinada con un cambio rápido y continuo) El hecho de que no hay signos de
variaciones periódicas en la extensión de el etiquetado de la ciclina en pulsos cortos sugiere
que la ciclina recién sintetizada puede tener que participar en algún proceso de maduración
o ensamblaje antes de que pueda eliminarse. La posibilidad de que la ciclina esté marcada
con metionina por algún otro proceso que no sea la síntesis normal de proteínas es excluida
por dos clases de experimentos, primero, su síntesis se puede programar en un lisado de
reticulocitos mediante el mRNA extraído de leggs no fertilizadas o fertilizadas (datos no
conocidos). En segundo lugar, su marcaje es inhibido por la emetina que se muestra a
continuación

La tasa de síntesis de ciclina disminuye al final de la escisión

La Figura 5 muestra que la ciclina continúa sintetizándose a una tasa alta durante al menos
5 h después de la fertilización a 20 ° C (estado de mórula). Después de las tres primeras
divisiones, se pierde la sincronía de la división celular (Harvey, 1956), y el etiquetado
continuo no mostró las oscilaciones en los niveles de ciclina observadas durante las tres
primeras divisiones de escisión (datos no mostrados). Sin embargo, parecía probable que la
ciclina todavía estuviera siendo destruida periódicamente. Para detectar esto, bloqueamos
la síntesis de proteínas con emetina y tomamos muestras 30 minutos más tarde para el
análisis de los geles. La ciclina desapareció de los embriones expuestos al inhibidor, como
lo muestra la comparación de los carriles 2 y 3. La ciclina aún se sintetiza a una tasa alta a
las 5 h (línea 4), más de la mitad del escote, pero es difícil de detectar a las 10 h, momento
en el cual la tasa de división celular se ha reducido considerablemente y el embrión se
encuentra en la mitad de la blastula transición (Newport y Kirschner, 1982: Wilson, 1896,
Hinegardner, 1967; O'Melia, 1983). Se requiere una inspección cuidadosa de los carriles 5 y
6 para detectar la síntesis de ciclina en esta etapa. Porque la banda es apenas visible. Sin
embargo, desaparece después de la exposición a la emetina, lo que demuestra que todavía
se está realizando y en bicicleta. A diferencia de. Las proteínas B y C aún se están
sintetizando y aparecen con bastante fuerza. En este momento, la citocalasina, la colchicina
y el taxol disminuyen la velocidad de desaparición de la ciclina. Ya hemos visto que la
ciclina no realiza ciclos normalmente, pero la síntesis de proteínas se ha activado mediante
A23187o NH4CI, sugiriendo que la división celular es necesaria para su desaparición. La
figura 6 muestra que cuando los óvulos son fecundados, pero la división celular está
bloqueada por la citocalasina D o la colchicina, el patrón de desaparición de la ciclina se ve
alterado. de modo que en lugar de su intensidad disminuye repentinamente a los 60-70
minutos, como en los controles, desaparece mucho más tarde y mucho más lentamente. El
significado de esta lenta degradación no está claro. Ambos fármacos permitieron la
activación normal de la síntesis de proteínas. Taxol tuvo exactamente el mismo efecto
(datos no mostrados). Parece que la rápida desaparición de la ciclina depende de algún
aspecto de la insuficiencia cardíaca. Si lo contrario es cierto, es decir, que la desaparición
de la ciclina es esencial para la división celular, no podemos decir.
Hay dos ciclinas en Lytechinus pictus.
Hemos buscado proteínas similares a la ciclina en otros dos organismos marinos,
Lytechinus pictus, un erizo de mar de California que se separó de Arbacia punctulata hace
unos 30 millones de años; y un molusco, la almeja Spisula solidissima, que es
filogenéticamente muy alejada de los equinodermos. La Figura 7 muestra un experimento
con Lytechinus realizado en la misma línea que la Figura 1. En términos generales (los
resultados se asemejan a los de Arbacià, en el sentido de que se produce un cambio
sorprendente en el patrón de síntesis de proteínas después de la fertilización y que algunas
de las proteínas de nueva creación son cíclicamente destruidas. Pero también hay
diferencias significativas de Arbacià. Primero. Lytechinus no tiene una sino dos ciclinas
prominentes, y éstas oscilan en diferentes fases. Además, el menor (el peso molecular de
las dos ciclinas muestra un comportamiento oscilatorio después de la activación del
amoníaco, algo que no se vio en Arbacia.

