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Producción de enzima que degrada almidón crudo por Aspergillus sp.

y su uso en conversión de
harina de yuca silvestre no comestible nuestra en bioetanol

Los principales cuellos de botella en la obtención de combustible bioetanol competitivo son el alto costo
de la materia prima, energía y enzimas empleadas en el pretratamiento antes de la fermentación. La
biomasa lignocelulósica ha sido propuesta como materia prima alternativa, pero debido a su
complejidad, la viabilidad económica aún no se ha realizado. Por lo tanto, la investigación en torno a
materias primas no convencionales y la implementación de métodos de bioconversión para reducir el
costo de la energía y las enzimas se justifica. En este estudio se utilizó un material de alimentación no
convencional, yuca silvestre no comestible, para la producción de bioetanol. La bioconversión de
almidón crudo/bruto de la yuca salvaje a bioetanol a baja temperatura se investigó usando tanto un co-
cultivo de Aspergillus sp. y Saccharomyces cerevisiae, y un monocultivo posterior con la preparación
de enzima a partir de la primera. Una cepa recientemente aislada de Aspergilo sp. MZA-3 produjo una
enzima que degrada el almidón bruto/crudo que muestra mayor actividad de 3,3 U / ml para almidón
crudo de yuca salvaje a 50 ºC, pH 5,5. Un co-cultivo de MZA-3 y S. cerevisiae; y un monocultivo de S.
cerevisiae y enzima de MZA-3 (ambos suplementados con glucoamilasa) resultó en un rendimiento del
bioetanol (porcentaje del rendimiento teórico) de 91 y 95 en eficiencia (porcentaje) de 84 y 96,
respectivamente. La bioconversión directa de almidón crudo a bioetanol se logró a 30 C a través del
enfoque de co-cultivo. Esto podría ser atractivo ya que puede reducir significativamente el tamaño de
los gastos de energía.

