"Nota de investigación"

UN NUEVO SISTEMA DE CULTIVO SIN CÁSCARA PARA EMBRIONES DE

POLLOS QUE UTILIZAN UNA PELÍCULA PLÁSTICA COMO RECIPIENTES DE
CULTIVO

RESÚMEN

El desarrollo de métodos de cultivo sin cáscara para embriones de aves con alta incubabilidad
sería útil para la generación eficiente de pollos transgénicos, manipulaciones de embriones,
ingeniería de tejidos y estudios básicos en medicina regenerativa. Hasta la fecha, los estudios
de métodos de cultivo para embriones de aves incluyen todo el cultivo de embriones utilizando
cáscaras de huevo de ventana estrecha, cáscaras de huevo sustitutas y un recipiente artificial
que utiliza una membrana permeable a los gases. Sin embargo, no hay informes que alcancen
una incubabilidad alta de ＞50% utilizando recipientes completamente artificiales. Para
establecer un simple método para el cultivo de embriones de pollos con alta incubabilidad,
examinamos varias condiciones de cultivo, incluyendo métodos para la suplementación con
calcio y la aireación de oxígeno en los cultivos de embriones. Donde los embriones se
transfirieron al recipiente de cultivo después de 55-56 h de incubación, más del 90% de los
embriones sobrevivieron hasta el día 17 cuando se usó una película de polimetilpenteno como
recipiente de cultivo con lactato de calcio y suplementos de agua destilada. La aireación de
oxígeno puro a los embriones supervivientes a partir del día 17 produjo una incubabilidad del
57,1% (8 de 14). Por lo tanto, logramos con éxito una incubabilidad alta con este método en el
cultivo de embriones de pollo utilizando un recipiente artificial.

Palabras clave: recipiente artificial, cultivo de embriones de pollo, eclosión, sin cáscara,
polimetilpenteno.

INTRODUCCIÓN

Un cultivo sin cáscara, donde se toma un embrión de pollo de una cáscara de huevo y se cultiva
en un ambiente artificial, es una técnica importante para la generación de pollos transgénicos
que producen sustancias útiles en sus huevos, así como para varias manipulaciones
embrionarias (Kamihira et al. ., 2005; Kyogoku et al., 2008).
Además, esta técnica podría ser útil para la preservación de aves raras, si se puede aplicar para
salvar huevos dañados. Sin embargo, la ventana de una cáscara de huevo para facilitar la
introducción de genes y otras manipulaciones reduce significativamente la incubabilidad
(Andacht et al., 2004). La técnica de cultivo sin concha para los embriones de pollo también
puede desempeñar un papel importante en la educación de los escolares en las ciencias de la
vida, a través de la observación directa del desarrollo embrionario.

Perry (1988) informó sobre un método de cultivo para embriones de pollo utilizando una
cáscara de huevo sustituta como un recipiente de cultivo para el cultivo ex ovo de un huevo
fertilizado en una sola célula tomado del oviducto materno. Este método consta de tres sistemas:
el sistema I para embriones desde la etapa de una sola célula hasta la etapa de blastodermo, el
sistema II para los embriones después de la etapa blas toderm hasta el día 3 y el sistema III para
los embriones desde el día 3 hasta la eclosión. El embrión se cultivó en los tres sistemas y se
transfirió de un vaso a otro. En el sistema III se utilizó una cáscara de huevo grande de pollo
como recipiente de cultivo. Sin embargo, la incubabilidad fue aproximadamente del 7% con
este método, que se mejoró a aproximadamente el 50% por Naito et al. (1990). Se han
informado algunos métodos de cultivo que utilizan cáscaras de huevo sustitutas para las
codornices (Ono et al., 1994; Kamihira et al., 1998; Ono et al., 2005; Kato et al., 2013).
Kamihira et al. (1998) informaron sobre un método de cultivo sin cáscara para embriones de
codorniz utilizando un recipiente artificial hecho de una membrana de politetrafluoroetileno
(PTFE) gaspermeable. En su método, más del 43% de los embriones de codornices eclosionaron
cuando el lactato de calcio se suplementó en el cultivo. Este sistema correspondía al sistema III
de Perry y el método de cultivo también se aplicó a los embriones de pollo (Kamihira et al.,

2004).

