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UNIVERSIDAD NACIONAL DE UCAYALI

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS


ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
CURSO: BIOTECNOLOGIA AGROINDUSTRIAL

PRACTICA Nº 3
ENZIMAS
OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Detectar la presencia o ausencia de actividad enzimática en saliva (actividad amilolítica) y en


jugo de piña (actividad proteolítica).

 Determinar el valor de la actividad enzimática variando algunos parámetros que la afectan


(pH, temperatura).

Si en un extracto biológico se desea establecer la presencia de una determinada proteína con


actividad biológica, tal como una enzima, no basta con determinar la existencia de dicha proteína,
sino que se requiere un ensayo que pruebe que la misma es biológicamente funcional. Cuando la
actividad biológica es específica (como ocurre en el caso de las enzimas) resulta innecesaria la etapa
de purificación, ya que la actividad biológica será evidenciable aún en presencia de otras proteínas,
aunque será necesaria la eliminación de cualquier sustancia que interfiera con su actividad.

Para medir la actividad enzimática sólo se requiere un método analítico sencillo que
determine la desaparición del sustrato o la aparición de los productos de reacción.

Enzima
S P
Sustrato Productos

Para medir la influencia del pH, de la temperatura, de la concentración de enzima, etc. sobre la
velocidad de la reacción, debe realizarse dicha reacción variando el factor en estudio y dejando
constantes todos los demás.

1. Degradación de almidón por acción de amilasa salival

Fundamento

El método se basa en la hidrólisis del almidón (sustrato), en condiciones de pH y temperatura


fisiológicos, por acción de una amilasa presente en la saliva. Los productos de reacción son
polisacáridos de menor peso molecular hasta llegar a disacáridos (maltosa), no evidenciables con
el reactivo de Lugol (pero sí con Fehling).

2. Determinación de la actividad proteolítica de las enzimas presentes en el jugo de ananá

Fundamento:

El método se basa en la hidrólisis de la caseína (sustrato) por acción de enzimas proteolíticas


(proteasas) en condiciones de pH y temperatura adecuados, obteniéndose como producto de
reacción péptidos de menor peso molecular, que no precipitan por el agregado de ácido
tricloroacético y que pueden evidenciarse por medio de la reacción del biuret.

Medida de la actividad proteolítica

Docente: Ing. James Lorenzo Silva Díaz


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CURSO: BIOTECNOLOGIA AGROINDUSTRIAL

Proteasas
CASEÍNA péptidos pequeños

La reacción se detiene por inactivación de la enzima proteolítica con ácido tricloroacético al 5%


(TCA 5%). Es necesario realizar blancos de reacción (tiempo cero de la reacción) y para ello la
enzima es inactivada con TCA 5% antes de la adición del sustrato.

La concentración de péptidos solubles en TCA formados luego de la reacción


enzimática es directamente proporcional a la cantidad de caseína hidrolizada y por lo tanto es
unmedida directa de los productos de la reacción proteolítica. Estos péptidos serán cuantificados
por la reacción del biuret. Si deseamos conocer el tipo y número de péptidos formados se debe
realizar un análisis por electroforesis.

Al detener la reacción con TCA (más aun si se defectúa a tiempos cortos) observaremos la presencia
de un precipitado que corresponde a la caseína que no ha sido hidrolizada por la enzima. Este
precipitado puede redisolverse con hidróxido de sodio al 10% y determinarse la concentración de
proteínas por el método de Bradford, lo que proporcionará una medida indirecta de la actividad
enzimática.

ENZIMAS
1. DEGRADACIÓN DE ALMIDÓN POR ACCIÓN DE LA AMILASA SALIVAL

1.1. Preparación de la solución stock de enzima

Colocar gotas de saliva diluídas en 0,5 ml de agua destilada.

1.2. Ensayo cualitativo. Detección de la atividad amilásica

 Agregar 0.5 ml de la solución stock de amilasa salival a un tubo “Lugol positivo” (solución de
almidón más Lugol, color violáceo)

 A otro tubo “Lugol positivo” agregar 0,5ml de agua destilada

 Luego de unos minutos, el tubo con saliva comenzará a cambiar de color por desaparición del
complejo almidón-yodo

 Anotar el cambio de color e interpretar los resultados.

2. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA EN JUGO DE ANANÁ

2.1. Preparación del stock de enzima.

 Se utilizará el extracto proteico (precipitado acetónico redisuelto) del jugo de ananá obtenido
anteriormente.

