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CURSO: Licenciatura em Química

DISCIPLINA: Bioquímica I
Profa.Dra. Maria de Lourdes Corradi da Silva

5ª Aula prática

HIDRÓLISE ÁCIDA E ENZIMÁTICA DE UM POLISSACARÍDEO

Objetivos:
 Demonstrar que um polissacarídeo (amido) pode ser hidrolisado com a produção de
açúcares redutores.
 Verificar os diferentes tipos de catálise: por ação de ácido e enzima específica (
amilase salivar).
 Verificar através de reações específicas o desaparecimento do amido e o concomitante
aparecimento de açúcares redutores durante o curso da hidrólise.
 Elaborar curvas de tempo para a hidrólise ácida como para a enzimática, através da
dosagem de açúcares redutores formados.

1. Curva de calibração para dosagem de açúcar redutor pelo método 3-5-di-nitro-

salicilato. (Obs. O princípio do método para dosagem de açúcares redutores pelo DNS,
está descrito na prática de cinética da invertase).
Sensibilidade = 1 a 20  moles ou 0,18 mg a 3,6 mg

Numerar 6 tubos de ensaio de 1 a 6 e preparar uma curva padrão conforme descrito no

quadro abaixo:

Solução padrão Água Reativo Leitura da

Tubo
Glucose (2mg/mL) destilada (mL) DNS (mL) Abs.(nm)
1(branco) -- 1,5 1
2 0,1 mL (0,2 mg) 1,4 1
3 0,2 mL (0,4 mg) 1,3 1
4 0,4 mL (0,8mg) 1,1 1
5 0,8 mL (1,6 mg) 0,7 1
6 1,0 mL (2,0 mg) 0,5 1

Aquecer em banho-maria fervente por 5 minutos (o aquecimento acelera a reação de

redução do açúcar). Resfriar os tubos e acrescentar a cada tubo 7,5 mL de água destilada,
homogeneizando-os bem. Ler em 540 nm e anotar as absorbâncias. Traçar um gráfico
colocando as concentrações na abcissa e as absorbâncias na ordenada.
Obs: Quando se faz o padrão em triplicata em vez de traçar o gráfico, pode-se calcular a
concentração da amostra de açúcar redutor, utilizando-se uma das concentrações do padrão,
e aplicando-se a fórmula:

Aamostra/ Apadrão = Camostra / C padrão

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2. Hidrólise ácida do amido

Por aquecimento de uma solução de amido em presença de HCl, ocorre hidrólise das
ligações glicosídicas. Em função do tempo de hidrólise são encontrados como produtos
intermediários dextrinas e oligossacarídeos, sendo o produto final da hidrólise ácida a
glucose. As dextrinas, dependendo do seu tamanho e complexidade molecular,
desenvolvem diferentes colorações com o iodo: as dextrinas maiores podem dar cor azul ou
púrpura, as de tamanho intermediário dão coloração avermelhada e as menores não
desenvolvem cor, em presença do iodo.
A reação de hidrólise do amido pode ser acompanhada pela reação com 3-5-di-nitro-
salicilato ou outros reagentes para dosagem dos açúcares redutores, que são produzidos na
hidrólise.

Reativos:
 Solução de amido a 1%.
 Solução de lugol: iodo 1 grama : iodeto de potássio 5 g, e água destilada para completar
100 mL.
 Reativo do 3-5-di-nitro-salicilato (DNS): dissolver por aquecimento 5 gramas de ácido
3-5-di-nitro-salicilato em 100 mL de NaOH 2M. Separadamente dissolver também com
aquecimento 150 g de tartarato duplo de sódio e potássio em 250 mL de água destilada.
Misturar as duas soluções e completar o volume para 500 ml com água destilada.
 Solução padrão de glucose: 2 mg/mL.
 HCl 1:1 (50% v/v).

Técnica:
1. Preparar duas baterias com 7 tubos de ensaio, identificando cada bateria como Branco,
T0, T5, T10, T20, T40, T50. A primeira bateria será utilizada para o teste do iodo, portanto
deve-se colocar em cada tubo 3 gotas de lugol e 10 mL de água destilada.
A segunda bateria será utilizada para dosagem de açúcares redutores e deverá conter 1,3
mL de água destilada e 1,0 mL de reativo DNS. Essas duas baterias estão então preparadas
para receber as alíquotas de 0,2 mL referentes aos tempos desejados de hidrólise, conforme
a tabela abaixo:

TUBO 1 2 3 4 5 6 7

Tempo
(branco) 0 5 10 20 40 50
(em minutos)
Teste do iodo (indicar
a intensidade da cor) BRANCO
(leitura visual)
dosagem de açúcar
redutor BRANCO
(Leitura em 540 nm)
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2. Após as baterias prontas, colocar 5 mL de solução de amido em um tubo de ensaio seco

e limpo e levá-lo a um banho-maria fervente. Deixar 5 minutos para homogeneizar a
temperatura.

3. Retirar o tubo (contendo a solução de amido) do banho-maria e adicionar 0,2 mL

de ácido clorídrico. Misturar e imediatamente retirar 0,2 mL para o teste do iodo e 0,2
mL para o teste de açúcares redutores, transferindo esses volumes para tubos
previamente identificados como tempo zero ( T0 ) da reação.