La producción de bioetanol como un energía en forma de calor gastado en el


portador de bioenergía es altamente pretratamiento de materia prima y enzimas
promovido como una solución alternativa a la comerciales, que se utilizan en la hidrólisis.
seguridad energética y a la contaminación del Como ejemplo, el costo de la energía incurrido
medio ambiente entre las naciones. Sin en procesos tales como la gelatinización,
embargo, estos esfuerzos se ven licuación y sacarificación de almidón de maíz
obstaculizados por los altos costos de la realizada antes de la fermentación de la
materia prima y la bioconversión de la biomasa levadura, se estima que corresponden al 30-
en bioetanol. Los principales costos en los 40% del coste total de la producción. Una
pasos de bioconversión se atribuyen a la manera práctica de reducir el coste del
bioetanol producido a partir de biomasa de productor de alcohol eficaz (por ejemplo,
almidón puede ser el uso de enzimas Saccharomyces cerevisiae). La simultánea
producidos en-casa capaces de degradar el hidrólisis del almidón con un organismo
almidón crudo a bajas temperaturas. Este amilolítica y la fermentación por un organismo
enfoque tiene dos ventajas; primeramente, se eficaz de fermentación es una técnica atractiva
reduce la cantidad de energía gastada en los para la bioconversión de almidón a bioetanol.
procesos antes mencionados (por ejemplo, la La ventaja de hidrólisis y fermentación
gelatinización, licuefacción, sacarificación) de simultáneas es que un proceso de múltiples
la biomasa de almidón antes de la etapas para la conversión de almidón en etanol
fermentación de la levadura. En segundo lugar, se lleva a cabo en un biorreactor. La glucosa
reduce los costos (a menudo caros) de producida durante la sacarificación es
enzimas comerciales, debido a que el uso de simultáneamente asimilada por la levadura
estos tienden a aumentar el costo de la para evitar la acumulación de una presión
producción de bioetanol. Además, la osmótica, que de otra manera tiende a inhibir
licuefacción enzimática convencional de la fermentación.
almidón se lleva a cabo a alta temperatura (por
Una vez que un microorganismo amilolítica
ejemplo, 90 - 110 ºC) seguido de la
adecuado ha sido identificado, ya sea para (i)
sacarificación realizada a temperaturas más
co-cultivo directamente con la levadura para la
bajas, por ejemplo, en 60 - 70 ºC a partir de
producción de bioetanol o (ii) cultivar y producir
entonces, el hidrolizado se enfría a
enzimas para la hidrólisis de almidón o
aproximadamente a 30 ºC para la fermentación
biomasa antes de la fermentación de la
de la levadura. El costo de la energía de calor
levadura debe que ser evaluado. Esto es
y de la enzima en tales procesos constituye el
porque las dos cepas utilizadas en co-cultivos
segundo costo importante para la producción
pueden no ser compatibles y o pueden no
de bioetanol. Por lo tanto, las enzimas con
poseer requisitos de cultivo similares, tales
ventajas específicas, por ejemplo, la hidrólisis
como pH, temperatura, nutrientes o la
de almidón crudo a bajas temperaturas valen
demanda de oxígeno. Por lo tanto, con el fin
la pena explorar. Tales beneficios, sin
de tener un co- cultivo estable ciertos
embargo, pueden ser específicas para
requisitos deben ser considerados. En primer
situaciones dadas y sustrato usado y pueden
lugar, las dos cepas deben ser compatibles y
necesitar ser verificados a través del análisis
capaces de crecer juntos. Se han estudiado los
tecno-económico antes de la aplicación a gran
aspectos de compatibilidad de combinaciones
escala.
de diversas cepas. En un estudio, seis cepas
Otra opción es la producción directa de etanol de S. cerevisiae fueron co-cultivadas con
por un co-cultivo de microbio amilolítico, por diferentes cepas de otras levaduras. En el
ejemplo, moho amilolítica y un microorganismo estudio mencionado anteriormente, ninguna
de las seis cepas de S. cerevisiae evaluadas crecimiento o inhibidores tales como
se han encontrado concentraciones para antibióticos).
inhibir el crecimiento de Pichia stipitis o
La yuca silvestre es una de las materias
Candida shehatae, y ninguna de las cinco
primas baratas y no convencionales que se
cepas de C. shehatae estudiados presentaron
pueden utilizar para la producción de
un efecto inhibidor sobre el crecimiento de las
bioenergía. Características y facilidad de uso de
especies de Saccharomyces. Sin embargo,
la yuca silvestre ( Manihot glaziovii) para la
entre las seis cepas de P. stipitis, cinco
producción de bioetanol se ha reportado en
demostraron actividad asesina contra
nuestro estudio anterior. La yuca silvestre M.
Saccharomyces especies, y tres de estas cinco
glaziovii tiene muchas ventajas como cultivo
cepas mostraron actividad asesina contra S.
bioenergético. Es muy resistente, de rápido
