PRÁCTICA Nº 5

CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS: MÉTODO DE TURBIDIMETRÍA Y

RECUENTO DIRECTO EN CÁMARA DE NEUBAUER

I. OBJETIVOS:
 Que el alumno compare las técnicas de turbidimetría y conteo directo al
microscopio para cuantificar microorganismos totales en una suspensión
microbiana.

II. INTRODUCCIÓN:
La concentración de la biomasa microbiana es un parámetro importante que debe
estimarse en diversos bioprocesos. Existen diversos métodos directos e indirectos para
estimar la biomasa de un cultivo. Entre los métodos directos más comunes para
cuantificar la biomasa microbiana en una muestra líquida, se encuentra la turbidimetría.
La turbidez de una suspensión microbiana es el resultado de la dispersión de la luz por
las células. Como la cantidad de luz dispersada en una suspensión es directamente
proporcional al número de células, el crecimiento microbiano (que implica un aumento
en el número de células) se refleja en un aumento en la turbidez de la suspensión. Los
cambios en la turbidez de un líquido se determinan en un espectrofotómetro, el cual
mide la cantidad de luz que pasa a través de un medio líquido. El crecimiento (medido
de esta manera comúnmente) se reporta como un cambio en la densidad óptica (DO),
el cual es directamente proporcional a la concentración celular. Es posible relacionar la
DO de una suspensión microbiana con el número de células o la masa celular que hay
en dicha muestra. Con el uso de una tinción adecuada y una cámara de recuento es
posible contar el número de células en un volumen determinado, determinando así la
concentración celular en una suspensión. Las cámaras de recuento sirven para
cuantificar el número de partículas (p.ej. bacterias, esporas fúngicas, polen) por unidad
de volumen en un líquido, a través de su conteo visual bajo un microscopio. A la fecha,
el tipo de cámara más utilizado para el recuento directo de células, es la cámara de
Neubauer (o hemocitómetro); esta es una pieza de cristal grueso con el tamaño de un
portaobjetos, en donde se coloca un pequeño volumen de la suspensión a analizar.

III. PARTE EXPERIMENTAL:

1. MATERIALES
 Asa de kolle
 KOH al 10%
 Mechero
 Azul de lactofenol
 Agar Sabouraud
 Láminas portaobjetos
 Láminas cubreobjetos
 Microscopio

2. PROCEDIMIENTO Y RESULTADOS:
Cuantificación de microorganismos
 Con la muestra de cada suspensión, realizar la medición de densidad óptica y el
conteo directo al microscopio.
 Turbidimetría. Homogeneizar la muestra en vórtex y leer la densidad óptica (DO) de
la suspensión a 560 nm. Calibrar el equipo con agua destilada. Si la DO es mayor a 0.8,
deben hacerse diluciones con agua destilada. La dilución debe considerarse al registrar
el dato de la concentración total de células/mL en el Cuadro 10. Recuerde que:
 Cuenta directa al microscopio: Homogeneizar la muestra en vórtex, tomar un
pequeño volumen con una pipeta Pasteur y colocar una gota cuidadosamente en la
cámara de Neubauer, debajo del cubreobjetos de acuerdo con las instrucciones del
profesor

Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda y
realizar iluminación Kohler.
Colocar la cámara en la platina del microscopio y ubicar la cuadrícula con el objetivo
10X. Al observar el cuadro central en el objetivo 40X, éste se encuentra dividido en una
cuadrícula de 5X5 cuadros más pequeños.
Las células se cuantifican en el objetivo de 40X, contando en diagonal las células de
9 cuadros a su vez divididos en 16 cuadros más pequeños). En el caso de muestras
muy concentradas, deberán hacerse diluciones (1:2, 1:5, 1:10 etc.). El factor de dilución
(FD) debe considerarse para cada dilución realizada:
Para calcular el número de células/mL se utiliza la siguiente ecuación:

Células/mm 3 = Número promedio de células x 25 cuadros x 10

X Células/mm 3 x 10mm3/1mL = X cel/ml

El número promedio de células por cuadro (de 0.2 mm) se multiplica x25 para obtener
el número total de células en un volumen de 0.1 mm3 (volumen de la cámara = 1 mm
por lado x 0.1 mm de profundidad). Este valor debe multiplicarse por 104 para obtener
el número de células/mL.
NOTA: Al finalizar, la cámara debe lavarse con agua destilada y secarse
cuidadosamente con papel seda.
V. CUESTIONARIO:
1. Explique las ventajas y desventajas del uso de cámaras de recuento para la
cuantificación de microorganismos.
2. Compare el método de dilución en placa con el método de cuenta directa en cámara
de Neubauer para cuantificar microorganismos. En qué casos conviene usar uno u otro.
3. Ejemplifique 2 aplicaciones de estas metodologías (recuento directo en cámara y
turbidimetría) en: a) alimentos y b) microbiología industrial
4. A partir de los siguientes datos encontrados en una suspensión microbiana después
del conteo de células en una cámara de Neubauer, calcule: a) el factor de dilución (FD),
y b) el número de células/mL en el cultivo original. Recuerde que el número promedio
de células, indica el número promedio de células por cuadro.