4. Imediatamente após a retirada das alíquotas do tempo zero, recolocar o tubo de hidrólise
no banho fervente e mantê-lo no banho até o final do experimento, com a pipeta dentro do
tubo. Em seguida, nos tempos 5, 10, 20 ,40 e 50 minutos de hidrólise, retirar novas
alíquotas de 0,2 mL para os testes de iodo e 0,2 mL para dosagem de açúcar redutor,
transferindo as alíquotas para os respectivos tubos de ensaio previamente identificados.
Após a retirada de todas as alíquotas, aquecer os tubos referentes à segunda bateria
(dosagem para açúcares redutores) em banho-maria fervente por 5 minutos. Resfriar os
tubos, acrescentar 7,5 mL de água destilada a cada tubo, homogeneizar bem e ler a
absorbância em 540 nm.

5. Calcular a quantidade de açúcar redutor formado (em mg de glucose) no curso da

hidrólise, preencher a tabela abaixo, e traçar um gráfico, colocando mg de glucose na
ordenada e na abcissa o tempo da hidrólise.

6. Interpretar os resultados.

3 Hidrólise enzimática do amido

As amilases são enzimas que catalisam a hidrólise do amido e estão amplamente
distribuídas na natureza:  amilase da saliva e do suco pancreático,  amilase do malte, 
amilases de fungo etc. A classificação das amilases é feita de acordo com o seu modo de
ação sobre o amido, ou seja, as -amilases são endo-enzimas, isto é, atuam ao acaso e pelo
interior da molécula de amido; as  e  amilases são exoenzimas, atuam a partir das
extremidades não redutores do amido. A  amilase, salivar e pancreática, catalisa a
hidrólise das ligações glicosídicas  (14) do amido (amilose e amilopectina) e do
glicogênio, produzindo na clivagem inicial oligossacarídeos de 6 ou 7 unidades de glucose,
que são posteriormente degradados a maltotriose e maltose.
A maltose não sofre ação da enzima. A glucose pode aparecer entre os produtos
finais de reação, desde que o tempo de ação da enzima sobre o amido seja prolongado.
Sendo o amido constituído de um polímero linear de glucose, contendo ligações  (14) e
 (16) (amilopectina), e sendo a amilase uma enzima específica para as ligações 
(14), sua ação sobre o amido, irá produzir também oligossacarídeos resistentes a ação
enzimática devido a presença das ligações  (16).
A reação de hidrólise é acompanhada ou pela degradação dos polissacarídeos ou
pelo aumento do poder redutor, utilizou-se respectivamente a reação com iodo e com o 3-5-
di-nitro-salicilato, já descritas para a hidrólise ácida.
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Reativos:
 Solução de amido 1%
 Solução de lugol
 Reativo do 3-5-di-nitro-salicilato
 Saliva (mistura de 2 ou 3 doadores) diluída de 1:2 ou 1:10 com NaCl 5 mM

Técnica:

1. Preparar duas baterias com 7 tubos de ensaio, identificando cada bateria como Branco,
T0, T5, T10, T20, T40, T50. A primeira bateria será utilizada para o teste do iodo, portanto
deve-se colocar em cada tubo 3 gotas de lugol e 10 mL de água destilada.
A segunda bateria será utilizada para dosagem de açúcares redutores e deverá conter 1,3
mL de água destilada e 1,0 mL de reativo DNS. Essas duas baterias estão então preparadas
para receber as alíquotas de 0,2 mL referentes aos tempos desejados de hidrólise, conforme
a tabela abaixo:

TUBO 1 2 3 4 5 6 7

Tempo
(branco) 0 5 10 20 40 50
(em minutos)
Teste do iodo (indicar
a intensidade da cor) BRANCO
(leitura visual)
dosagem de açúcar
redutor BRANCO
(Leitura em 540 nm)

2. Após as baterias prontas, colocar 5 mL da solução de amido a 1% em um tubo de ensaio

seco e limpo e levá-lo a um banho-maria a 37ºC. Deixar durante 5 minutos para
homogeneizar a temperatura.

3. Retirar o tubo (contendo a solução deamido) do banho-maria e adicionar 0,2 mL

de saliva diluída. Misturar e imediatamente retirar 0,2 mL para o teste do iodo e 0,2
mL para o teste de açúcares redutores, transferindo esses volumes para tubos
previamente identificados. Esse é o tempo zero ( T0 ) da reação.

4. Imediatamente após a retirada das alíquotas do tempo zero, recolocar o tubo de hidrólise
no banho-maria a 37ºC e mantê-lo neste banho até o final do experimento, com a pipeta
dentro do tubo. A seguir, nos tempos de 5, 10, 20, 40 e 50 minutos de hidrólise, retirar
novas alíquotas de 0,2 mL para os testes de iodo e 0,2 mL para dosagem de açúcar redutor,
transferindo as alíquotas para os respectivos tubos de ensaio previamente preparados e
identificados.
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Após a retirada de todas as alíquotas, aquecer os tubos referentes à segundo bateria

(dosagem para açúcares redutores) em banho-maria fervente por 5 minutos. Resfriar os
tubos, acrescentar 7,5 mL de água destilada a cada tubo, homogeneizar bem e ler a
absorbância em 540 nm.

5. Calcular a quantidade de açúcar redutor formado (em mg de glucose), no curso da

hidrólise, preencher a tabela abaixo e traçar um gráfico colocando mg de glucose na
ordenada e o tempo de hidrólise na abcissa.

6. Interpretar os resultados.