cerevisiae. En segundo lugar, las condiciones
crecimiento, libre de ataques de insectos y
de fermentación, tales como pH, temperatura y
hongos, requiere poca o ninguna atención una
suministro de oxígeno para las dos cepas
vez establecido y prospera en suelos pobres,
deben ser compatibles. Por ejemplo,
secos y rocosos casi inadecuados para otros
Zymomonas mobilis fermenta glucosa a pH 7 y
cultivos. Además, los tipos encontrados
la temperatura de 37 C, pero estas condiciones
recientemente en Tanzania poseen grandes
no son compatibles con los de las levaduras
tubérculos con alto contenido de carbohidratos
que fermentan la xilosa ( P. stipitis y C.
fácilmente degradables que son hasta un 89%
shehatae), que necesitan pH 5 y la
de materia seca. Además, no es comestible, ya
temperatura 30 C. A la inversa, el pH y la
que se presume que contiene raíces fibrosas y
temperatura a la cual S. cerevisiae fermenta la
es muy amargo en comparación con la yuca
glucosa a etanol son compatibles con las de
domesticada, Manihot esculentum.
levaduras que fermentan la xilosa. Además, en
comparación con un cultivo puro, las En este estudio, se investigó la bioconversión
interacciones entre los diferentes de la yuca salvaje no comestible a bioetanol
microorganismos desempeñan un papel mediante S. cerevisiae en (i) un modo de co-
decisivo en los sistemas de co-cultivo. Las cultivo con una cepa amilolítica de Aspergillus
interacciones pueden ocurrir ya sea a través de sp., y se comparó con (ii) un modo de
la comunicación directa célula-a-célula o por monocultivo empleando una preparación
las sustancias de señal en el caldo de enzimática de la Aspergillus sp. El estudio pone
fermentación. En particular, el co-cultivo a prueba la potencia de la enzima amilolítica
estable podría ser controlado por interacciones cuando es secretada in situ durante la
metabólicas (es decir, las relaciones fermentación del co-cultivo y cuando se prepara
sintróficas, o la competencia por los sustratos) y utiliza junto con el microorganismo de
y otras interacciones (es decir, promotores de fermentación.
MATERIALES Y MÉTODOS reacción de PCR fueron ITS1 (5’-
CCGTAGGTGAA CCTGCGG-3’) y ITS4 (5’-
Recolección y preparación de los tubérculos
TCCTCCGCTTATTGATA TG-3’). Las
de yuca silvestre: La harina de yuca silvestre
condiciones de reacción del PCR fueron las
fue procesada a partir de tuberosas obtenidas
siguientes: 95 C durante 4,5 min, luego 30 ciclos
de Kisarawe, Tanzania. Los tubérculos se
a 95 C durante 30 s, 40 C durante 30 s, y 72ºC
procesaron a harina como se detalla más
durante 1 min, con una extensión final de 10 min
adelante. Seguidamente, las muestras de harina
a 72ºC.
se tamizaron a través de 850 metro m malla
antes de su uso. Producción de enzima: El medio para la
producción de enzimas compuesta de (g / L) (NH
Aislamiento e identificación de
4)2 SO4 (2,5), KH2 PO4 ( 3,0), CaCl2 ( 0.13),
microorganismos: Se recogieron muestras de
MgSO4 ( 0.2), triptona (2), y almidón de papa. El
suelo de la rizosfera de plantas de yuca
cultivo se cultivó en 250 ml en matraz
silvestre, M. glaziovii, en el distrito de Kisarawe
Erlenmeyer con un volumen de 100 ml de
en la región costera del este (Pwani) Tanzania.
reacción que se incubó a 28 ± 2 C, 115 rpm, 36
Los aislados amilolíticos fueron monitoreados
h. Después, 10% (v / v) de inóculo se inoculó en
plaqueando las muestras de suelo sobre medio
250 ml del mismo medio en un matraz de 1 L y
nutriente suplementado con agar 15 g / L y
se incubaron en un incubador agitador a 28 ± 2
almidón comercial 10 g / L. Los antibióticos
C, 110 rpm, 36 h. Posteriormente, el cultivo se
(tetraciclina y cloranfenicol), 0.025% (w/v) se
centrifugó a 5500 xg, 4 C, 15 min (RC5C,
añadieron en el medio después de la
centrifugadora SORVAL centrifugadora,
esterilización para inhibir la contaminación
EE.UU.) para eliminar los micelios y esporas, y
bacteriana. Después, las placas se incubaron a
el sobrenadante se utilizó para ensayos
28 C, durante 36 h. Los aislamientos amilolíticas
enzimáticos.
fueron seleccionados al inundar las placas de
agar con solución KI / I2 ( 2%). Los aislados que La producción de enzimas fue optimizado para
tiene una proporción más alta de la limpieza de la temperatura y el pH. El pH se varió desde 3,0
la zona de tamaño de las colonias se hicieron hasta 7,0 a 30 C y después, se utilizó el pH
crecer en cultivo líquido y el nivel de producción óptimo establecido para cultivar la cepa en
de amilasa se determinó a partir del intervalo de temperatura de 25 C a 40 C. Las
sobrenadante fluido del cultivo libre de células. muestras fueron tomadas después de 1 h y se
Las cepas MZA-3 y GDA5011 luego eran analizaron los azúcares reductores por medición
identificados por técnicas moleculares. La de absorbancia a 540 nm de acuerdo con
región espaciadora transcrita interna (ITS) de Millers. Dado que las cepas fueron aisladas de