2.2. Medida de la actividad proteolítica


Docente: Ing. James Lorenzo Silva Díaz
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CURSO: BIOTECNOLOGIA AGROINDUSTRIAL

Protocolo para la determinación de la actividad proteolítica

 Colocar los tubos para los ensayos y el blanco, debidamente rotulados, en un baño a 37 oC

 Agregar los reactivos indicados en la tabla, en el orden indicado


Reactivo Ensayo Blanco

Muestra 0,1 ml 0,1 ml

TCA al 5% ––– 2 ml

Caseína al 1% 1 ml 1 ml

Incubar a 37 oC durante el tiempo indicado

TCA al 5% 2 ml –––

 Centrifugar los tubos a 3.000 rpm durante 10’

 Tomar 1,5 ml del sobrenadante y alcalinazarlo por agregado de 0,5 ml de OHNa 1M

 Agregar una gota de SO4Cu

 Comparar los resultados

2.2.1. Efecto del pH

Según el protocolo indicado arriba se determinará la actividad enzimática empleando como


sustrato soluciones de caseína al 1% disuelta en soluciones de diferente valor de pH (2; 7 y 11)

 Rotular cuatro tubos de la siguiente manera: “B” (para el blanco), “2” (para la solución de
caseína de pH 2), “7” (para la solución de caseína de pH 7) y “11” (para la solución de caseína de
pH 11)

 Agregar los reactivos según se indica en la tabla del protocolo

 Cortar la reacción enzimática a los cinco minutos por agregado de TCA 5%

 Continuar el desarrollo del protocolo

 Interpretar los resultados obtenidos

2.2.2. Efecto del tiempo

Según el protocolo indicado arriba se determinará la actividad enzimática empleando como


sustrato solución de caseína al 1% a pH 7, cortando la reacción a diferentes tiempos (2, 5 y 10
minutos).

 Rotular cuatro tubos: de la siguiente manera: “B” (para el blanco),y “2”, “5” y “10” para los
ensayos a los diferentes tiempos

 Agregar los reactivos según se indica en la tabla

Docente: Ing. James Lorenzo Silva Díaz


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 Cortar la reacción enzimática del tubo 2 a los dos minutos

 Cortar la reacción enzimática del tubo 5 a los cinco minutos

 Cortar la reacción enzimática del tubo 10 a los diez minutos

 Continuar el protocolo

IMPORTANTE: Es imprescindible que todo el material de vidrio utilizado se encuentre


perfectamente limpio. El lavado se realiza con detergente. Debe enjuagarse repetidas veces con
agua de la canilla para que no queden restos de detergente (interfiere en el método de
Bradford). Finalmente enjuague con agua destilada.

CUESTIONARIO DEL TRABAJO EXPERIMENTAL


13) ¿Cuál es la razón para utilizar un reactivo de caracterización de hidratos de carbono (Lugol)
en la determinación de la actividad de la amilasa salival, que es una proteína?

14) ¿Por qué en los ensayos en blanco de actividad proteolítica agrega ácido tricloroacético antes
de agregar el sustrato?

15) En la determinación de la actividad proteolítica del jugo de ananá usted determinó la


existencia de péptidos que han sido producidos por la hidrólisis enzimática de la caseina a través
de la reacción del biuret. ¿Es esta una medida directa o indirecta de la actividad? ¿De qué otro
modo podría realizarla?

16) ¿Qué información aporta el conocer el valor de la actividad enzimática a diferentes valores de
pH?

17) ¿Cuál es el objeto de realizar la medida de la actividad enzimática a diferentes tiempos?

[1] EC son las iniciales del Comité de Enzimas (Enzyme Committee) de la Unión Internacional de
Bioquímca y Biología Molecular.

[2] En la mayoría de las reacciones de coloración la intensidad del color producido es proporcional
a la concentración del compuesto en la muestra. Esta intensidad puede ser evaluada
espectrofotométricamente por medida de un parámetro específico: la absorbancia.

Docente: Ing. James Lorenzo Silva Díaz


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CURSO: BIOTECNOLOGIA AGROINDUSTRIAL

Actividad de la amilasa sobre el almidón


Objetivo: Verificar la actividad de la amilasa sobre el almidón a través de su
producto de hidrólisis.

Introducción
El almidón es un polisacárido muy abundante en los vegetales en los cuales se
encuentra generalmente en forma de pequeños gránulos microscópicos de estructura
cristalina. El grano de almidón está formado por amilosa y amilopectina. La
amilopectina se encuentra en la parte exterior del grano, es insoluble en agua y no da
coloración con la solución de lugol. La amilosa se encuentra en la parte interna y da
coloración violeta en presencia de lugol.
Por otro lado, la amilasa cataliza la hidrólisis del almidón, glucógeno y
dextrinas superiores en moléculas cada vez más pequeñas, en un proceso progresivo
dando como producto final el disacárido maltosa. La amilasa es una mezcla de
enzimas. En el hombre la encontramos en la boca (amilasa salival) y en el intestino
(amilasa pancreática). La amilasa pancreática se considera idéntica en su acción a la
amilasa salival. El pH óptimo para la amilasa salival es de 6.6. Cuando se encuentra
en medios con pH más ácidos o más alcalinos, la actividad de la enzima disminuye o
se inhibe por completo. La presencia de sales también modifica la actividad de esta
enzima.
En esta práctica, el avance de la hidrólisis del almidón se demostrará
siguiendo la formación del complejo con yodo el cual da una coloración violeta con
los almidones. A medida que se va efectuado la hidrólisis, el color azul va
desapareciendo y aparece un color rojizo (eritrodextrinas) y posteriormente se
observa una coloración amarilla, debida únicamente a la solución de yodo, lo que
demuestra que el almidón ha sido hidrolizado hasta maltosa.