Las proteínas A y B en la espisula son ciclinas.

Como en Lytechinus, dos proteínas en la espisula mostraron oscilaciones correlacionadas
con el ciclo celular (Figura 8 son las proteínas denominadas A y B por Rosenthal y otros
(1980). Estas proteínas son escasas en oocitos no fertilizados y su síntesis aumentan muy
abruptamente después de la fertilización: prácticamente todo el ARNm para la proteína A se
asocia con polisomas por primera escisión (E. T. R. observaciones no publicadas)

Discusión
Los cambios cualitativos en la síntesis de proteínas después de la fertilización
En Arbacia tres polipéptidos, y en Lytechinus cuatro polipéptidos, muestran un aumento
proporcional mucho mayor en la síntesis después de la fertilización que la mayoría de las
proteínas codificadas maternalmente. Esto es contrario a las interpretaciones anteriores
basadas en los resultados de Brandhorst (1976), pero es más consistente con los hallazgos
recientes en una amplia variedad de otros organismos, como se menciona en la
Introducción. En todos los invertebrados marinos estudiados, tres o cuatro proteínas recién
sintetizadas muy abundantes aparecen después de la activación. mientras que un gran
número de otros muestran un aumento cuantitativo en la síntesis. Sin embargo, hay una
falta casi completa de correspondencia entre los patrones de proteínas marcadas y el
patrón de bandas teñidas en los geles, lo que implica que la síntesis de proteínas durante el
desarrollo temprano da como resultado una remodelación considerable de las proteínas
embrionarias. Esta remodelación implica el reclutamiento selectivamente programado del
ARNm maternal. La mayoría de los ARNm se reclutan gradualmente, de modo que la tasa
de síntesis de las proteínas que codifican aumenta linealmente durante las primeras horas
de desarrollo, hasta aproximadamente el estado de 200 células (Goustin y Wilt 1981;
Hinegardner, 1967, O'Melia). 1983). La concentración intracelular de estas proteínas, por lo
tanto, aumenta exponencialmente; un excelente ejemplo de esta clase general es el
ribonucleótido reductasa (Noronha et al., 1972). No todas las proteínas siguen este patrón.
Como se mencionó en la Introducción, la traducción del ARNm de histona materna se
retrasa hasta después de la primera escisión (Wells et al., 1981). El ARNm de ciclina
muestra un tercer tipo de reclutamiento de mensajes. que parece estar muy rápida y casi
completamente cargada en los ribosomas poco después de la fertilización (Figura 4).
Aunque la tasa de síntesis de ciclina permanece constante, lo que debería conducir a su
acumulación lineal, el hecho de que esta proteína se destruya regularmente significa que su
concentración citoplásmica sigue un tipo de patrón de diente de sierra.
Proteínas especificadas por mensajes maternos y mitotis
Estudios previos del huso mitótico a partir de embriones de erizo de mar hendidos
sugirieron que las proteínas especificadas por el ARNm maternal están asociadas
preferentemente con el aparato mitótico (Stafford e Iverson, 1964), y aunque las proteínas
en cuestión nunca han completamente caracterizados o claramente identificados (Wilt et al.,
1967, Raff et al.1972), parece haberse aceptado que la tubulina es una de las proteínas
codificadas maternalmente más abundantes (Davidson, 1976 Fulton y Simpson. 1979:
Davidson et al., 1982). Ciertamente, la movilidad de la ciclina principal en Arbacia es muy
similar a la de la alfa y beta tubulina, y al principio pensamos que probablemente era una de
estas proteínas. Sin embargo, en comparación con los estándares apropiados. La ciclina se
resolvió claramente a partir de tubulinas. La ciclina no se unió a una columna de afinidad
por el anticuerpo de tubulina (con el anticuerpo monoclonal de rata aislado por Kilmartin et
al., 1982), aunque Arbacia tubulina y, para nuestra sorpresa, la proteína 8 fueron retenidos
cuantitativamente por ella (observaciones no publicadas). Esto sugiere (que la proteína B
puede estar asociada con el aparato del huso a través de la tubulina, pero se requieren más
experimentos para aclarar este punto. Sin embargo, estas observaciones muestran que las
afirmaciones anteriores del efecto de que la tubulina es un producto importante del mRNA
materno se confundieron. (Raff et al., 1975). Esto plantea en forma aún más aguda la
pregunta de por qué la síntesis de proteínas es tan absolutamente necesaria incluso para la
primera división de escisión.

