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Cómo hacer una tinción de Gram

La tinción de Gram es un procedimiento rápido que se usa para buscar la


presencia de bacterias en muestras de tejidos y caracterizarlas como Gram
positivas o Gram negativas en base a las propiedades químicas y físicas de
sus paredes celulares.[1] La tinción de Gram casi siempre debe realizarse como
el primer paso en el diagnóstico de una infección bacteriana.

La tinción de Gram se llama así por el científico danés Hans Christian


Gram (1853 – 1938), quien desarrolló la técnica en 1882 y la publicó en 1884
como una técnica para distinguir entre dos tipos de bacterias con síntomas
clínicos similares: las bacterias Streptococcus pneumoniae (también conocida
como neumococo) y Klebsiella pneumoniae.[2]

Parte 1
Preparar el portaobjetos
1.
1
Prepárate para el trabajo de laboratorio. Colócate guantes y amárrate el
cabello si lo tienes largo para evitar contaminar la muestra de bacteria que
vayas a analizar. Desinfecta un espacio de trabajo debajo de la campana
extractora o en otra área bien ventilada. Antes de comenzar, revisa que el
mechero Bunsen y el microscopio estén operativos.
2.
2
Esteriliza un portaobjetos de vidrio para microscopio. Si el portaobjetos
está sucio, lávalo con agua jabonosa para eliminar la grasa y la suciedad.
Desinféctalo con etanol, limpiador de vidrios o el método que recomiende tu
laboratorio.
3.
3
Coloca la muestra en el portaobjetos. Puedes usar el método de la tinción de
Gram para ayudar a identificar las bacterias presentes en muestras médicas o
en cultivos de bacterias en una placa de Petri. Para que la tinción de Gram sea
útil, coloca una capa delgada de la muestra sobre el portaobjetos. Es
recomendable una muestra que tenga menos de 24 horas, ya que las bacterias
más antiguas pueden tener paredes celulares dañadas que responderán de
forma menos predecible a la tinción de Gram.[3]
 Si vas a usar una muestra de tejido, coloca de 1 a 2 gotas de la muestra en el
portaobjetos de vidrio. Extiéndela uniformemente sobre el portaobjetos para
formar una mancha delgada usando el borde de un segundo portaobjetos de
vidrio esterilizado. Deja que se seque con el aire antes de continuar.
 Si vas a tomar bacterias de una placa de Petri, esteriliza un asa bacteriológica
en la llama de un mechero Bunsen hasta que brille, luego deja que se enfríe.
Úsala para colocar una gota de agua esterilizada sobre el portaobjetos y luego
esteriliza y enfría el asa otra vez antes de transferir una pequeña muestra de
bacteria al portaobjetos y revolverla suavemente en el agua.[4]
 Las bacterias en un medio de cultivo deben mezclarse en un agitador de vórtice
y luego colocarse en el portaobjetos con un asa bacteriológica, como se indica
anteriormente, pero sin agregar el agua adicional.[5]
 Si tienes una muestra en un hisopo, pásalo ligeramente por encima del
portaobjetos.[6]
4.

4
Fija la muestra por calor. El calor fijará las bacterias al portaobjetos de forma
que no se enjuaguen tan fácilmente durante la tinción. Pasa rápidamente el
portaobjetos dos o tres veces por la llama de un mechero Bunsen o caliéntalo
sobre un calentador de portaobjetos eléctrico. No lo sobrecalientes o las
muestras podrían distorsionarse. Si vas a usar un mechero Bunsen, la llama
debe ser un cono pequeño y azul, no uno alto y anaranjado.[7]
 Alternativamente, la muestra puede fijarse con metanol, agregando 1 o 2 gotas
sobre la mancha seca, drenando el exceso de metanol y dejando que se seque
con el aire. Este método minimiza el daño a las células huésped, dándoles un
fondo más limpio.
5.

5
Posiciona el portaobjetos en una bandeja para tinción. Una bandeja para
tinción es una bandeja poco profunda de metal, vidrio o plástico con una
pequeña malla o soporte de alambre a lo largo de la parte superior. Coloca el
portaobjetos sobre este soporte de forma que los líquidos que vayas a usar
puedan drenarse sobre la bandeja.
 Si no tienes una bandeja para tinción, el portaobjetos puede colocarse
directamente sobre una cubeta de plástico para hielo.[8]

Parte 2
Realizar la tinción de Gram
1.

