Informe de Laboratorio

BIOQUÍMICA

UNIVERSIDAD PERUANA LOS ANDES

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESIONAL DE PSICOLOGIA

INFORME DE LABORATORIO

BIOQUÍMICA

TEMA:
Cinética Enzimática

DOCENTE:
Q.F. Achishka Fernández Palomino

ESTUDIANTE:

HUARI EUFRACIO JORGE

Semestre 2019 – I

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I. INTRODUCCIÓN

El término cinética enzimática implica el estudio de la velocidad de una reacción

catalizada por una enzima y los efectos que pueden tener factores como los
inhibidores. Uno de los principales estudios que se realizan en una enzima es medir el
efecto en la velocidad de la reacción cuando se modifican las concentraciones del
sustrato y se mantienen constantes la concentración de enzima, el pH, la fuerza iónica
del medio, la temperatura, entre otros. Se evalúa la influencia de estos factores en la
reacción catalizada por enzimas con la finalidad de determinar los intermediarios en
una reacción y el papel que juegan en la reacción enzimática, es decir, para predecir
mecanismos de reacción.

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II. MARCO TEÓRICO

LAS ENZIMAS

Las enzimas son biomoléculas especializadas en la catálisis de las reacciones

químicas que tienen lugar en la célula. Son muy eficaces como catalizadores
ya que son capaces de aumentar la velocidad de las reacciones químicas
mucho más que cualquier catalizador artificial conocido, y además son
altamente específicos ya que cada uno de ellos induce la transformación de un
sólo tipo de sustancia y no de otras que se puedan encontrar en el medio de
reacción.

FACTORES QUE AFECTAN A LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Diferentes factores ambientales pueden afectar a la actividad enzimática.

Destacaremos dos: el pH y la temperatura.

EFECTO DEL Ph

El pH es otro factor que influye en la actividad enzimática, debido a que el pH influye

en la ionización de los grupos funcionales de los aminoácidos que forman la proteína
enzimática. Cada enzima realiza su acción dentro de un determinado intervalo de pH,
dentro de este intervalo habrá un pH óptimo donde la actividad enzimática será
máxima. Por debajo del pH mínimo o por encima del pH máximo el enzima se inactiva
ya que se desnaturaliza. En la mayoría de las enzimas el pH óptimo está próximo a la
neutralidad, aunque hay excepciones.

La mayoría de los enzimas presentan un pH óptimo para el cual su actividad es

máxima; por encima o por debajo de ese pH la actividad disminuye bruscamente.

Este efecto se debe a que, al ser los enzimas de naturaleza proteica, al igual que otras
proteínas, se desnaturalizan y pierden su actividad si el pH varía más allá de unos
límites estrechos. De ahí la conocida importancia biológica de los sistemas tampón.

En la mayor parte de los casos el pH óptimo está próximo a la neutralidad, en

consonancia con el pH intracelular, pero existen enzimas con pH óptimo muy diverso
según sea el pH del medio en el que habitualmente actúan (los enzimas proteolíticos
del jugo gástrico tienen pHs óptimos próximos a 2 ya que este es el pH de dicho jugo).
Por último existen algunos enzimas a los que el pH no afecta en absoluto.

EFECTO DE LA TEMPERATURA

Al igual que ocurre con la mayoría de las reacciones químicas, la velocidad de las
reacciones catalizadas por enzimas se incrementa con la temperatura. La variación de
la actividad enzimática con la temperatura es diferente de unos enzimas a otros en
función de la barrera de energía de activación de la reacción catalizada. Sin embargo,
a diferencia de lo que ocurre en otras reacciones químicas, en las reacciones
catalizadas por enzimas se produce un brusco descenso de la actividad cuando se
alcanza una temperatura crítica. Este efecto no es más que un reflejo de la
desnaturalización térmica del enzima cuando se alcanza dicha temperatura.