"Proteínas periódicas”
Es difícil creer que el comportamiento de las ciclinas no esté conectado con los procesos
involucrados en la división celular, pero en esta etapa no tenemos evidencia directa de que
lo esté. La síntesis y la destrucción periódica de las proteínas se han propuesto durante
mucho tiempo. para varias características del ciclo celular (Mitchison, 1971, John et al.
1981). Los husos mitóticos aparecen y desaparecen: los cromosomas se condensan y se
extienden: la envoltura nuclear se disuelve y se reforma (Mazia, 1961). Para inducir la
síntesis de novo de una enzima y luego destruirlo es una forma de encender y apagar su
actividad. Si bien se podría pensar que es improbable que las células utilicen dicho
mecanismo, ya que se plantean más preguntas que las que se resuelven con su existencia,
nos resulta difícil interpretar el comportamiento de la ciclina de cualquier otra manera
Desafortunadamente, no tenemos evidencia directa del papel fisiológico de la ciclina, pero
uno de sus roles más plausibles es promover directa o indirectamente la descomposición de
la envoltura nuclear, ya que la incapacidad de disolver la membrana nuclear es la
consecuencia más obvia de la inhibición de la síntesis de proteínas en embriones hendidos
(Wage naar y Mazia, 1978). Además, el hecho de que la membrana nuclear se rompe
después de la activación del amoníaco y nunca se reforma a pesar de las múltiples rondas
de replicación cromosómica (Paweletz y Mazia, 1979) se correlaciona precisamente con el
hecho de que la ciclina no desaparezca en estas condiciones. Sin embargo, esto es muy
especulativo, y se requerirán pruebas tales como la microinyección de citoplasma activado
con amoníaco en huevos detenidos con eme tina para dilucidar el papel de las diversas
proteínas involucradas. Dichos experimentos realizados en ovocitos de anfibios revelaron la
existencia de la entidad conocida como factor de promoción de la maduración (MPF), que
causa la descomposición de las vesículas germinales y la maduración meiótica en estas
células (Masui y Markert, 1971; Smith y Ecker, 1971). Las MPF pasan por alto las
fluctuaciones cíclicas en el nivel durante los ciclos de escisión posteriores, que se evitan
con la colchicina (Wasserman y Smith, 1978). Además, MPF requiere la síntesis de
proteínas para su formación, y presumiblemente es una proteína (Gerhart, 1980). Los
paralelismos entre el comportamiento del MPF y la ciclina son sorprendentes, pero aún
queda por determinar si existe una correlación directa entre la entidad fisiológica y la
química.