estos aislados eran amplificadas por la reacción la rizosfera de la yuca silvestre MGK en
en cadena de la polimerasa (PCR) y se Kisarawe Tanzania, donde la temperatura es de
secuenciaron. Los cebadores utilizados en la aproximadamente 30 C y se encontró que crece
bien a pH 5,5, la temperatura y el pH para el nutrientes basal con 10% (v / v) de cultivo activo
cultivo y la producción de enzimas fue elegido de MZA-3 y se incubaron a 30 C, 110 rpm
para caer dentro de este rango. durante 24 h. Después se añadió, 10% (v / v) de
Amiloglucosidasa (AMG) se adquirió en cultivo de levadura y la fermentación empezó a
Novozymes (Copenhague, Dinamarca). 32 C. La condición de la segunda operación era
idéntica a la primera, excepto que la
Purificación parcial: El sobrenadante libre de
glucoamilasa (0,33 AMG /g de harina) se añadió
células se precipitó con sulfato de amonio sólido
antes de la fermentación de la levadura. En la
al 60% de saturación. El precipitado se recuperó
condición de la tercera operación, la
y disolvió en un volumen mínimo de agua
preparación de enzima MZA-3 usaron 0,29 U/g
desionizada y se dializó durante la noche contra
de harina para hidrolizar la harina de yuca
agua. El dializado se mantuvo en tampón Tris-
silvestre (270 g/L suspendidos en agua
HCl pH 7,0 a 4 ° C y se usó para estudios de
desionizada) a 50 C, 110 rpm, 24 h seguido por
ensayo de la enzima y de hidrólisis.
fermentación de la levadura en 32 ± 2 C. La
Ensayo enzimático: Se añadieron 94 uL del condición de la cuarta operación fue
sobrenadante del cultivo a 656 uL de 0,5% (w / exactamente como la tercera excepto que la
v) de almidón soluble en buffer acetato de sodio glucoamilasa (AMG 0,33 / g de Florida nuestra)
de 0,05 M (pH 5,6) y se incubaron a 50ºC se añadió antes de la fermentación de la
durante 30 min. Después se añadieron 750 uL levadura en 32 ± 2 C. La condición de la quinta
de reactivo de ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) y operación (experimento control), involucró
se incubaron en agua hirviendo durante 5 min. fermentación directa de la harina de yuca
Posteriormente, la cantidad de azúcares salvaje usando sólo glucoamilasa y S.
reductores liberados se determinó por medición cerevisiae.
de la absorbancia a 540 nm de acuerdo con
La harina de yuca usada para cada operación
Millers. Una unidad de la actividad enzimática
fue esterilizada separadamente por irradiación
fue definida como la cantidad de enzima que
por Co60 según Lin et al. y después se enfrió a
libera 1 umol de azúcar reductor equivalente a
temperatura ambiente en el gabinete estéril
glucosa por minuto bajo las condiciones de
antes de la hidrólisis y la fermentación.
ensayo.
En todos los casos, la fermentación se realizó
Hidrólisis y fermentación simultáneas de
usando sistema automático de gas potencial de
harina de yuca silvestre: la tabla 1 presenta
ensayo (AGPTS) como se describe en un
las condiciones de las cinco operación que se
estudio previo. En pocas palabras, en AGPTS,
emplearon en la hidrólisis y fermentación de la
el volumen de CO2 producido durante la
harina de yuca silvestre. Por lo tanto, en la
fermentación es detectada por un sensor,
condición de la primera operación, 270 g/L de
medido y registrado en línea en software
harina de yuca se inocularon en medios
AGPTS.
La fase móvil era agua de grado HPLC a una
velocidad de flujo de 0,6 ml/min. Los sólidos
totales (TS), sólidos volátiles (VS) y el pH se
determinaron usando métodos estándar.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Aislamiento e identificación de
microrganismos: Se encontraron dos aislados
Posteriormente, el volumen de CO2 se
designados como MZA-3 y GDA 50.011 para
normalizó a temperatura y presión estándar y
exhibir una alta actividad de amilasa y se
posteriormente convertida a moles utilizando la
seleccionaron para estudios adicionales. Los
ley de gas común:
aislados fueron identificados a nivel de género
PV = nRT ……. (1) basado en las propiedades morfológicas y de
identidad de secuencia interna espaciador
Donde P es la presión, V volumen, n número de
transcrito (ITS). Cuando los aislados MZA-3 y
moles, T temperatura absoluta y R es constante
GDA5011 se cultivaron en agar de dextrosa de
de los gases (8,314 JK-1 mol-1).
papa (PDA), las colonias mostraron micelio
Dado que el etanol y CO2 se producen en igual blanco y esporas verde, y cuando se observa
número de moles durante la fermentación los bajo el microscopio, características distintas a
moles de CO2 se convierten en moles de etanol Aspergillus sp. tales como conidióforos con
mediante la aplicación de un factor de (46/44), y cabezas hinchadas, se observaron esporas
finalmente a la concentración de etanol (g / L) externos e hifas septadas. La base de datos de
como se explica en otra parte. similar búsqueda para la secuencia ITS de