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La Temperatura influye en la actividad enzimática. En general por cada 10ºC que

aumente la temperatura la velocidad de la reacción aumenta de 2 a 4 veces. Esta
regla se cumple hasta que la temperatura alcanza un valor máximo (T° óptima) donde
la actividad es máxima. Esto se debe a que al aumentar la T° aumenta el movimiento
de las moléculas y, por tanto aumenta la probabilidad de encuentro entre el S y el E.

Si la T° aumenta por encima de la T° óptima, disminuye e incluso cesa la actividad

enzimática debido a que la enzima se desnaturaliza. Cada enzima posee una T°
óptima, en las enzimas humanas suele estar alrededor de 37ºC. Los animales
poiquilotermos debido a que carecen de mecanismos para regular la Tª corporal, se
ven obligados a hibernar en la estación fría pues la actividad de sus enzimas debido a
las bajas temperaturas es muy baja.

INHIBIDORES
Son compuestos químicos que se unen al enzima, en distintos puntos del mismo y
disminuyen o incluso impiden su actividad. Estos compuestos pueden ser de distintos
tipos: iones, moléculas orgánicas y a veces el producto final de la reacción. A la acción
que realizan se la denomina inhibición. La inhibición puede ser:

·Inhibición irreversible: Cuando el inhibidor impide permanentemente la actividad

enzimática, bien porque se une de forma permanente con grupos funcionales
importantes del centro activo o bien porque altera su estructura. A estos inhibidores se
les denomina venenos y a la inhibición que realizan se la denomina envenenamiento
del enzima. Ej. La penicilina que inhibe las enzimas que sintetizan la pared bacteriana.
El ión cianuro actúa sobre la citocromo oxidasa (enzima respiratorio).

·Inhibición reversible: El inhibidor se une al enzima de forma temporal mediante

enlaces débiles e impide el normal funcionamiento del mism, pero no la inutiliza
permanentemente.

Puede ser de dos tipos:

Competitiva: El inhibidor es similar al sustrato y se puede unir al centro activo del

enzima impidiendo que lo haga el sustrato. Es decir ambos, inhibidor y sustrato
compiten por unirse al centro activo del enzima. La acción suele anularse aumentando
la concentración del sustrato

No competitiva: El inhibidor no compite con el sustrato, puede actuar de 2 formas:

-Sobre el enzima, uniéndose a el en un lugar diferente al centro activo y modificando

su estructura lo que dificulta que el enzima se pueda unir con el sustrato.
-Sobre el complejo E-S uniéndose a él y dificultando su desintegración y por lo tanto la
formación de los productos.

Ensayos enzimáticos

Un ensayo enzimático es un procedimiento, llevado a cabo en un laboratorio, mediante

el cual se puede medir la velocidad de una reacción enzimática. Como las enzimas no
se consumen en la reacción que catalizan, los ensayos enzimáticos suelen medir los
cambios experimentados bien en la concentración de sustrato (que va decreciendo),
bien en la concentración de producto (que va aumentando). Existen diversos métodos

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para realizar estas medidas. La espectrofotometría permite detectar cambios en la

absorbancia de luz por parte del sustrato o del producto (según la concentración de
estos) y la radiometría implica incorporación o liberación de radiactividad para medir la
cantidad de producto obtenido por tiempo. Los ensayos espectrofotométricos son los
más utilizados, ya que permiten medir la velocidad de la reacción de forma continua.
Por el contrario, los ensayos radiométricos requieren retirar las muestras para
medirlas, por lo que son ensayos discontinuos. Sin embargo, estos ensayos son
extremadamente sensibles y permiten detectar niveles muy bajos de actividad
enzimática. También se puede utilizar la espectrometría de masas para detectar la
incorporación o liberación de isótopos estables cuando el sustrato es convertido en
producto.

