“AÑO DE LA INTEGRACIÓN NACIONAL DEL RECONOCIMIENTO DE NUESTRA DIVERSIDAD

EAP:

INGENIERÍA AMBIENTAL

COLORACION GRAM Y COLORACIONES ESPECIALES

ASIGNATURA:

MICROBIOLOGIA

DOCENTE:

CORDERO AZABECHE, Jorge

Integrantes:

 Agustín baldeon Gaby

 Huisa Altamirano Deisy
 Molina vilcas Imelda
 Orellana cerrón pamela
 Sáez lanasca Ruth
 Salazar Huánuco Joel.
 Camargo Colquechagua Nehemías
SEMESTRE: V
 INTRODUCCIÓN

Para la observación microscópica de microrganismos se puede realizar por

montaje húmedo o coloraciones, estos facilitan la observación de diversas
estructuras. Los procedimientos de coloración requieren la preparación de un
tendido frotis de cultivo en bacterias o levaduras, se deja secar al aire y se realiza
su fijación por medio de calor, para evitar que la muestra sea retirada al momento
de aplicar los colorantes y otros líquidos.1Esto nos permite el reconocimiento y
observación más nítida de constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas,
cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.

En la práctica realizada empleamos diferentes métodos y reactivos para la fijación

de color en las bacterias, identificando que existen diferencias tanto estructurales
como cromáticas en diferentes especies microbianas observadas.
II.OBJETIVOS

GENERAL:
 Identificar las principales estructuras microbianas mediante coloraciones especiales.

ESPECÍFICO:
 Realizar montajes para observación microscópica de bacterias.
 Aplicar diferentes técnicas de tinción.
 Identificar esporas en el método de Wirtz- Conklin.
 Identificar capsulas en el método de tinción negativa.
 Hallar corpúsculos meta cromáticos en la saliva.
 Observar la pared celular en el Método de Robinow.
 Observar la membrana celular en el Método de Knaysi.
 Observar el núcleo en las levaduras.

III. MARCO TEÓRICO

COLORACIÓN GENERALIDADES

Debido a la naturaleza química de la célula bacteriana, su afinidad por los colorantes, su propiedad
ha sido aprovechada para estudiar los diferentes tipos morfológicos y estructuras (capsulas, esporas,
flagelos, etc.) que ayudan a la identificación de una especie o grupo en partículas. Los colorantes de mayor
aplicación son: cristal violeta, violeta de genciana, fucsina básica, safranina, azul de metileno y verde de
malaquita. Actúan mejor mediante la adición de mordientes, porque aumentan la permeabilidad de la
pared celular y membrana citoplasmática.

Tinción de Gram o coloración Gram:

Es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología para la
visualización de bacterias, que desarrolló la técnica para poder referirse a la
morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera
aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram
positiva a las bacterias que se visualizan de color violeta y Bacteria Gram
negativa a las que se visualizan de color rosa.

¿Qué es una coloración Gram, y para qué sirve?:

Se usa para diferencias característica de la bacteria el colorante (es un color
violeta casi azul), entonces esas son GRAM +. Hay otras bacterias que no
tienen casi pared celular (es muy pobre), y en virtud de eso, no retienen el colorante (y son de color
rosadito), entonces esas son GRAM.

(1)
Libro Ecología Microbiana Pj 58- 70

fundamentos de diferenciación de Gram positivo y Gran negativo:

Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram
positivas y Gram negativas Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y
se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior

Bacteria Gram negativa:

Las bacterias Gram negativas a aquellas bacterias que no se tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de
Gram, y lo hacen de un color rosado tenue: de ahí el nombre de "Gram-negativas" o también
"gramnegativos”.
Bacteria Gram-negativa. 1-membrana citoplasmática (membrana interna), 2-espacio periplasmático, 3-
membrana externa, 4-fosfolípidos, 5-peptidoglicano, 6-lipoproteína, 7-proteínas, 8-lipopolisacáridos, 9-
porinas.