Métodos analíticos: Todos los productos aislado de MZA-3 y GDA5011 reveló que ambos

solubles en agua y glucosa restante durante la aislados pertenecen a especies de Aspergillus

fermentación fueron analizados por HPLC como que respaldan la caracterización morfológica. El

se detalló anteriormente. CO2 se controló y aislado MZA3 está estrechamente relacionado

midió en línea por el sistema de prueba de (99%) con Aspergillus awamori (no.

potencial de gas automáticos (AGPTS). Los LM653116.1), mientras que GDA5011 está

azúcares monoméricos liberados de hidrólisis estrechamente relacionado (99%) con

enzimática se determinaron mediante HPLC Aspergillus nomius (no. JN709035.1),

(JASCO Corporation, Tokio, Japón) equipado Aspergillus flavus (no KC907367.1) y

con una columna Bio-Rad Aminex HPX-87P y un Aspergillus oryzae (no. KF619561.1). Las

detector de índice de refracción (RID). La secuencias de ITS de los organismos con

temperatura de la columna se mantuvo a 85 C. elevada secuencia de identidad fueron


recuperados de Genebank y se generó un árbol Producción y preparación de enzima MZA-3:
filogenético que revela la posición taxonómica Se estudió el efecto de la temperatura y el pH
de estos aislados (Fig. 1). La secuencia de sobre la producción de degradación de enzima
alineamiento y el árbol filogenético fue inferido del almidón crudo por MZA-3. Durante la
utilizando el software Molecular Evolution optimización de la producción de la enzima, el
análisis genético (MEGA4). pH y la temperatura a la que se alcanzó el
rendimiento más alto de la enzima (U / ml), se
encontró que era 5,5 y 30 C, respectivamente
(Fig. 2 A y B).

Durante la hidrólisis de la yuca silvestre no


comestible utilizando aislamientos MZA-3 y
GDA5011, el rendimiento de azúcares
reductores, glucosa equivalente como
porcentaje del rendimiento teórico (% TY) fue
66,4 y 13,5, respectivamente. Por lo tanto, aislar
MZA-3 se eligió para estudios adicionales. El
TY% se estimó a partir de los equivalentes
iniciales de azúcares reductores de glucosa
predeterminado usando el peso de la muestra
(W) (g) hidrolizadas, TS predeterminados y
contenido de almidón (SC) de la yuca silvestre,
y un factor de hidro para el almidón (hexosa, es
decir, 0,9 ) usando las ecuaciones; azúcar inicial
de glucosa (IS) equivalente (g);