dextrinas
almidón → almidón → superiores → acrodextrinas
soluble + + → Maltosa
molec. maltosa molec. Maltosa

Materiales y métodos
Materiales
7 Tubos de ensaye, baño maría, placa de porcelana excavada, gradilla, tres
pipetas de 1 ml, dos pipetas de 5 ml, dos pipetas de 10 ml, 3 pipeta pasteur, 1
pinzas para tubo. Almidón 1% en regulador de fosfatos 0.02 M, glucógeno 1% en
regulador de fosfatos 0.02 M, regulador de fosfatos 0.02 M, solución de NaCl 0.5
N, solución de amilasa pancreática al 1% o amilasa salival, solución de lugol.

Metodología
Prepare una serie de 7 tubos de ensayo debidamente etiquetados de acuerdo a
la siguiente tabla, utilizando 5 diluciones diferentes de enzima comercial o saliva:

Docente: Ing. James Lorenzo Silva Díaz


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FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
DIRECCION DE ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

CURSO : INGENIERIA DE FERMENTACIÓN Y ENZIMAS

Tubo No. 1 2 3 4 5 6 7
Almidón al 1% 1 1 1 1 0 0 0
(ml)
0 0 0 0 1 1 1
Agua destilada
Dejar a 37°C por 5 minutos
PREINCUBACIÓN*
Enzima al 1% o saliva Sin Dil Dil Dil Dil Dil Dil
concentrada(ml) diluir 1:5 1:10 1:20 1:5 1:10 1:20
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.
NaCl al 5% Adicionar a cada tubo una gota
INCUBACIÓN Incubar a 37°C adiferentes intervalos de tiempo
Lectura (color)
2 min
4 min
6 min
8 min
10 min
12 min
Mas tiempo

Antes de agregar la enzima y a intervalos de 1 minuto después de


adicionada, haga la prueba de gota del contenido de cada tubo con
solución diluida de yodo (lugol). Transcurridos 10 minutos, haga las
determinaciones cada dos minutos hasta que la prueba sea negativa.
Hacer las lecturas comparando con el tubo testigo.
ANOTE EL TIEMPO INICIAL Y FINAL DE LA DIGESTIÓN EN
CADA TUBO.
En el reporte (Resultados) indique el tiempo necesario para que la
reacción sea completa en cada tubo y calcule las Unidades de Amilasa
en cada tubo, definiendo
una Unidad de amilasa como: “número de mililitros de solución de
almidón al 1% que
pueden ser hidrolizados en 30 min, por 1 ml de extracto puro, en
condiciones de pH y temperatura que se haya trabajado.

Cuestionario
1. Haz los cálculos para determinar las unidades
de amilasa.
2. Explique ¿como demostraste que el almidón fue totalmente
transformado en sus subproductos al reaccionar con la amilasa?
3. Que son las Unidades (enzimáticas). Todas son iguales o varían con
el tipo de sustrato que usas?.
4. Como afecta el NaCl en la actividad de la amilasa?.
5. En el ser humano, donde podemos encontrar amilasa?
6 Ing. James L. Silva Díaz
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DIRECCION DE ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

CURSO : INGENIERIA DE FERMENTACIÓN Y ENZIMAS


6. Cual es el pH en el cual la actividad de la amilasa es óptima?.
7. Haga un esquema de la estructura de amilosa y de amilopectina
8. Describa un método para determinar azúcares reductores.

Bibliografía
1. Wilson, K., and Walker, J. 2000. Principles and Techniques ofpractical
Biochemistry. Fifth edition. Cambridge University Press.
2. Robert, JF., and White B.J. 1990. Biochemical techniques theory and
st
practice. 1 edition. Waveland Press, Inc. USA.
3. Voet, D., and J.G. Voet. 1995. Biochemistry. Second Edition.
John Wiley & Sons, Inc. U.S.A
4. Mathews, C.K., van Holde K.E. and Ahern K.G. 2000.
Biochemistry. Third edition. Addison Wesley Longman Inc. USA.
5. Stryer, L. 1995. Bioquímica. Cuarta edición. Editorial Reverte.
Barcelona España.

7 Ing. James L. Silva Díaz