Los ensayos enzimáticos más sensibles

utilizan láseres dirigidos a través de un
microscopio para observar los cambios
producidos en enzimas individuales
Curva de saturación de una
cuando catalizan una reacción. Estas reacción enzimática. La pendiente
representa, en el período inicial, la
medidas pueden utilizar cambios
velocidad de la reacción. La
producidos en la fluorescencia de ecuación de Michaelis-Menten
describe cómo va variando la
cofactores que intervienen en el
pendiente con la concentración de
mecanismo de catálisis o bien unir sustrato o de enzima. (Standard RF,
MedicalRF.com/Corbis. ©1999)
moléculas fluorescentes en lugares
específicos de la enzima, que permitan
detectar movimientos ocurridos durante la catálisis. Estos estudios están dando una
nueva visión de la cinética y la dinámica de las moléculas individuales, en oposición a
los estudios de cinética enzimática tradicionales, en los que se observa y se mide el
comportamiento de una población de millones de moléculas de enzima.

En la figura de la derecha se puede observar la típica evolución de una curva obtenida

en un ensayo enzimático. Inicialmente, la enzima transforma el sustrato en producto
siguiendo un comportamiento lineal.

A medida que avanza la reacción, se va agotando la cantidad de sustrato y va

disminuyendo la cantidad de producto que se genera por unidad de tiempo (disminuye
la velocidad de la reacción), lo que se manifiesta en forma de curva asintótica en la
gráfica. Dependiendo de las condiciones del ensayo y del tipo de enzima, el período
inicial puede durar desde milisegundos hasta horas. Los ensayos enzimáticos suelen
estar estandarizados para que el período inicial dure en torno a un minuto, para llevar

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a cabo las medidas más fácilmente. Sin embargo, los modernos equipos de mezcla
rápida de líquidos permiten llevar a cabo medidas cinéticas de períodos iniciales cuya
duración puede llegar a ser inferior a un segundo.

III. OBJETIVOS

 Identificar la presencia de ovoalbúmina en el huevo

 Determinar la cantidad de desnaturalización de la proteína en el huevo

IV. MATERIALES Y REACTIVOS

Materiales
 Huevo
 Piseta
 Tubos
 Cocinilla
 Incubadora
 Papel filtro
 Látex de oje
 Pipeta
 Gradilla
 Vaso de precipitación 250 ml
 Balanza analítica

Reactivos

 Solución de almidón al 1%, solución de yodo en yoduro de potasio (Lugol),

buffer fosfato –citrato 0,1M con pH 5,6;6,4;7,2;8,0.

V. DESCRIPCIÓN DE LA PRÁCTICA

 Incubar por 15 minutos 37°C

 Leer el espectrómetro a 570 mm
 F = 5,9 g/dl
Standa leido
 Valores referenciales: 6,1 – 7.9 g/dl
 Incubar por 10 minutos a 28°C
 Leer es espectrofotómetro a 625 cm

VI. RESULTADOS

I. RESULTADOS

1. COAGULACION DE LAS PROTEINAS

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En el primer tubo hay formación de tres capas

En el segundo tubo Sistema difásico, el huevo se sedimenta, poca
coagulación de proteínas.
En el tercer tubo alta coagulación de proteínas del huevo.

2. ADICION DE SACAROSA

Tubo “A” Sacarosa al 50% + clara de huevo

Tubo “B” clara de huevo + agua destilada
Al agregarle sacarosa y agua destilada al tubo A y B ya contenido con clara de huevo,
se observa que en ambos presentas dos fases: el tubo A se observa que la sacarosa
se encuentra al fondo del tubo y la clara de huevo en la superficie, pero en el tubo B se
observa lo contrario la clara de huevo se ubica en el fondo del tubo y el agua destilada
en la superficie.
Se mide con un termómetro la temperatura del agua a 40°C exactamente.
Se le adicionan ambos tubos y se observa minuciosamente cuál de los dos se va
opacando más rápido: así mismo medimos los tubos u observamos a que temperatura
pasó este cambio. Se observó que el tubo A se opacó rápidamente y el tubo B demoro
un poco más y no se opacó completamente.
Rst: es evidente la desnaturalización de las proteínas del huevo y su respectiva
coagulación al ser sometidas a diferentes reacciones.