Fig 2.
La preparación de enzima resultante muestra la Mediante la combinación de las condiciones
actividad más alta en 50 C como se muestra en máximas mencionadas, el rendimiento más alto
la fig. 2C, y pH de 5.5. El uso de una enzima de de azúcares reductores (en equivalentes de
licuación a pH 5,5 podría reducir la cantidad de glucosa) fue 66% del valor teórico. El análisis
ácido utilizado de otra manera para reducir el pH por HPLC reveló que los productos de la
de la licuación al intervalo de pH de hidrólisis de la yuca silvestre utilizando MZA-3
sacarificación (por lo general, la licuefacción con eran maltosa 42,3%, maltotriosa 11,0%, glucosa
α- amilasa se realiza a alrededor de pH neutro, 6,1% y no azúcares identificados 3,2%. Este
mientras que la sacarificación con rendimiento es comparable a la observada con
glucoamilasas se lleva a cabo alrededor de pH 0,18 KNU (T) (por gramo de harina de yuca) de
5,0). Esto apunta de nuevo hacia posible termoestable disponible en el mercado α-
reducción de costos obtenida de procesamiento amilasa a 90ºC (2h). KNU (T) se refiere a las
bajo agua. Por otra parte, la hidrólisis de almidón unidades de Kilo Novo α-amilasa (Termamyl),
crudo a 50 C puede conferir beneficios a través en la cual un KNU (T) es la cantidad de α-
del ahorro de energía, evitando pasos intensivos amilasa que bajo condiciones estándares (pH
en energía, tales como la licuefacción del 7.1, 37ºC) dextrinises 5,36 g de almidón de
almidón realizado en 90 - 110 C, después de la sustancia seca por hora. Lin et al informó un
gelatinización, que es llevar a cabo a rendimiento de 80% (azúcar reductor) de la
temperaturas incluso más altas dependiendo del hidrólisis de la harina de yuca de concentración
contenido de amilosa y la humedad. Por lo tanto, similar (harina de yuca) con una preparación de
la preparación de enzima a partir de aislado enzima diferente de Penicillium sp. Sin embargo,
MZA-3 puede ofrecer algunas ventajas técnicas. el tiempo de retención fue 18 veces más larga
Cabe señalar que el pH 5,5 es favorable para la (36 h) en comparación con 2 h obtenidos en el
mayoría de especies de bacterias de ácido presente estudio. Por lo tanto, la preparación de
láctico. Esto puede causar la contaminación enzima MZA-3 es relativamente más eficiente en
durante la sacarificación y se debe tomar en comparación con los reportados por Lin et al. En
cuenta especialmente en operaciones a gran la conversión convencional de biomasa de
escala. almidón a bioetanol, los costes de (i) enzimas y
(ii) calentamiento (energía) constituyen la
La hidrólisis de la harina de yuca silvestre
segunda coste importante después de la de
con la enzima de MZA-3: dosis de enzima,
materia prima. La licuefacción y sacarificación
concentración de sustrato y el tiempo de
parcial del almidón por termoestable bacteriana
retención: La dosis máxima de enzima, la
α-amilasa es una de las operaciones unitarias
concentración de sustrato y el tiempo de
más intensiva de costes. Se estima que el costo
retención para la preparación de enzima MZA-3
de producción de etanol tanto a partir de caña
con respecto a la harina de yuca eran 3,3 U /
de azúcar (Brasil) y el maíz (EE.UU.) es de entre
ml, 150 g / L y 120 min, respectivamente (Fig. 3).
$ 0,3 y 0,4 por litro en el que las enzimas
contribuye $ 0,027 igualando aproximadamente rendimiento de azúcares para confirmar la
11 - 15% del coste total de producción. Además, economía del proceso.
la energía calorífica gastada en la gelatinización
y licuefacción de almidón 80 - 125 C eleva
significativamente el costo de lahidrólisis del
almidón. Por lo tanto, la hidrólisis de almidón
crudo a baja temperatura (50 C) puede
minimizar el coste de la energía y se espera que
contribuya favorablemente a la economía de las
industrias de procesamiento de almidón.

El rendimiento de azúcares reductores a baja


carga de sustrato (50 g / L) se incrementó con el
aumento de dosis de enzima (Fig. 3 A) en el que
el mayor rendimiento se obtuvo en 5 U / ml.

