Curva de crecimiento de Escherichia Coli: cuantificación de microorganismos.

Escherichia Coli growth curve: cuantification of microorganisms.

JUAN PABLO ARCINIEGAS1 (164003203), LINA SÁNCHEZ2 (164003240), SERGIO

AGUIRRE3 (164003201), JHONNY PERDOMO4 (164003225)
1
Universidad de los Llanos, Facultad de Ciencias Básicas e Ingenierías.
2
Universidad de los Llanos, Facultad de Ciencias Básicas e Ingenierías.
3
Universidad de los Llanos, Facultad de Ciencias Básicas e Ingenierías.
4
Universidad de los Llanos, Facultad de Ciencias Básicas e Ingenierías.

Presentado el 23 de abril del 2014.

Resumen.

Existen formas de realizar estudios cuantitativos de las colonias bacterianas de forma indirecta y
directa. En el presente documento se exponen los resultados de la cuantificación de
microorganismos de una colonia de E. coli por turbidimetría y por recuento directo. Partiendo de
una hora inicial, se midió la absorbancia en el espectrofotómetro de la muestra y se realizó el
conteo en la cámara de Neubauer (tomando 10 cuadros) comenzando 2,75 horas después, y
repitiendo cada media hora. Debido a que se empezó a hacer la cuantificación tarde, no se pudo
certificar fase de latencia, ni la duración de la fase exponencial. No obstante, se determinó por
ambos que la colonia se encontraba en la fase estacionaria. Las discrepancias entre resultados
correspondieron a errores de observación, principalmente la dificultad de diferenciar células vivas
y muertas por el método de recuento directo.

Palabras clave: E. coli, recuento directo, tubidimetría, fase estacionaria, cámara de Neubauer.

Abstract.

There are several ways to make cuantitative studies of bacteria colonias by indirect and direct
methods. In this paper the results of a cuantitative study of the microorganisms in an E. coli
colony by turbidimetry and direct counting will be exposed. Taking an inicial time, the absorbance
was measured in the spectrophotomer and a the number of cells was determined by counting in a
Neubauer chamber (taking 10 squares) starting 2,75 hours after, and repeating each 30 minutes.
Due the counting was started late, it could not certifiacte the lag phase and the exponencial phase
duration neither. However, is was determined by both methods the colony was in stationary
phase. The discrepancies between the results correspond to observation mistakes, mainly the
difficulty for differentiate between living cells and dead cells by direct counting.

Keywords: E. coli, direct counting, tubirdimetry, stationary phase, Neubauer chamber.

Introducción.

La cuantificación de microorganismos se puede realizar de forma directa o indirecta partiendo de

una muestra. Los métodos directos consisten en determinar el número de microorganismos
presentes a partir de un conteo individual de las células presentes en un espacio determinado
para estimar el número de microorganismos en la muestra. Los métodos indirectos consisten en
medir una característica de la muestra que permita determinar la densidad de microorganismos
en ella, como la turbidez. (Madigan et al, 2003).

El crecimiento de poblaciones microbianas puede determinarse mediante la medida de la masa

celular total, que generalmente es proporcional al número de células. El recuento directo de
bacterias al microscopio es una técnica directa usada para determinar el número de células por
unidad de volumen o de peso presentes en materiales tales como cultivos líquidos, leche,
alimentos y otros. Para esto se usan las cámaras de recuento como Neubauer, este método es
rápido y preciso pero no es posible distinguir las células viables de las muertas. El
hematocitómetro o cámara de Neubauer se trata de una capa gruesa de cristal con forma de
portaobjetos que presenta una cuadrícula grabada, la retícula completa mide 3 mm x 3 mm de
lado. Subdividida a su vez en 9 cuadros de 1mm de lado cada uno; estos cuadrados son destinados
al recuento de células, en donde se cuenta el número de células en 10 cuadros y luego se halla un
promedio (Rodríguez et al, 2005).

Un método indirecto muy común es la turbidimetría. Se usa para la determinación de

aminoácidos, proteínas y vitaminas, y también para el control de crecimiento bacteriano en un
medio de cultivo líquido. (Oslen, 1990). Este método se basa en la medición de la turbidez, siendo
una muestra más turbia a medida que cuenta con una mayor cantidad de células que dispersan la
luz que atraviesa la suspensión. Esta magnitud puede medirse con un especrofotómetro, que hace
pasar la luz a través de las suspensiones celulares y detectan la cantidad de luz emergente no
dispersada. (Madigan et al, 2003).