Se han reportado varias mejoras en el cultivo de embriones de pollo. Sin embargo, muchos de
estos métodos implicaron el reemplazo de cáscaras de huevo sustitutas derivadas de diferentes
especies de aves que ponen huevos relativamente grandes, como el pato aigamo y el pavo
(Borwornpinyo et al., 2005). Sin embargo, los métodos de cultivo que usan cáscaras de huevo
sustitutas presentan desventajas, como la preparación de cáscaras de huevo, las diferencias entre
los lotes de cáscaras de huevo, la incapacidad del uso de reciclaje y la baja operabilidad durante
la manipulación de embriones.
Fig. 1. Procesamiento de la película de polimetilpenteno. Para preparar un recipiente de cultivo, los lados derecho
e izquierdo de una película cuadrada de aproximadamente 30 cm se mantuvieron y estiraron en la forma apropiada
(A). Además, los lados que quedaron flojos se mantuvieron y la película se estiró de la misma manera (B). Se creó
una forma ovalada para tener aproximadamente el mismo tamaño que un huevo. La película debe aspirarse luego
utilizando un aspirador equipado con un vaso de plástico, que tenga el mismo diámetro que el recipiente artificial.
Esto también evitó que la película se arrugara cuando se instaló en el recipiente de cultivo artificial (C).

Para establecer un método de cultivo simple con una gran capacidad de eclosión, desarrollamos
un recipiente artificial utilizando una película plástica transparente muy conveniente en lugar
de cáscaras de huevo sustitutas, y examinamos las condiciones de cultivo como los suplementos
de calcio y agua y la aireación de oxígeno.

MATERIALES Y MÉTODOS

Huevos de gallina

Todos los huevos fertilizados utilizados en este estudio fueron huevos de Dekalb Brown, que
se obtuvieron en una tienda de abarrotes (Yamagishism Jikkenchi, Mie, Japón).

Buques de cultura

Se usó una copa de plástico de poliestileno de 430 ml como la vaina para el recipiente de cultivo.
Se hizo un orificio de 1-1,5 cm de diámetro en el lado de la copa, aproximadamente a 2 cm del
fondo, y el orificio se tapó con un apósito de algodón como filtro. Se insertó un tubo de plástico
de 2 mm de diámetro (Atom Multipurpose Tube; Atom Medical, Tokio, Japón) a través del
espacio entre la compuerta y el orificio para proporcionar un suministro de oxígeno.
Una solución acuosa (40 ml) de cloruro de benzalconio al 0,01% (OSUBAN-S; Nihon
Pharmaceutical, Tokio, Japón; diluida con agua destilada) se agregó a la taza. Se formó una
película de polimetilpenteno (FOR-WRAP; Riken Technos, Tokio, Japón) en forma cóncava,
evitando cuidadosamente las arrugas (Fig. 1) y se instaló como un recipiente de cultivo artificial
en la cápsula (Figs. 2A y 3). Se colocó una cubierta de plástico de poliestileno en la parte
superior del recipiente de cultivo.

Fig. 2. Vaso de cultivo artificial utilizado para cultivos de embriones de pollo. En esta
figura, no se añadió cloruro de benzalconio (antes de la transferencia de embriones; A).
El recipiente de cultivo artificial para pollos (inmediatamente después de la
transferencia del embrión; B). Barra, 1 cm.