Bacterias Gram positivas y Gram negativas

Otro sistema de clasificación de las bacterias utiliza las diferencias en la composición de su

pared celular. El empleo de una técnica llamada tinción de Gram pone de relieve estas
diferencias identificando las bacterias como Gram positivas y Gram negativas. Tras la tinción,
las bacterias Gram positivas retienen el tinte y se colorean de violeta, mientras que las
bacterias Gram negativas liberan el tinte y se tiñen de color rosado. Las especies

Enterobacter (Enterobacterias)
Enterobacterias, nombre común de una familia de bacterias Gram negativas que reciben este
nombre porque suelen encontrarse en el intestino de los mamíferos. Las especies que poseen flagelos son
móviles; el resto, inmóviles.
2.8 Estreptococo
Bacteria Gram positiva de forma esférica. Los estreptococos aparecen en pares o cadenas, y algunas
especies son patógenas en los seres humanos. Las infecciones estreptocócicas comprenden la faringitis, la
escarlatina, erisipelas, fiebre puerperal y algunas neumonías.
 TINCIÓN DE GRAM

Esta tinción desarrollada por el doctor Cristian Gram en 1884, es hoy la más utilizada en los laboratorios de
bacteriología y permite, de acuerdo con la estructura y grosor de la pared bacteriana, agrupar las bacterias
en gran positivas y en gran negativa. La gran positiva poseen una capa gruesa de peptidoglican y carecen de
membrana externa, mientras que la gran negativa tienen una capa más delgada de peptidoglican y poseen
una membrana externa.

Algunas bacterias se clasifican como gran variables, pues simultáneamente presentan tinción se gran
positivas y de gran negativas, aun bajo condiciones óptimas de cultivo. Sin embargo, en su estructura estas
bacterias poseen una pared de gran positivas, aunque la capa de peptidoglican es más delgada que la
mayoría de las bacterias gran positivas.

Esta tinción además, correlaciona con otras propiedades como endotoxinas, susceptibilidad a antibióticos,
sensibilidades resistencia a sales biliares, punto isoeléctrico y tención superficial.

La tinción de gran involucra varios pasos:

1. Tinción inicial: Las células con cristal violeta, el cual es el colorante primario. En este paso todas las
células se tiñen de morado.
2. Mordente: Se adiciona yoduro (lugol) que reacciona con el cristal violeta y forma un complejo
cristal violeta – yoduro. En este punto toda la célula continúan de color morado.
3. Decoloración: Se adiciona un solvente no polar, el cual actúa lavando el complejo cristal violeta –
yoduro de las células gran negativas. De manera las bacterias gran positivas continúan moradas y
las negativas quedan incoloras. Este es el paso critico de esta tinción, pues si se exagera, decolora
las gran positivas y si se hace muy débil no decolora a las gram negativas.
4. Contratincion: Se vuelve a teñir con safarina o fucsina, de manera que las bacterias gram negativas,
que habían sido decoloradas, se tiñen de rosado a fucsia según el colorante empleado; en tanto, las
bacterias gran positivas no se afectan con la contratincion y permanecen moradas debido a lo
intenso de esta coloración.

Además de una excesiva decoloración, otro factor que puede influir en que las bacterias gran positivas se
observen parcial o completamente rosadas, es la edad del cultivo; las células viejas tienden a perder su
capacidad de retener el complejo cristal violeta – yoduro y por lo tanto las bacterias se verán rosadas. Otro
factor de variabilidad podría ser condiciones de estrés durante el cultivo, que genera formas gran negativas
no viables, dentro de un cultivo de células gran positivas. (2)

)
Bacteriología General: Principios Y Prácticas de Laboratorio / Evelyn Rodríguez Cavallini
 CULTIVOS DE BACTERIAS: Descripción de cada una de las bacterias
utilizadas en el laboratorio.

ESCHERICHIA COLI: Es huésped constan te del intestino del hombre y de los

animales de sangre c aliente .por su especificidad está considerado como buen
índice de contaminación fecal .tiene el inconveniente de vivir poco tiempo en el
ambiente extraenterico, por lo que su presencia en los alimentos indica
contaminación reciente. (3)
(
Microbiología Alimentaria: Metodología Analítica para Alimentos y Bebidas /

María del Rosario Pascual Anderson,Vicente Calderón y Pascual

SACCHAROMYCES : Es un género en el reino de los hongos

que incluye muchas especies de levadura.

BACILLUS: Es un género de bacterias en forma de bastón y

gram - negativas. Son aeróbico estrictos o anaeróbicos
facultativos.

ESTAFILOCOCOS: Es un tipo de bacteria que vive o está presente en la

mucosa especialmente alrededor de la nariz, boca en muchas
superficies de la piel de los humanos y otros sin ocasionar ningún
daño.
 TINCIÓN DE NÚCLEO EN LEVADURAS

Ciertos factores citoplásmicos (que normalmente interfieren con el teñido del núcleo) deben hidrolizarse
antes de aplicar la tinción nuclear (azul de toluidina). En el siguiente experimento también se tendrá la
oportunidad de estudiar la morfología general de la2 levadura típica .En el procedimiento se incorpora el
3azul de toluina.