Los resultados de los métodos descritos varían de acuerdo a la fase de crecimiento en la que se
encuentra la colonia. Dichas fases son: la fase de latencia, en donde la bacteria es inoculada en un
nuevo medio y el crecimiento no comienza inmediatamente, se necesita que los microorganismos
produzcan las enzimas necesarias para crecer en el nuevo medio; la fase exponencial, donde se
registra el mayor crecimiento bacteriano, pero se ve afectada por condiciones del medio; la fase
estacionaria, donde el crecimiento de la colonia llega a su límite ya sea porque un nutriente
esencial para las bacterias se agota, se acumulan sustancias tóxicas en el medio, no queda; y la
fase de muerte, donde la población bacteriana empieza a reducirse. (Universidad de Caracas).

Metodología.

Materiales:

-Gotero Pasteur.

-Tubos de ensayo.
-Cámara de Neubauer.

Equipos:

-Espectrofotómetro.

-Microscopio óptico.

Métodos:

-Se tomaron diferentes muestras de una muestra original de cultivo de E. coli en 5 diferentes
tubos de ensayo a distintos tiempos.

-De cada muestra se midió la absorbancia con el espectrofotómetro.

-Se procedió a realizar el conteo de las bacterias usando para ello la cámara de Neubauer y el
microscopio óptico. Se realizó el conteo en 10 cuadros por cada muestra tomada para calcular la
cantidad de microorganismos por mL.

Discusión.

La tabla 1 resume los resultados de la medición de la densidad óptica (absorbancia) y el número de

células presentes en una muestra conforme pasaba el tiempo. Para determinar el número de
microorganismos por mililitro se aplicó:

𝑀𝑖𝑐𝑟𝑜𝑜𝑟𝑔𝑎𝑛𝑖𝑠𝑚𝑜𝑠 𝑝𝑜𝑟 𝑚𝐿
1
= ( ) 𝑥𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑑𝑎𝑠 𝑥 𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛
𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑜

Donde las dimensiones del cuadro fueron todas de 0,1 cm, por lo que el volumen es de 0,0001 mL
y se tomó una disolución no diluida, siendo este factor 100.

Tabla 1. Densidad óptica y número de células de E. coli desde su inoculación.

Hora Absorbancia Número de células Número de

por cuadro microorganismos por
mililitro o gramo de
muestra original
8:00 am 0 0 0
10:45 am 0,157 A 24 240000
11:15 am 0,140 A 20 200000
11:45 am 0,159 A 27 270000
12:15 pm 0,141 A 24 240000
12:45 pm 0,172 A 20 200000

Las gráficas 1 y 2 muestran el modo en el que variaron las dos magnitudes medidas con el pasar
del tiempo:
Gráfica 1. Variación del número de células de E. coli por mililitro en el tiempo.

Número de microorganismos por mililitro o gramo de muestra

original
300000

250000

200000
Número de
150000 microorganismos por
mililitro o gramo de
100000
muestra original
50000

0
0 1 2 3 4 5

Gráfica 2. Variación de la densidad óptica de la muestra en el tiempo.

Absorbancia
0.2
0.18
0.16
0.14
0.12
0.1
Absorbancia
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0 1 2 3 4 5

Partiendo de la gráfica 1 se observa que el crecimiento no es exponencial. La organización de los

puntos puede aproximarse más a una línea recta. De acuerdo a esto, se deduce que la fase de
crecimiento en la que se encontraba la colonia de E. coli al empezar las observaciones es
estacionara ya que se evidencia crecimiento aún, pero de forma relativamente constante. Esto
corresponde a lo reportado por en el artículo “La fase estacionaria en E. Coli” (Ramírez Santos et
al., 2005), donde las colonias de esta bacteria entran en fase estacionaria a las 3 horas.

Comparando las gráficas 1 y 2 se observa que la relación entre la absorbancia y el número de

bacterias es directamente proporcional. Como la absorbancia mide la concentración de algún
agente orgánico en una muestra, es coherente que mientras más bacterias, mayor será la
absorbancia reportada. Aún así, la última medición hay una diferencia considerable ya que la
absorbancia aumenta, pero el número de bacterias reportado es menor. La causa más probable
para esta discrepancia es un error en el recuento directo dado que tiene un alcance limitado: se
cometen errores al no poderse distinguir fácilmente entre células vivas o muertas.

En lo que respecta al número máximo número de células, es de esperarse que pueda estimarse en
la fase estacionaria dado que el crecimiento tiende a detenerse bien sea por el agotamiento de un
nutriente esencial y/o el aumento de material de desecho en el cultivo. Sabiendo que el cultivo
inicial se realizó partiendo de una colonia cuya absorbancia es de 0,256, en condiciones propicias
la colonia debería llegar a dicho valor. Pero, la máxima absorbancia reportada fue de 0,172, por lo
que el número de células por mL no alcanzó su tope. Posiblemente surgió un cambio de
condiciones al inocularlo al nuevo medio, bien sea por una variación en la composición química de
este (nutrientes, pH), o por cambios de temperatura.