El efecto de la concentración de sustrato en


el rendimiento de azúcares reductores se
evaluó considerando diferentes
concentraciones de sustrato como se presenta
en Fig. 3 B. La mayor cantidad de azúcar
reductor se midió en la harina de concentración
de 150 g / L. Cuando la concentración se
aumentó de 150 a 200, 250, 300 y 350 g / L,
azúcares reductores (% TY) era; 43%, 37%,
24% y 16%, respectivamente (Fig. 3 B). Cuando
el tiempo de retención se amplió de 2 a 6 h con
la concentración de sustrato ajustado a 250 g /
L, azúcar reductor (% TY) alcanzó 70%. Esto
implica que la preparación de la enzima a partir
de aislado MZA-3 puede tener ventaja para la
licuefacción industrial del almidón crudo a baja
Fig 3.
temperatura, donde se emplearon las
concentraciones del almidón en el rango de
150-250 g/L. Sin embargo, se requiere un
análisis tecno-económico de todos los factores
como tiempo de retención, dosis de enzima,
sustrato, energía, media y químicos versus
Fermentación del almidón crudo de la yuca enzima de MZA-3 y la glucoamilasa observadas
silvestre bajo varias condiciones de en ambos co- y monocultivos, se incluyó un
operación: efecto en el rendimiento de experimento control conteniendo sólo harina de
bioetanol: Se investigaron diferentes yuca silvestre y glucoamilasa (condición de la
condiciones operacionales en consideración con operación 5). Este resultó en rendimiento de
el rendimiento de etanol a partir de la yuca etanol menor a 0.5% (Fig 4). Esto implica que
silvestre (Tabla 1). La fig. 4 muestra el los enlaces de almidón α-(1,4)-glicosídico fueron
rendimiento de etanol según la condición de desdoblados por la enzima MZA-3
operación en estudio del 1 al 5. Los resultados principalmente a oligòmeros pero no a glucosa.
revelaron que el rendimiento del etanol (%TY) Por lo tanto, es plausible afirmar que la a-
mejoró significativamente (de 14% a 91%) amilasa liberada por la cepa MZA-3 rompe
cuando el co-cultivo de Aspergillus sp. MZA-3 y aleatoriamente los enlaces α-(1,4)-glicosídico en
S. cerevisiae fue suplementado con el almidón para producir maltodextrinas,
glucoamilasa externo (condición de las maltosa, maltotriosa y pequeñas cantidades de
operaciones 1 y 2). azúcares fermentables (glucosa).

Figura 4. Figura 5.

