MÉTODOS DE ECOLOGÍA

MICROBIANA

• INTRODUCCIÓN
La ciencia de la ecología microbiana trata de cómo interaccionan
las comunidades microbianas unas con otras y con su ambiente.
Los componentes principales de la ecología microbiana son la
biodiversidad y la actividad microbiana. Para estudiar la
biodiversidad, los ecólogos microbianos deben ser capaces de
identificar y cuantificar microorganismos directamente en sus
hábitats. Saber esto ayuda a menudo a aislar organismos de
interés, otro objetivo importante de la ecología microbiana. Para
estudiar la actividad microbiana, hay que contar con técnicas
para medir los procesos metabólicos importantes que los
microorganismos realizan en sus hábitats microbianos.
ANÁLISIS DE LAS COMUNIDADES MICROBIANAS BASADOS
EN TÉCNICAS DE CULTIVO
La ecología microbiana utiliza numerosos métodos de cultivo y métodos independientes
del cultivo. Comenzamos considerando las posibilidades del cultivo de los organismos
de la naturaleza en el laboratorio. Existen métodos
clásicos y otros ultratecnológicos para aislar microorganismos a partir de muestras
naturales, y examinamos ambos aquí.

Enriquecimiento y aislamiento
Un modo de estudiar un ecosistema microbiano consiste en aislar de él los
microorganismos y estudiar sus propiedades en cultivos de laboratorio. Luego, a partir
del conocimiento de los organismos presentes y de sus capacidades metabólicas, se
extraen conclusiones referentes a cómo funciona el ecosistema microbiano. El
aislamientotambién es importante porque se obtienen cultivos para estudios
experimentales en el laboratorio y para aplicaciones en los campos de la biotecnología
y la microbiología industrial y ambiental.
El aislamiento requiere separar diferentes organismos de su comunidad microbiana, un
procedimiento llamado enriquecimiento y, luego, obtener los organismos en cultivo
axénico. En un cultivo de enriquecimiento, se establecen un medio y una serie de
condiciones de incubación que sean selectivas para el organismo deseado y
contraselectiva para los no deseados. Los cultivos de enriquecimiento eficaces
reproducen lo mejor posible los recursos y las condiciones de un nicho ecológico
determinado.

Inóculos

Los cultivos de enriquecimiento se establecen sembrando el inóculo en un medio

selectivo e incubándolo en condiciones específicas. De este modo, se pueden aislar
muchos procariotas. Por ejemplo, el gran microbiólogo holandés Martinus Beijerinck,
que puso en práctica la técnica del cultivo de enriquecimiento aisló por primera vez la
bacteria fijadora del N2 Azotobacter mediante una estrategia de enriquecimiento
clásica. Como Azotobacter es un bacteria que crece rápidamente fijando el N2 en el
aire, los medios de enriquecimiento carentes de amoníaco u otras formas de nitrógeno
fijado, e incubados con aire, son muy selectivos para este organismo.

Resultados del cultivo de enriquecimiento

Para tener éxito con los cultivos de enriquecimiento, es importante prestar atención al
medio de cultivo y a las condiciones de incubación. Es decir, tanto los nutrientes como
las condiciones (temperatura, pH, consideraciones osmóticas y similares) se deben
optimizar en un cultivo de enriquecimiento para tener más posibilidades de obtener el
organismo buscado. Algunos cultivos de enriquecimiento no dan nada, quizá porque el
organismo capaz de crecer en las condiciones de enriquecimiento específicas no
estaba en el hábitat (es decir, cada organismo no está en todas partes).
Alternativamente, se podría producir un enriquecimiento negativo incluso aunque el
organismo de interés exista en el hábitat muestreado, porque los nutrientes y las
condiciones para su cultivo en el laboratorio fueron insuficientes para enriquecerlo.