Procedimientos experimentales
Materiales Arbacia punctulata y Spisula solidissima se obtuvieron del Departamento de
Recursos Marinos del Laboratorio de Biología Marina, Woods Agujero, y mantenido en agua
de mar corriente a temperatura ambiente (aproximadamente 20 ° C) mientras que
Lytechinus pictus se obtuvo de Pacific Biomarine, Inc Venice, California, y se mantuvo en
tanques de agua de mar refrigerados a aproximadamente 15 ° C. Los gametos se
obtuvieron de Arbacia por 12 V AC La generosa estimulación de Spisula por disección y de
Lytechinus por inyección de 0,5 M KCl 35S-metionina fue el generoso regalo de Amersham
Corp. Fue en SJ204, que contiene acetato de 25 mM K y 2-mercaptoetanol 14 mM. Se
diluyó con agua a una concentración de 5 mCi / ml y se almacenó como alícuotas pequeñas
a -70 ° C.
El anticuerpo YOL1 / 34 de tubulina anti-levadura monoclonal de rata acoplado a Sepha
rose 4B fue el generoso regalo de John Kilmartin (Kilmartin et al. , 1982) Se prepararon
proteínas marcadas radiactivamente para patrones de peso molecular a partir de una
mezcla, cada una a 1 mg / ml, de proteínas purificadas disueltas en agua: citocromo c.
RNAasa A, inhibidor de la tripsina de soja, anión carbónica, drase, gliceraldehído 3 fosfato
deshidrogenasa, creatina quinasa, actina glutamato deshidrogenasa, albúmina de suero
bovino y beta galactosidasa. La mezcla fue incubada a 50°C con 0.16M tris-Cl, 5mM de
dithioerythriol pH 8,8) durante 2 minutos y luego se precipitó con 12,5% p / v de ácido
tricoloroacético. El precipitado se recogió en HEPES 1 M, EDTA 2 mM. 14C.N-etilmaleimida
1,5 mM, actividad específica 23,7 mCi / mmol (clara New England Nu), pH 7,4, e incubada a
20 ° C durante 30 min. Luego se diluyó en un tampón de muestra de gel SDS a una
concentración de aproximadamente O.1 mg / ml para cada componente (la dilución exacta
se evaluó realizando diluciones seriadas en un gel) y se almacenó a -70 ° C en pequeñas
alícuotas. Se incubó una muestra paralela directamente con 14CN-etihimaleimida (es decir,
sin el reductor y sin precipitación de TCA) a pH 7,4. Esto dio un buen marcado de todas las
proteínas, excepto la ARNasa y el inhibidor de tripsina de soja, que no tienen grupos SH
libres. La anhidrasa carbónica parece no contener ningún grupo reactivo. Los marcadores
etiquetados en las figuras de este documento contenían una mezcla de estas dos
preparaciones.
Preparación e incubación de huevos y embriones
Los huevos se lavaron mediante un ajuste repetido a través de agua de mar filtrada con
Milipore y se suspendieron a una densidad final de 15,000-20,000 huevos / ml. y se
incubaron en viales de centelleo de vidrio de 20 ml colocados en platos poco profundos de
agua colocados en cajas de espuma de poliestireno para proporcionar un ambiente de
temperatura constante a 20 ° C; El hielo generalmente se agita suavemente antes del
muestreo. Más del 90% de los óvulos fertilizados presentaron membranas de fertilización y
mostraron escisión normal en todos los experimentos descritos en este documento. De ser
necesario, los viales contenían 2 ml de suspensión de óvulos o embriones al comienzo, y
fueron el índice de escisión.
En el momento de la escisión con cambios en el patrón de incorporación, se tomaron
muestras de los embriones en agua de mar que contenía glutaraldehído al 1%. Las
suspensiones se fotografiaron bajo el microscopio y se contó la fracción de células que se
habían dividido. El índice de escisión que se muestra en la Figura 2 se deriva al determinar
la fracción de células que se dividió entre una muestra y el siguiente.