El rendimiento teórico del etanol fue calculado Sin embargo, la levadura no puede fermentar
basado en la glucosa estima inicial de manera estos oligómeros. Por lo tanto, la adición de
que cada gramo de glucosa rindó 0.511 g de glucoamilasa que convierte los oligómeros
etanol. Esto corresponde a una concentración liberados por a-amilasa a glucosa dio como
de etanol de 11.4 a 65.7 g/L (Fig. 5), resultado el mayor rendimiento de etanol.
respectivamente. Una evaluación similar
Se ha informado anteriormente que la
empleando el monocultivo de S. cerevisiae y la
combinación de a-amilasa y glucoamilasa
enzima preparada del aislado MZA-3
actúan sinérgicamente en la mejora de la
(condiciones 3 y 4), el rendimiento del etanol
hidrólisis de almidones de maíz y papa. En este
(%YT) mejoraron de 18% a 95% (Fig 4) que
estudio, se demostró que sólo se obtuvo 20% de
corresponde a concentraciones de etanol de
glucosa de almidón cocido después de 60 h de
10.8 y 5.5 g/L, respectivamente (Fig 5). Para
incubación cuando se utilizó amiloglucosidasa,
confirmar la necesidad de sinergia entre la
en comparación con el 100% de glucosa cuando midió y registró en línea utilizando el AGPT. El
se usó la combinación de amilasa y volumen de CO2 fue luego convertido en etanol
amiloglucosidasa. como se describe en los materiales y métodos.
Este sistema ha sido verificado usando HPLC y
El rendimiento de etanol obtenido para la
demostró ser preciso y confiable para la
fermentación de co-cultivo en el presente
fermentación tanto en condiciones mesófilicas
estudio es comparable al reportado para dos
como termofílicas. Se ahorra la pesadumbre, el
cepas de levadura Saccharomyces diastaticus y
tiempo y el costo de muestreo y la preparación
S. cerevisiae 21. Sin embargo, Abouzied et al.
de muestras para HPLC o GC análisis. Además,
reportaron un mayor rendimiento de etanol
permite medir y registrar tanto CO2 como etanol
utilizando una co-cultivo de Aspergillus niger y
cada minuto, proporcionando así datos vitales
S. cerevisiae, en comparación con un
para el estudio de la cinética de la fermentación
monocultivo que contenía sólo al primero.
y la dinámica de la degradación de la biomasa.
Se obtuvo un poco más de etanol con el
La cinética y el patrón entre las fermentaciones
monocultivo en el que la enzima MZA-3 se
de mono y co-cultivo fueron muy diferentes. El
suplementó con glucoamilasa (95%) que el co-
monocultivo suplementado con glucoamilasa
cultivo (91%) (Figura 4). La discrepancia puede
(condición de operación 4) experimentó una fase
explicarse por cómo se asignó la fuente de
de retardo de aproximadamente 8 h, tal vez,
carbono para el crecimiento celular en los
debido a la adaptación de la levadura en alta
sistemas de co-cultivo y monocultivo. El análisis
concentración de disacáridos, y después, la fase
de balance de masa estequiométrico indicó que
exponencial fue rápida y completada en 16 h. En
los moles de biomasa (C5H7NO2P0.074)
consecuencia, se alcanzaron altas
producidos por mol de glucosa fueron más altos
concentraciones finales de etanol y
para el co-cultivo (0.07) que para el monocultivo
productividad, 75 g / L y 4,5 g / L / h,
(0.03) (Tabla 2). La recuperación de carbono
respectivamente. Por el contrario, el co-cultivo
para el co-cultivo fue comparable al monocultivo
suplementado con glucoamilasa (condición de
para reactores suplementados con glucoamilasa
operación 2) no experimentó ninguna fase de
(condiciones de operación 2 y 4), 99% y 101%,
retardo. Sin embargo, fue relativamente lento,
respectivamente.
completando la fase exponencial en 60 h, y
Cinética y patrón de fermentación con co- resultó en una concentración final de etanol de
cultivo y monocultivo: La cinética y el patrón 65 g / L con una productividad de 1,2 g / L / h.
de fermentación presentados por las cuatro Las condiciones de operación 1 y 3, es decir, co-
condiciones de operación descritas en la Tabla y monocultivo sin glucoamilasa, mostraron una
1 se presentan en la Fig. 5. La cinética de la concentración y una productividad final de
fermentación para monocultivo y co-cultivo se etanol bajas de 11,4, 11,5 g / L y 0,22 y 0,41 g /
controló mediante la producción de CO2, que se L / h, respectivamente (Figura 5). Por lo tanto, el
uso de la preparación enzimática MZA-3 para comercial, dieron como resultado altos
licuefacción a 50 ◦ C seguido de SSF con S. rendimientos de etanol (91% y 95% de TY) y
cerevisiae a 30 ° C parece ser más eficiente que recuperación de carbono (99% y 101%),
el enfoque del co-cultivo. Sin embargo, el costo respectivamente. Aunque el co-cultivo mostró
de la extracción y la preparación enzimática y un mayor tiempo de fermentación y una
luego, la energía gastada en la hidrólisis antes productividad volumétrica relativamente baja,
de SSF necesitan ser calibrados contra el costo 1,2 g / L / h frente a 4,5 g / L / h para el
de un tiempo de fermentación más largo a 30ºC monocultivo, podría ser de interés ya que la
en un análisis tecno-económico para decidir el bioconversión directa de almidón crudo a etanol
mejor enfoque. La diferencia en el patrón de se realiza a 30±2 ºC en un solo reactor, lo que
fermentación observado podría explicarse por la reduce significativamente los costos de energía
interacción de los dos microorganismos y operativos. Nuestros estudios futuros se
presentes en el medio. centrarán en las interacciones de los dos
microorganismos en la fermentación co-cultivo
Las células presentes en un medio se
para determinar el rendimiento óptimo. Además,
comunican entre sí mediante interacciones
se requiere un análisis técnico-económico para
directas de célula-a-célula o a través de las
determinar la economía de los dos enfoques.
sustancias de señal en el caldo de fermentación.
Estas interacciones pueden ser sinérgicas, por
ejemplo, a través de sus diferentes sistemas
enzimáticos y vías bioquímicas o antagonistas a
través de sustancias inhibidoras o competencia
por sustrato. Por lo tanto, además del análisis
técnico-económico para comparar la economía
de los dos enfoques, se necesitan estudios
específicos para desentrañar cómo interactúan
los dos microorganismos y cómo se pueden
optimizar las condiciones de operación para un
rendimiento óptimo.

El almidón crudo de la yuca no comestible


silvestre se convirtió exitosamente en bioetanol
a través de co-cultivo de S. cerevisiae y una
cepa recién aislada de Aspergillus sp. MZA-3.
Esto se comparó con un monocultivo de S.
cerevisiae, utilizando la preparación enzimática
de la Aspergillus sp. MZA-3. Ambos enfoques,
cuando se suplementaron con glucoamilasa