La columna de Winogradsky

Es un ecosistema microbiano artificial que sirve como una fuente a largo plazo de
bacterias para los cultivos de enriquecimiento. Se han utilizadohabitualmente para
aislar bacterias púrpuras y verdes fotótrofas, bacterias reductoras del sulfato y muchos
otros anaerobios Se denomina así por el famoso microbiólogo ruso Sergei Winogradsky
(Información adicional «El legado de Winogradsky», quien la utilizó por primera vez a
finales del siglo xrx para estudiar los microorganismos del suelo. La columna de
Winogradsky se prepara rellenando un cilindro de vidrio aproximadamente hasta la
mitad con lodo rico en sustancias orgánicas, que contenga preferiblemente sulfuro, y
que se ha mezclado con sustratos carbonados. Los sustratos determinarán qué
organismos se enriquecerán, y se evitan los sustratos fermentables (como la glucosa)
que pueden conducir a la formación excesiva de gas. En una columna de Winogradsky
típica se desarrolla una comunidad diversa de organismos. Las algas y cianobacterias
aparecen rápidamente en las capas superiores de la columna de agua y, al producir 0
2, ayudan a mantener esta zona de la columna óxica. Los procesos de descomposición
en el lodo conducen a la producción de ácidos orgánicos, alcoholes y H2, sustratos
adecuados para las bacterias reductoras de sulfato.

Sesgo en el enriquecimiento

En los enriquecimientos típicos se produce un sesgo, que a veces llega a ser muy
grave, en el resultado. Este sesgo normalmente es más profundo en cultivos de
enriquecimiento líquidos donde dominan los organismos que crecen más rápidamente
en las condiciones elegidas.

Aislamiento en cultivo axénico

Los procedimientos de aislamiento habituales incluyen la siembra en placa por estrías,

la siembra en profundidad {agar shake) y la dilución líquida. Para los organismos que
forman colonias sobre placas de agar, la siembra por estrías es rápida y fácil, y el
método de elección; si se escoge una colonia bien aislada y se vuelve a sembrar por
estrías varias veces seguidas, lo normal es obtener un cultivo axénico.

Tubos de dilución en agar y técnica del número más probable (NMP)

Los tubos de dilución son útiles para purificar organismos anaerobios como las
bacterias fotótrofas del azufre y bacterias reductoras de azufre a partir de muestras
tomadas de las columnas de Winogradsky. Un cultivo se purifica mediante diluciones
sucesivas de suspensiones de células en tubos con medio con agar fundido.

Criterios de pureza

Independientemente de los métodos utilizados para purificar un cultivo, una vez que se
ha obtenido un cultivo supuestamente axénico, es esencial verificar su pureza. Hay que
emplear una combinación de:
1) microscopía
2) observación de las características de la colonia en placa o tubos de siembra en
profundidad
3) comprobación del crecimiento del cultivo en otros medios, para lo que resulta
importante utilizar medios en los que se prevé que el organismo deseado crecerá poco
o nada, pero que favorecen el crecimiento de los organismos contaminantes.
En el análisis final, la observación microscópica de un único tipo morfológico de célula
con métodos de tinción uniformes (por ejemplo, en una tinción de Gram), junto a unas
características uniformes de la colonia y ausencia de contaminación en las pruebas de
crecimiento con varios medios de cultivo, es una buena prueba de que el cultivo es
axénico (puro).

Sondas para cultivos axénicos: las pinzas de láser

Las pinzas de láser consisten en un microscopio óptico invertido equipado con un láser
infrarrojo enfocado con precisión y un dispositivo de micromanipulación Las pinzas de
láser son especialmente útiles para aislar bacterias que crecen lentamente, que pueden
ser superadas por otras especies de crecimiento rápido presentes en los cultivos de
enriquecimiento o para organismos presentes en tan poca cantidad que se podrían
perder con los métodos de enriquecimiento basados en diluciones.