Con respecto a las otras fases, en “La fase estacionaria en E. Coli” se establece una fase de latencia
que dura aproximadamente una hora, y una exponencial de dos hojas. En este estudio no se pudo
determinar la presencia y duración de la fase de latencia, ni la duración de la fase exponencial. Así
mismo, como esta última no se pudo registrar, el cálculo de la tasa específica de crecimiento y del
tiempo de duplicación no se efectuó ya que se hacen con base a una gráfica a escala
semilogarítmica de la fase exponencial.

Cuestionario.

1 Explique en qué consisten los métodos directos e indirectos de cuantificación de

microorganismos.

Los métodos para el seguimiento de la evolución de un cultivo microbiano pueden clasificarse

en directos e indirectos. Los métodos directos se basan en la medida de la evolución del número
de células vivas (técnicas de plaqueo) o del número de partículas (técnicas microscópicas y de
contadores de partículas). Los métodos indirectos se basan en la medida de algún parámetro del
cultivo que nos permite deducir información sobre la evolución del número de microorganismos.
La elección de un método de seguimiento del cultivo en concreto depende de las características
del cultivo y del proceso.

Entre los métodos directos e indirectos se pueden destacar:

DIRECTOS

- Las técnicas de recuento microscópico de células sin fijar usando microscopía de contraste de
fase. Para ello se cuenta el número de partículas en un volumen determinado usando una célula
de Petroff-Hauser o de Neubauer (portaobjetos modificado en el que una rejilla nos permite
conocer el volumen que estamos observando). El procedimiento es rápido y sencillo; pero no
permite distinguir células vivas inmóviles de células muertas. (Tortora et al., 2007).
- Contaje de partículas utilizando sistemas automáticos del tipo Coulter Counter. La operación de
estos sistemas es sencilla y permite rápidamente determinar el número de partículas presentes
en una suspensión y la distribución de sus tamaños. El problema es que no distingue entre células
vivas y muertas ni entre células y agregados de material insoluble presente en la suspensión del
cultivo. (Tortora et al., 2007).

- Medida de peso seco. El sistema consiste en la filtración del cultivo a través de una membrana
que retenga las células y su posterior desecación hasta peso constante. El sistema, obviamente, no
diferencia células vivas de muertas y su sensibilidad es limitada. (Tortora et al., 2007).

INDIRECTOS

- Técnicas de recuento en placa, basadas en colocar en un medio de cultivo adecuado un volumen

determinado de muestra. Cada una de las células aisladas dará lugar, después de la incubación
correspondiente, a una colonia de forma que el número de estas nos permitirá estimar el número
de células presentes en la muestra plaqueada (sembrada). El sistema es fácil de utilizar en el caso
de células aisladas (no sirve en el caso de hongos filamentosos, por ejemplo). Puede realizarse
sembrando en superficie (extendiendo un volumen dado de muestra sobre el medio de cultivo
sólido) o en profundidad (mezclando un volumen dado de muestra con el medio de cultivo antes
que solidifique). Esta última opción permite realizar el recuento de microorganismos
microaerófilos que no crecen bien en la superficie de las placas de cultivo. Para que el sistema de
recuento en placa tenga validez estadística, es necesario contar entre 30 y 300 colonias con objeto
de disminuir el error de la medida. (Universidad de Granada, 2007).

- Técnicas turbidométricas basadas en la medida de la turbidez de los medios de cultivo en los que
crecen microorganismos unicelulares. La turbidez es proporcional a la masa de las partículas en
suspensión (células) y su medida nos permite estimarla. Para ello se utiliza un equipo similar al que
se emplea en la medida de la absorbancia de luz por disoluciones coloreadas (colorímetro, por
ejemplo). Las medidas se hacen a una longitud de onda adecuada (normalmente en el entorno de
550 nm) y los valores se suelen denominar valores de densidad óptica. La limitación de este
sistema, por otra parte muy sencillo, es que no distingue células vivas de muerta y que
normalmente no es capaz de detectar densidades celulares menores a 10.000 células por mililitro.
(Universidad de Granada, 2007).

- Medida del ATP. Es una medida relativamente sencilla basada en la emisión de luz por la
luciferasa de luciérnaga (Photimus pyralis) en presencia de O2 y de ATP. De esta forma se puede
medir la concentración de ATP en un volumen dado de cultivo. Esta medida es interesante porque
la concentración de ATP decae rápidamente en las células muertas, de forma que esa medida
indirecta detecta únicamente a las células vivas. (Universidad de Granada, 2007).