El esperma de Fertilización y Etiquetado

en Seco se diluyó 100 veces con agua de mar filtrada por Milipore y se dejó reposar
aproximadamente 5 minutos antes de otros 200 minutos. - Doble dilución en la suspensión
de huevos. Se añadió metionina marcada a una concentración final de 1 vol de 5 mCi / ml
de reserva a 200 vol de suspensión - aproximadamente 25 uCi / ml final 1,8 x 10^-8 M. Nos
dimos cuenta de que incluso a esta dilución relativamente alta de la etiqueta agregada, el
fertilizante las muestras que contienen la etiqueta siempre tomaron alrededor de 15 Min
más tiempo para sufrir la primera escisión que los controles sin etiqueta. En un experimento
que no se muestra aquí, intentamos usar ³H-lisina, que bloqueaba completamente la
escisión. Evidentemente, uno debe tener cuidado con la etiqueta en estos experimentos; No
sabemos por qué la demora en la división causada por la metionina se debió al daño por
radiación (a los cuales se sabe que los huevos son altamente susceptibles) o al acetato y
mercaptoetanol en la solución. Una prueba preliminar sugirió que ninguno de estos
compuestos no etiquetados solos disminuyó división en las concentraciones resultantes de
su presencia en la solución marcada tal como se suministró, pero que la combinación podría
ser perjudicial También se debe mencionar que la sobre-cinética de la incorporación de
metionina en el material precipitable con TCA no fue lineal, debido al hecho de que a las 2 h
de incubación, más del 50% de la etiqueta se había incorporado a la proteína. Esto es muy
parecido a la situación reportada por Ecker y Smith (1966) en los huevos de ranas; dichos
huevos dependen de las proteínas de yema almacenadas para los aminoácidos, cuyos
grupos son muy pequeños y se repone constantemente de las tiendas. Esto significa que la
actividad específica de la reserva de metionina disminuye durante el transcurso de los
experimentos. No creemos que esto afecte la interpretación de nuestros resultados, pero
debe tenerse en cuenta.

Preparación y análisis de la muestra

Se extrajeron muestras de 50 ul de los recipientes de incubación con un Gilson Pipetman
cuyas puntas se recortaron aproximadamente 1 mm para agrandar los orificios. Las
muestras se entregaron en tubos que contenían 100 ul de TCA al 25% p / v. Los
precipitados se recogieron por centrifugación, se lavaron dos veces con acetona, se
secaron al vacío y se disolvieron en 30 ul de SDS.
El tampón de muestra en gel. Los geles de acrilamida de 0,8 mm de espesor se procesaron
de acuerdo con las fórmulas de Anderson et al. (1973) Cada carril de 2-3 mm de ancho, se
cargó con 10-15 en comparación con 100-200 embriones. Los geles se tiñeron con 0,5% de
azul de Coomassie R250 en 45% de metanol, 45% de agua, 10% de ácido acético;
Destinado en 20% de metanol, 75% de agua, 5% de ácido acético y secado sobre papel
Whatman 3MM. Los geles dred se autorradiografiaron con Fuji Rx fim. Las autorradiografías
se escanearon con un densitómetro de barrido Transidyne 2955 conectado a través de un
convertidor analógico digital interactivo de 12 bits Microware Inc. a un microordenador Apple
l. Esto permitió la integración de picos mediante un procedimiento formalmente análogo al
corte y pesaje.

Agradecimientos
Los experimentos en este documento se realizaron durante el Curso de Fisiología de 1982
en el Laboratorio de Biología Marina. Gracias a Joel Rosenbaun Lawrence Hobbie, Martha
Reid, Steve Barnard, Juhe Steinberg y, especialmente, al personal permanente de MBL,
que hizo más que nadie para hacer esto posible. Agradecemos a Johin Gerhar, John
Kimartin. Roger Sloboda y David Begg por discusiones cruciales y consejos prácticos. Este
trabajo fue apoyado por la beca de capacitación NIH GM 3113604 para el Curso de
Fisiología. E. T. R. recibió el apoyo de la National Science Foundation PCM 7923046 al Dr.
Joan Ruderman. Los costos de publicación de este artículo se sufragaron en parte mediante
el pago de los cargos de la página. Por lo tanto, este artículo debe estar marcado como
anuncio "de acuerdo con la Sección 1734 del Código de Estados Unidos únicamente para
indicar este hecho.