Cultura de embriones

Los huevos de gallina fertilizados se incubaron previamente durante 48-50 h (Grupo A) u 55-
56 h (Grupo B) a 38 y 60% de humedad en una incubadora (BITEC-300; Shimadzu RIKA Co.,
Tokio, Japón). Para la preparación del cultivo de embriones, se agregaron 250-300 mg de polvo
de lactato pentahidrato de calcio (Showa Chemical Co., Tokio, Japón) a los recipientes de
cultivo. Posteriormente, se agregaron suavemente a los recipientes de cultivo agua apilada
esterilizada de 2,5 a 3 ml (Otsuka Pharmaceutical Co., Tokio, Japón). Cada cáscara de huevo
se limpió con etanol al 70%, se rompió sin usar un taladro y el contenido de huevo completo se
transfirió al recipiente de cultivo (Fig. 2B). Si las piezas rotas de la cáscara del huevo caían
dentro del recipiente de cultivo, las piezas se extrajeron cuidadosamente con unas pinzas
esterilizadas.
Además, hicimos 10 orificios de ventilación con un diámetro de 5-8 mm en la superficie
superior de la película de polimetilpenteno, con los cuales los embriones no hicieron contacto
directo. Los agujeros se crearon fundiendo la película utilizando una varilla de vidrio caliente.
El recipiente de cultivo se cubrió con una tapa de plástico de poliestileno para que la humedad
dentro del recipiente se mantuviera en aproximadamente el 100%.

El recipiente de cultivo se mantuvo a 38 y 80% de humedad en una incubadora. El recipiente

de cultivo se colocó con un ángulo de aproximadamente 8 ° y se giró 120 ° en el sentido de las
agujas del reloj, dos veces al día. Desde el día 17 del período de cultivo hasta la eclosión, se
suministró oxígeno puro a un caudal de aproximadamente 500 ml / h a través del tubo de
plástico instalado previamente. Si el embrión no podía romper la membrana corioalantoica solo
en los días 19 o 20 del período de cultivo, creamos cuidadosamente una incisión de 5 mm en la
membrana alrededor del pico sin sangrado grave en la membrana.

Fig. 3. Dibujos esquemáticos del recipiente de cultivo artificial utilizado para el cultivo de embriones
de pollo.

La Fig. 4 muestra el horario para el cultivo de embriones de pollo. Los huevos fertilizados
intactos sin manipulación se incubaron como controles (n ＝ 10). Se incubaron a 38 y 80% de
humedad en una incubadora, y se giraron 120 ° en el sentido de las agujas del reloj, dos veces
al día hasta el día 18. Se dieron pollos a los nuevos propietarios y se criaron para maduración
sexual como animales de compañía.
 Fig. 4. Horario de cultivo de embriones de pollo.

Análisis estadístico

La viabilidad de los embriones cultivados durante el período de incubación hasta el día 17 del
cultivo se determinó contando los embriones viables, donde el 100% de la viabilidad se definió
como el número de embriones viables en el día al comienzo del cultivo ex ovo. La incubabilidad
en presencia o ausencia de oxígeno se determinó contando embriones eclosionados, donde el
número de embriones en el día 17, al comienzo de la aireación, se definió como 100%. Los
datos se analizaron utilizando la prueba de probabilidad exacta de Fisher. Un valor de p de ＜
0.01 fue considerado estadísticamente significativo.

RESULTADOS

Periodos de preincubación

Para los embriones que se transfirieron al recipiente de cultivo antes de las 50 h de incubación
(Grupo A; Etapa 12-15; Hamburger y Hamilton, 1951), no sobrevivieron embriones hasta el
día 8.

Cuando los embriones se transfirieron al recipiente de cultivo después de 55-56 h de incubación

(Grupo B; Etapa 16), la viabilidad en el día 8 del período de cultivo fue significativamente
mayor que en el Grupo A (P ＜ 0.01; Tabla 1, Fig. 5). y la viabilidad en el día 17 del período
de cultivo fue del 92% (23 de 25).
Suministro de oxígeno

Durante el cultivo en el vaso artificial en aproximadamente el día 17 del período de cultivo

(Etapa 43-44), el tono de color del torrente sanguíneo en las venas de la membrana
corioalantoica cambiado a rojo oscuro, lo que sugiere una deficiencia en el suministro de
oxígeno para los embriones. Por lo tanto, el oxígeno puro se aireó a aproximadamente 500 ml
/ h a través del tubo de plástico insertado en el recipiente artificial. Como resultado, en el Grupo
B, 57.1% (8 de 14) de los embriones suministrados con oxígeno se desarrollaron para incubar.
En contraste, no se desarrollaron embriones para eclosionar para las condiciones donde no se
suministró oxígeno (Tabla 1, Fig. 6). Así, la aireación de oxígeno incrementó
significativamente la eclosión. Habilidad (P ＜ 0.01).