ANALISIS DE LAS COMUNIDADES MICROBIANAS BASADOS

EN TÉCNICAS INDEPENDIENTES DE CULTIVO
Las tinciones celulares son necesarias para obtener estos tipos de datos, y detallamos
estos métodos aquí. Los organismos en los ambientes naturales también se pueden
detectar analizando sus genes. La genómica medioambiental es un método para
evaluar el complemento de genes de un hábitat, lo que revela la biodiversidad y las
capacidades metabólicas de la comunidad microbiana al mismo tiempo.

Métodos generales de tinción

Tinción fluorescente con DAPI o naranja de acridina

Los colorantes fluorescentes se pueden utilizar para teñir microorganismos a partir de

casi cualquier hábitat microbiano.
La tinción con DAPI y naranja de acridina es inespecífica: se teñirán todos los
microorganismos de una muestra. Aunque al principio puede parecer una propiedad
deseable, no es necesariamente así. Por ejemplo, el DAPI y el naranja de acridina no
diferencian entre las células vivas y las muertas, ni entre diferentes especies de
microorganismos y, por lo tanto, no se pueden utilizar para evaluar la viabilidad celular
ni para rastrear organismos específicos en un ambiente.

Tinción de viables

Permite diferenciar las células vivas de las muertas, por lo que informa del número de
organismos y su viabilidad al mismo tiempo. La base de la tinción
está relacionada con la integridad de la membrana citoplasmática de una célula, si está
intacta (viva) o no (muerta).
Se han desarrollado procedimientos para el uso de la tinción vivas/muertas en análisis
de células viables de ambientes acuáticos: se filtra una muestra de agua y se tiñe lo
filtrado con la tinción vivas/muertas y se examinan al microscopio. en la microbiología
acuática, se utiliza a menudo la tinción vivas/muertas para medir la viabilidad de las
poblaciones celulares en columnas de agua de lagos u océanos, o en corrientes, ríos y
otros ambientes acuáticos.
Anticuerpos fluorescentes

Los anticuerpos son reactivos biológicos específicos. La gran especificidad de los

anticuerpos contra los constituyentes de la superficie celular se puede explotar para
identificar o rastrear un organismo específico en un hábitat que contiene una mezcla de
muchos organismos, como el suelo o las muestras clínicas.

Proteína fluorescente verde para etiquetar células

Casi cualquier bacteria cultivable se puede insertar el gen que codifica la proteína
llamada la proteína fluorescente verde (GFP: green fluorescent protein). Cuando se
expresa el gen de la GFP, las células emiten fluorescencia verde cuando se observan
al microscopio con luz ultravioleta.
Se ha utilizado ampliamente el gen de la GFP en cultivos de laboratorio de varias
bacterias como un gen indicador. Cuando se fusiona con un operón bajo el control de
una proteína represora específica, se puede utilizar la GFP a modo de ensayo para la
transcripción y estudiar el control transcripcional de los genes
de interés por fluorescencia.

Limitaciones de la microscopía

La microscopía por sí sola no es suficiente para estudiar la diversidad microbiana por

muchas razones. El principal problema lo constituyen las células pequeñas: los
procariotas varían enormemente de tamaño y algunas células están cerca de los límites
de resolución del microscopio óptico.

FISH

Una sonda de ácido nucleico es un oligonucleótido de DNA o RNA complementario en

un gen o RNA de diana. Cuando la sonda y la diana se juntan, se hibridan.se pueden
hacer sondas de ácidos nucleicos fluorescentes uniéndoles colorantes fluorescentes.
Las sondas fluorescentes se pueden utilizar para identificar organismos que contienen
una secuencia de ácido nucleico complementaria a la sonda. Esta técnica se llama
hibridación fluorescente in situ ( F IS H : fluorescent in situ hybridization), y
describiremos diferentes aplicaciones, incluidos los métodos que tienen de objetivo la
filogenia o expresión génica.