3. FACTOR PH

Tubo A: Solo 5 ml de la yema de huevo obtuvimos un PH de PH= 6.17

Tubo B: La yema de huevo más 2 ml de limón. PH = 3.26

Tubo C: La yema de huevo más 2 ml de solución de bicarbonato. PH = 7.16

4. PRUEBA DE BIURET

Resulta un color violeta cuando los iones cúpricos en medio alcalino se

compleja con los electrones no saturados de los átomos de nitrógeno y
oxígeno. La cantidad de color producido es proporcional a la concentración
de proteínas y es medida espectrofotométricamente.

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5. PRUEBA DE LA DESNATURALIZACION DE LA CASEINA

Después de agregar las sustancias a cada vaso notamos en una de ellas

que se vuelve color amarillento y el otro en su color casi normal.
Los diferentes colores demuestran la desnaturalización de las proteínas

VII. CUESTIONARIO

¿Qué es la enzima?
 Proteína soluble producida por las células del organismo, que favorece
y regula las reacciones químicas en los seres vivos.

¿Clasificación de las enzimas?

 Oxidorreductasas. Catalizan reacciones de óxido-reducción, o sea,

transferencia de electrones o de átomos de hidrógeno de un sustrato a otro.
 Transferasas. Catalizan la transferencia de un grupo químico específico
diferente del hidrógeno, de un sustrato a otro. Un ejemplo de ello es la
enzima galactoquinasa.
 Hidrolasas. Se ocupan de las reacciones de hidrólisis (ruptura de
moléculas orgánicas mediante moléculas de agua). Por ejemplo, la lactasa.
 Liasas. Enzimas que catalizan la ruptura o la soldadura de los sustratos. Por
ejemplo, el acetato descarboxilasa.
 Isomerasas. Catalizan la Inter conversión de isómeros, es decir, convierten
una molécula en su variante geométrica tridimensional.
 Ligasas. Estas enzimas hacen la catálisis de reacciones específicas de unión de
sustratos, mediante la hidrólisis simultánea de nucleótidos de trifosfato

¿Qué es el cofactor y la coenzima?

 Un cofactor es un componente de tipo no proteico que complementa a
una enzima.
 Una coenzima es un tipo de cofactor; es un cofactor orgánico no
proteico que se requiere junto con la proteína enzimática para que
tenga lugar la reacción enzimática.

¿Cuál es el pH y la temperatura optima de la pepsina?

 La pepsina del estómago actúa a pH ácido.
 Temperatura optima 35°C

CONCLUSIONES

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 La temperatura es un factor determinante en las reacciones enzimáticas

porque acelera o retarda la acción de las enzimas, lo que se evidencia con
la producción de burbujas.
 A lo largo de la experiencia pudo evaluarse experimentalmente como las
condiciones del medio afectan el poder catalítico de una enzima. En las tres
primeras etapas pudo determinarse cuales son los parámetros de acidez,
temperatura y concentración más apropiados.
 Mediante la variación de concentración inicial de sustrato pudo observarse
como varía la actividad enzimática
 Para que la catalasa funcione correctamente debe tener un ph neutro y
temperatura ambiente.
 La velocidad enzimática se ve influenciada por la cantidad de enzima
presente en solución. La gráfica que se produce como consecuencia de la
aparición de eritrodextrinas del almidón genera una recta de pendiente
positiva, lo cual permite pensar que a medida que la concentración de la
enzima es mayor el tiempo que se necesita para transformar el sustrato en
producto es mucho menor (al graficar 1/t vs concentración).

BIBLIOGRAFÍA

 AGUIRRE OBANDO, O.A.; MORALES ÁLVAREZ, E.D.: Reconocimiento de

carbohidratos. Visitar Web: Universidad de Quindio, Facultad de Educación.
Consulta 27 de julio de 2010.
 ANÓNIMO (1988): Fehling (Germán). Enciclopedia Universal Ilustrada
Europeo-Americana, 23, 560. Madrid, Espasa-Calpe.

ANEX
OS

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