Crecimiento de pollitos después de la eclosión.

Los pollitos que nacieron en este método estaban sanos y fueron criados para la maduración
sexual. Después de que los pollos se aparearon, obtuvimos una descendencia saludable.

Control de huevo intacto

La incubabilidad de los embriones de control intactos fue del 70% (7 de 10) y no se observaron
anomalías. Dos huevos estaban muertos con huevos picados, y otro huevo estaba muerto
durante la eclosión debido al daño en el saco vitelino.

DISCUSIÓN

En el presente estudio, desarrollamos un sistema de cultivo sin cáscara para embriones de pollo
utilizando una película plástica como recipientes de cultivo, y examinamos las condiciones
requeridas para la eclosión embrionaria comparando factores como la adición de lactato de
calcio y la presencia o ausencia de suministro de oxígeno. En lugar de una membrana de PTFE
permeable a los gases, utilizamos envoltorios de alimentos, que son baratos, fáciles de procesar
y fáciles de obtener como recipientes de cultivo. Aunque probamos varias envolturas, incluido
el polietileno y el cloruro de polivinilideno, preferimos usar una película de polimetilpenteno
debido a su alta permeabilidad al oxígeno (8,0 × 10-10 mol / m2 sPa; datos de Riken Technos).
Es importante eliminar las arrugas cuando se produce un recipiente de cultivo porque la
presencia de arrugas en la película conduce a tasas de supervivencia más bajas (datos no
mostrados).

En nuestro estudio, los embriones fueron preincubados dentro de la cáscara del huevo hasta el
día 3 y la cáscara del huevo se rompió para transferir los embriones al recipiente artificial,
correspondiente al sistema III de Perry. El período de preincubación hasta la transferencia de
embriones al recipiente de cultivo influyó en la viabilidad en el día 8 de cultivo, así como en la
transferencia exitosa de embriones al recipiente de cultivo. La transferencia de embriones al
recipiente de cultivo se consideró óptima el día 3 (Rowlett y Simkiss, 1987; Borwornpinyo et
al., 2005). En el presente estudio, diferentes períodos de preincubación de huevos entre 48h y
56h mostraron efectos variables sobre la viabilidad.

Significativamente mayor viabilidad obtenida con 55-56 h de preincubación (Etapa 16). En

nuestro experimento preliminar, la membrana vitelina a menudo se dañó cuando el embrión se
transfirió al recipiente de cultivo después de 56 h (Etapa 17).

Después de 60 h, fue difícil transferir el embrión al recipiente de cultivo al romper la cáscara

del huevo debido al riesgo de daño a la membrana vitelina (datos no mostrados).

Un estudio previo de Kamihira et al. (1998) utilizando codornices mencionaron que el lactato
de calcio fue altamente efectivo en el éxito de los cultivos de embriones aviares. En nuestro
sistema de cultivo, la adición de lactato de calcio también fue efectiva para el desarrollo
embrionario, y la viabilidad de los embriones se convirtió en la más alta cuando se agregaron
250-300 mg de lactato de calcio (datos no mostrados). Por lo tanto, la suplementación de calcio
a los embriones es esencial para los cultivos sin cáscara, ya que los embriones de pollo normales
dentro de las cáscaras de huevo reciben la mayoría del calcio de la cáscara del huevo durante el
desarrollo embrionario para eclosionar (Rowlett y Simkiss, 1987; Kamihira et al., 1998).
Creemos que la cantidad de lactato de calcio suministrada a los embriones en el cultivo fue
suficiente para el requisito mínimo para que el desarrollo embrionario eclosione, aunque aún
son necesarios más estudios para comprender la disponibilidad embrionaria de calcio.

Nos preocupaba que la aireación del vaso artificial pudiera causar la pérdida de humedad de los
embriones por transpiración. En consecuencia, primero añadimos 2,5-3 ml de agua destilada
esterilizada.