Tinción filogenética con FISH

Las tinciones filogenéticas penetran en la célula sin lisarla y se hibridan con el RNA en
los ribosomas. Como los ribosomas están dispersos por la célula en los procariotas,
toda la célula se vuelve fluorescente.
Con la FISH se puede identificar o rastrear un organismo de interés, o un dominio de
interés, en una muestra. Por ejemplo, si se desea determinar el porcentaje de una
población microbiana determinada que pertenecen al dominio Archaea, se podría
utilizar una tinción filogenética específica de las arqueas en combinación con el DAPI
para evaluar el número de células de arqueas y totales, respectivamente, y poder
calcular un porcentaje. Además, para la ecología microbiana, la FISH es un
herramienta importante en la industria alimentaria y en el diagnóstico clínico para
detectar patógenos específicos al microscopio.

ISRT-FISH y CARD-FISH

En este caso la diana, el mRNA, es mucho menos abundante que el rRNA en los
ribosomas de una célula, no se pueden aplicar las técnicas FISH estándares, sino que
hay que amplificar la diana (el mRNA) o laseñal (fluorescencia) para que sea aplicable
en los estudios de expresión génica. Un método que amplifica la diana se llama
transcripción inversa in situ (IRST: in situ reverse transcription)- FISH. Este método
utiliza una sonda de DNA para atrapar un mRNA específico producido por células en
una muestra natural.
La ISRT-FISH se utiliza para explorar factores que controlan la expresión génica en
poblaciones naturales de microorganismos y para observar cómo las perturbaciones
ambientales en un ambiente afecta la transcripción de determinados genes. En
combinación con los métodos de tinción filogenéticos, también se puede utilizar la
ISRT-FISH para detectar qué grupos de organismos en
un hábitat son metabólicamente activos basándose en la suposición de que las células
que transcriben determinados genes metabólicos están utilizando las enzimas que
codifica el mRNA. En tal estudio, la ISRT-FISH se utilizaría para evaluar la expresión
génica, mientras que la FISH se utilizaría para revelar la filogenia de las células
metabólicamente activas.
En la CARD-FISH, la sonda del ácido nucleico específico contiene una molécula de la
enzima peroxidasa conjugada a éste en vez de un colorante fluorescente.la CARD-
FISH es útil para los estudios filogenéticos de procariotas que crecen muy lentamente,
por ejemplo, los organismos que habitan los océanos abiertos donde las temperaturas
frías y las bajas concentraciones de nutrientes se combinan para limitar la velocidad de
crecimiento.

Relacionar genes específicos con organismos específicos mediante PCR

A menudo, los genes específicos están en organismos específicos. Por lo tanto, la

detección de un gen específinismo específico que contiene este gen está presente. Las
principales técnicas empleadas en esta clase de análisis de la comunidad microbiana
son la reacción de la cadena de la polimerasa (PCR: polymerase chain reaction), la
electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente (DGGE: denaturing gradient gel
electrophoresis), o clonación molecular y secuenciación y análisis del DNA, así como
una serie de métodos relacionados.

PCR y análisis de la comunidad microbiana

Las principales etapas en la PCR son:

1) dos cebadores de ácido nucleico se hibridan a una secuencia
complementaria en un gen diana.
2) la DNA-polimerasa copia el gen diana.
3) se sintetizan numerosas copias del gen diana mediante ciclos sucesivos de
separación de las hebras complementarias, hibridación de los cebadores y nueva
síntesis.

¿Qué genes se deben utilizar como diana?

Como los genes que codifican el RNA ribosómico de subunidad menor son
filogenéticamente informativos y las técnicas para su análisis están bien desarrolladas,
se utilizan ampliamente en los estudios de biodiversidad
molecular. Alternativamente, también pueden servir de diana los genes que codifican
proteínas particulares del metabolismo de un organismo específico, o grupo de
organismos relacionados. En el típico experimento de análisis de una comunidad se
aísla todo el DNA de un hábitat microbiano.