2 ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de los métodos de cuantificación de microorganismos

empleados en la práctica?

Ventajas.

La turbidimetría tiene una gran variedad de aplicaciones y permite trabajar con muestras
gaseosas, liquidas e incluso con sólidos transparentes. La formación de precipitados difíciles de
filtrar, como por ejemplo los gelatinosos o los de tamaño de partícula muy pequeño, suelen
proporcionar suspensiones ideales para la aplicación de técnicas basadas en la dispersión de la luz
que sustituye a las técnicas gravimétricas. (Hernández et al., 2002)

Este tipo de aplicaciones son frecuentes en laboratorios analíticos, laboratorios clínicos y en

plantas de procesos. Uno de los principales campos de aplicación reside en estudios de polución
de aire y agua, donde dicha técnica se usa para determinar la transparencia y controlar el
tratamiento de aguas potables, efluentes de plantas de tratamiento de aguas y otros tipos de
aguas ambientales. Las medidas de dispersión de la luz se utilizan también para determinar la
concentración de humos, polvo, niebla, aerosoles, etc. A pesar de que el término de turbidimetría
suele restringirse a aquellas aplicaciones en las que se mide la concentración de partículas en
suspensión existen también otros tipos de aplicaciones basados en las medidas de dispersión de la
luz. Entre ellas podemos citar la determinación de la forma y tamaño de las partículas así como la
de los pesos, moleculares (especialmente en el caso de polímeros). (Hernández et al., 2002)

Desventajas.

No es un método útil para medir la contaminación de líquidos por un número relativamente

pequeño de bacterias. Por otra parte teniendo en cuenta que en soluciones diluidas, la
absorbancia es directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamaño celular
del microorganismo en esta técnica se encuentran absorbancias muy se encuentran absorbancias
muy diferentes por partícula o por UFC (Unidad Formadora de Colonia) cuando los tamaños de las
células bacterianas son diferentes. (Hernández et al., 2002).

3. Explique en qué consiste la curva de crecimiento y que pasa en cada etapa.

La curva de crecimiento, es la gráfica que describe el cuenteo de células en un medio de cultivo

típico, en la que se pueden diferenciar varias fases. Fase de latencia, después de tener el inoculo
de microorganismos a cultivar, cuando son depositados en el medio no se reproducen de
inmediato, debido a que el medio inicial pudo ser diferente de condiciones químicas y físicas,
entonces a las células les toma un poco de tiempo adaptarse y de retomar las funciones
metabólicas. (Madigan et al, 2003).

En la Fase exponencial, cada célula del medio de cultivo se divide en dos células hijas y estas en
otras dos, lo que hace que el crecimiento sea una función exponencial. En esta fase, influye la
presencia de condiciones como lo son la temperatura, presencia de aminoácidos y otros
nutrientes en el medio, que pueden aumentar o disminuir la reproducción celular. (Madigan et al,
2003).

Fase estacionaria, en esta podemos hablar de un constante número de células, dada debido a un
componente límite esencial para la reproducción, o por la acumulación de materiales de desecho
de la población, que es un factor importante junto con la falta de nutrientes y condiciones
ambientales diferentes, para que se dé la fase de muerte, en donde la población empieza a
decaer. Gráficamente, esta fase es exponencial, pero no se comporta como la fase exponencial,
por que varía el tiempo de muerte de las células. (Madigan et al, 2003).

Bibliografía.

MADIGAN, Michael T et al. Brock, biología de los microorganismos. Décima edición. Editorial
Pearson. 2003.

OSLEN, Eugene D. Métodos ópticos de análisis. Editorial Reverté. 1990.

RODRÍGUEZ CAVANILLI, Evelyn et al. Bacteriología general, principios y prácticas de

laboratorio. Editorial Universidad de Costa Rica. 2005.

Universidad de Caracas. Reproducción y crecimiento micobiano. Dispinible en:

http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/08_Tema_6_crecimie
nto.pdf

RAMÍREZ SANTOS, Jesús et al. La fase estacionaria en la bacteria Escherichia Coli. Revista
latinoamericana de Microbiología. 2005. Disponible en:
http://www.medigraphic.com/pdfs/lamicro/mi-2005/mi05-3_4f.pdf

Universidad de Granada. Ciclo celular y crecimiento. 2007. Disponible en:

http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/12crecimiento.htm#_Toc58934319

L. Hernández, C. González, Introducción al Análisis Instrumental. Editorial: ArielCiencia (2002)

TORTORA, Gerard J et al. Introducción a la microbiología. Novena edición. 2007.