1
Empapa la muestra con cristal violeta. Usa una pipeta para empapar la
muestra de la bacteria con varias gotas de tinte cristal violeta, a veces llamado
violeta de genciana. Espera de 30 a 60 segundos. En una solución acuosa, el
cristal violeta (CV) se disocia en CV+ e iones de cloruro (Cl-).
Estos iones penetran a través de la pared celular y la membrana celular de
células tanto Gram positivas como Gram negativas. El ion CV+ interactúa con
los componentes con carga negativa de las células bacterianas para
mancharlas de violeta.
 Muchos laboratorios usan el cristal violeta de "Hucker", el cual agrega oxalato
de amonio para evitar la precipitación.[9]
2.

2
Enjuaga suavemente el cristal violeta. Inclina el portaobjetos y usa un matraz
de lavado para rociar un pequeño chorro de agua destilada o de grifo sobre la
parte superior del portaobjetos. El agua debería escurrirse sobre la superficie
de la mancha pero no estar apuntada directamente a ella. [10] No enjuagues
excesivamente, lo cual puede quitar la tinción de las bacterias Gram positivas.
3.

3
Empapa la mancha con yodo y luego enjuaga. Usa una pipeta para cubrir la
mancha con yodo. Déjala reposar por lo menos por 60 segundos, luego
enjuágala cuidadosamente con el mismo método.[11] El yodo, en la forma de
iones con carga negativa, interactúa con los iones CV+ para formar grandes
compuestos de cristal violeta y yodo (compuestos CV-I) dentro de las capas
interiores y exteriores de la célula. Esto atrapa el color del cristal violeta en la
célula, en el lugar en el que la haya teñido.
 El yodo es corrosivo. Evita su inhalación, ingestión o contacto con la piel.
4.
4
Agrega un decolorante y luego enjuaga rápidamente. Para este paso
crítico, se usa normalmente una mezcla de acetona y etanol en una proporción
de 1:1. La realización de este paso debe calcularse cuidadosamente. Sujeta el
portaobjetos en ángulo, luego agrega el decolorante hasta que nada del color
violeta sea visible en la escorrentía. Esto normalmente toma menos de 10
segundos o incluso menos tiempo si el decolorante contiene una alta
concentración de acetona. Detente inmediatamente o el decolorante retirará la
tinción de cristal violeta de células tanto Gram positivas como Gram negativas y
la tinción tendrá que repetirse. Enjuaga inmediatamente el exceso de
decolorante usando la técnica mencionada anteriormente.
 Puede usarse acetona pura (95%+) en su lugar.[12] Mientras más acetona haya,
el decolorante trabajará más rápido, lo que requerirá un cálculo más preciso del
tiempo.
 Si estás teniendo problemas para calcular la realización de este paso,
considera agregar el decolorante gota a gota.[13]
5.

5
Empapa la mancha con un colorante secundario y luego enjuaga. Se usa
un colorante secundario, normalmente safranina o fucsina, para agregar un
contraste adicional entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas,
tiñendo las bacterias decoloradas (Gram negativas) de rosado o rojo. [14][15] Deja
el colorante en la muestra por lo menos por 45 segundos, luego enjuágalo. [16]
 La fucsina teñirá muchas bacterias Gram negativas de forma más intensa,
como las especies Haemophilus y Legionella.[17] Esto puede convertirla en una
mejor opción para principiantes.
6.

6
Seca el portaobjetos. Puedes dejar que el portaobjetos se seque con el aire o
secarlo usando papel absorbente que se venda para este propósito.[18] La
tinción de Gram está terminada.

Parte 3
Examinar el resultado
1.
1
Prepara el microscopio óptico. Coloca el portaobjetos bajo el microscopio
óptico. Las bacterias varían en gran medida en tamaño, así que la
magnificación total requerida variará de 400x a 1000x.[19] En el extremo más
alto de estas magnificaciones, se recomienda usar una lente objetiva con aceite
de inmersión para una mayor claridad. Coloca una gota de aceite de inmersión
en el portaobjetos, evitando el movimiento durante la aplicación para evitar las
burbujas.[20] Mueve el revólver del microscopio de forma que la lente objetiva se
posicione en su lugar con un clic, tocando el aceite.
 El aceite de inmersión solo puede usarse en lentes diseñadas especialmente,
no en una lente "seca".
2.
2
Identifica las bacterias Gram positivas y Gram negativas. Examina el
portaobjetos bajo el microscopio óptico. Las bacterias Gram positivas se verán
violetas debido al cristal violeta atrapado en sus gruesas paredes celulares. Las
bacterias Gram negativas se verán rosadas o rojas, ya que el violeta se
enjuagó a través de las delgadas paredes celulares y luego ingresó a ellas el
colorante secundario rosado.
 Si la muestra es demasiado gruesa, puedes obtener falsos positivos. Tiñe una
nueva muestra si todos tus resultados son Gram positivos, para asegurarte de
que el resultado sea correcto.
 Si el decolorante se escurrió por mucho tiempo, puedes obtener falsos
negativos. Tiñe una nueva muestra si todos tus resultados son Gram negativos
para revisar los resultados dos veces.
3.