Electroforesis en gel en gradiente desnaturalizante: separación de genes muy

similares

se puede utilizar la electroforesis en gel en gradiente desnaturalizante (DGGE), un

método que separa genes del mismo tamaño que se diferencian en su perfil de fusión
(desnaturalización) debido a las diferencias en la secuencia de bases. Una vez que se
ha realizado la DGGE, se escinden las bandas individuales y se secuencian. Con el
rRNA 16S como gen diana, por ejemplo, el patrón de DGGE revela inmediatamente el
número de filotipos (genes diferentes de rRNA 16S) presentes en un hábitat. Después
de secuenciar cada banda de DGGE, se puede determinar el número real de especies
presente en la comunidad mediante análisis filogenéticos.

T-RFLP

Otro método para el análisis rápido de la comunidad microbiana es el polimorfismo en

la longitud de los fragmentos de restricción terminales (T-RFLP: terminal restriction
fragment length polymorphism). En este método, se amplifica por PCR un gen de diana
(normalmente genes de mRNA) del DNA de una comunidad utilizando un conjunto de
cebadores en el que uno de los cebadores está marcado en el extremo con un
colorante fluorescente.
La DGGE y el T-RFLP miden la diversidad de un único gen, pero de diferentes
maneras. Mientras que el patrón de las bandas sobre un gel de DGGE refleja el
número de variaciones de una secuencia del mismo tamaño en un único gen, la
distribución de las bandas sobre un gel de T-RFLP refleja la variabilidad de un gen
único medida mediante diferencias en los sitios de corte de las enzimas de restricción,
que se deben en última instancia a variaciones en la secuencia del DNA.

Resultados de los análisis filogenéticos de la PCR

Estos resultados ponen de manifiesto que nuestro conocimiento de la diversidad

microbiana a partir de los cultivos de enriquecimiento es muy incompleto y que el sesgo
de enriquecimiento es probablemente un problema grave en estudios de biodiversidad
dependientes del cultivo. Los ecólogos microbianos estiman que, en la actualidad, en
los cultivos de laboratorio se refleja menos del 0,5% de la diversidad microbiana
revelada por los análisis moleculares de la comunidad.

Filochips

Los filochips se construyen fijando rRNA o sondas de oligonucleótidos específicas del

rRNA, a la superficie del chip en una distribución conocida. Cada filochip se puede
hacer tan específico o amplio como requiera el estudio, y se pueden añadir varios
cientos de sondas diferentes a un único filochip. Por ejemplo, si el objetivo era evaluar
la diversidad de las bacterias reductoras del sulfato en un ambiente con sulfuras, como
un tapete microbiano en un único experimento, los oligonucleótidos complementarios a
secuencias específicas de los genes del rRNA 16S de todas las bacterias reductoras
de sulfato conocidas (unas 100 especies) se ordenarían en una disposición conocida
sobre un filochip.
Los filochips eluden muchas de las etapas largas, como PCR, DGGE, clonación y
secuenciación, que son parte de los análisis moleculares de la comunidad microbiana.
Por lo tanto, el filochip es otra herramienta importante para la evaluación independiente
de cultivo de la biodiversidad microbiana.

Genómica medioambiental

Un enfoque más amplio que el estudio molecular de las comunidades microbianas es la

genómica medioambiental, también llamada metagenómica.
El objetivo de la genómica medioambiental no es generar secuencias del genoma
completas y acabadas, como se ha hecho para muchos microorganismos en cultivo,
sino detectar tantos genes como sea posible que codifiquen proteínas reconocibles y
luego, si es posible, determinar el(los) grupo(s) filogenético(s) al que pertenece(n). Los
análisis de la comunidad microbiana normalmente se centran sobre la diversidad de un
único gen.En cambio, en la genómica medioambiental, teóricamente se pueden
muestrear todos los genes de la comunidad microbiana, lo que puede revelar
características de una comunidad microbiana que se pueden pasar por alto en los
enfoques basados en un único gen.

MEDICIÓN DE LAS ACTIVIDADES MICROBIANAS EN LA

NATURALEZA

Análisis químicos, métodos radioisotópicos y microelectrodos