3
Busca imágenes referenciales. Si no estás seguro de lo que es una bacteria,
busca en colecciones de imágenes referenciales clasificadas por forma y
resultado de la tinción de Gram. Puedes encontrar bases de datos en línea en
la Base de Datos Nacional de Patógenos Microbianos de los EE.UU., Bacterias
en fotos y muchos otros sitios. Para facilitar más la identificación, los ejemplos
comunes o importantes para el diagnóstico están clasificados a continuación
por estado de Gram y forma.
4.
4
Identifica bacterias Gram positivas por su forma. Las bacterias se clasifican
más a fondo por su forma bajo el microscopio, más comúnmente como cocos
(esféricas) o varas (cilíndricas). Estas son algunas bacterias Gram positivas
(teñidas de violeta) comunes clasificadas por forma:
 Los cocos Gram positivos generalmente son ya sea estafilococos (que
significa cocos en grupos) o estreptococos (que significa cocos en cadenas).
 Las varas Gram positivas incluyen los bacilos y las
bacterias Clostridium, Corynebacterium y Listeria. Las varas de la
especie Actinomyces a menudo tienen ramas o filamentos.[21]
5.
5
Identifica bacterias Gram negativas. Las bacterias Gram negativas (teñidas
de rosado) a menudo se clasifican en tres grupos. Los cocos son las bacterias
esféricas, las varas son las bacterias largas y delgadas, y las varas cocoides
están en un punto intermedio.
 Los cocos Gram negativos son más comúnmente la especie Neisseria.
 Las varas Gram negativas incluyen las bacterias E.
coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigell
a, Pseudomonas y muchas otras. La bacteria Vibrio cholerae puede aparecer
como varas normales o varas curvas.[22]
 Las varas Gram negativas "cocoides" (o "cocobacilos") incluyen
la Bordetella, Brucella, Haemophilus y Pasteurella.
6.
6
Evalúa los resultados mixtos. Algunas bacterias son difíciles de teñir con
precisión debido a la fragilidad de sus paredes celulares o a cuán cerosas
sean. Pueden tener una mezcla de una tinción violeta o rosada en la misma
célula o entre diferentes células en la misma muestra. Cualquier muestra de
bacteria que tenga más de 24 horas puede tener este problema, pero algunas
especies son difíciles de teñir a cualquier edad. Pueden requerir pruebas más
especializadas para reducir el número de posibilidades para su identificación,
como la tinción de Ziehl-Neelsen, la observación del crecimiento de cultivos, el
agar TSI o pruebas genéticas.[23]
 Las
especies Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium y Propio
nibacterium se consideran bacterias Gram positivas, pero a menudo aparecen
teñidas de forma no concluyente.[24]
 Las bacterias pequeñas y delgadas, como las
especies Treponema, Chlamydia y Rickettsia, son difíciles de teñir
correctamente.[25]
7.

7
Desecha los materiales. Los procedimientos para la eliminación de desechos
varían entre laboratorios y según los materiales usados. Normalmente, el
líquido en la bandeja para tinción se desecha como residuo peligroso en
botellas selladas. Sumerge los portaobjetos en una solución con un 10% de
lejía y luego deséchalos en recipientes para instrumentos afilados.
Consejos
 Recuerda que el rendimiento de la tinción de Gram es solo tan bueno como el
espécimen. Es importante enseñar a los pacientes a proporcionar buenos
especímenes (por ejemplo, enseñarles la diferencia entre un escupitajo y una
tos profunda para muestras de esputo).
 Como decolorante, el etanol actúa con más lentitud que la acetona.
 Sigue las precauciones estándar para el laboratorio.
 Usa un frotis bucal para practicar, ya que la muestra debe contener bacterias
tanto Gram positivas como Gram negativas. Si solo ves uno u otro tipo de
bacteria, es probable que hayas usado muy poco o demasiado decolorante.[26]
 Puedes usar una pinza para ropa de madera con resortes para sujetar el
portaobjetos.[27]

Advertencias
 La acetona y el etanol son inflamables y la acetona resecará tus manos. Usa
guantes y manipúlalos con precaución.
 No dejes que la mancha se seque antes de enjuagar el tinte o el colorante
secundario.[28]

Cosas que necesitarás


 Muestra de tejido
 Portaobjetos de vidrio
 Pipeta
 Una fuente de llamas, un calentador de portaobjetos o metanol
 Agua
 Cristal violeta
 Yodo
 Agente decolorante, como alcohol o acetona
 Safranina