Levadura: Son hongos que carecen de gemación, en forma de agregados sueltos de célula independientes,
que pueden ser globosas, cilíndrica, alargadas.
Azul de toluina: Colorante que tiñe estructuras basòfilas, tales como la cromatina. (4)

(4)
http://www.e-histologia.unileon.es/1inicio/home/tecnicas.htm

TINCIÓN SIMPLE

Esto es, utilizando solo un colorante. El valor de esta

clase de tensión radica en su simplicidad y facilidad de
empleo. El frotis, previamente fijado, se cubre con un
colorante durante el tiempo adecuado, se lava el exceso
de colorante con agua y se seca el portaobjetos, los
colorantes básicos como el cristal violeta, azul de
metileno y carbolfucsina se emplean con frecuencia para
determinar el tamaño, la forma y la organización de las
bacterias (5)

(5)
Prescott Harley Klein Microbiología quinta
edición Pág. 29

Las tinciones más simples se realizan sobre

preparaciones previamente secadas. Sobre un porta con
una suspensiones de microorganismos previamente
secada y fijada, se derrama una pequeña cantidad de
una solución diluida del colorante y se mantiene el
contacto durante uno o dos minutos; a continuación se
 lava variaras veces con agua y se seca. Este tipo de preparación suele observarse con un objetivo de 100X y
aceite de inmersión. (6)

(6)
Brock biología de los microorganismos décima edición pág. 79

TINCIONES.-E l microscopio de campo claro es más útil para la observación de especímenes teñidos. Los
colorantes son compuestos químicos utilizados para aumentar el contraste existen algunos llamados:

 COLORANTES VITALES.-Que pueden añadirse directamente a una preparación en fresco; por tanto
colorean células vivas. No obstante la mayoría de colorantes son efectivos después de que los
microrganismos hayan sido fijado, es decir se encuentren murtos y adheridos al portaobjetos. Para la
fijación del calor se realiza una fina extensión de una gota d muestra líquida en el portaobjetos y se deja
secar al aire libre o sobre la llama del mechero, el calor de la llama mata las células microbianas por des se
utiliza la fijación química, ya que es menos lesiva que el calor. Para ello se añade una gota de fijador, como
acido osmótico, etc. naturalización de sus proteínas; las proteínas coaguladas unen sus células al porta. Para
las fijaciones de especímenes delicados

La fijación posee algunos inconvenientes, a menudo distorsiona la apariencia real de las células y no permite
la observación del movimiento de los microrganismos.

TIPOS DE COLORANTES
Casi todos los colorantes son sales, compuestos formados por iones cargados.

 LOS COLORANTES BÁSICOS.-son aquellos en los cuales el agente que tiñe es el ion cargado positivamente
ya que estos son los más utilizados, ya que la mayor parte de células microbianas poseen cargas débilmente
negativas en la superficie lo cual facilita su unión. Entré los colorantes más comunes se encuentran la
safranina, la fucsina básica, el cristal violeta y el azul de metileno.

 LOS COLORANTES ACIDOS.-el colorante es el ion cargado negativamente, estos colorantes se unen a las
partes de las células cargados positivamente. Sé utilizan para teñir tejidos animales infectados con
microrganismos. Entré los más frecuentes tenemos a la eosina, la fucsina acida y el rojo Congo.

TIPOS DE TINCIONES:

 TINCIONES SIMPLES.-Se usa un único colorante, de tipo básico usado solo para incrementar el contraste,
mejorando la observación de la célula completa.

 TINCIONES DIFERENCIALES.-Se utilizan para distinguir entre tipos de microrganismos, esta técnica primero
se hace con una tinción simple seguido de una de contraste en donde se usa otro colorante. Estas tinciones
son muy usados en microbiología por ej. La tinción gran y la tinción de ácido-alcohol, ambas aplicadas a
bacterias.

LA TECNICA DE TINCIONES GRAM.-

 Desarrollado por el bacteriólogo Danés Cristian Gram en 1884, clasificando las bacterias en dos grupos:

 GRAM POSITIVO.-La técnica incluye tinción primaria, decoloración y de contraste, se tiñe el espécimen de
cristal violeta añadiendo el mordiente, aplicando el agente decolorante (acetona), en donde las bacterias
retienen el colorante, añadiendo safranina proporcionándolo un color violeta más intenso. Los bacilos y
cocos gran positivos formadores de endóspora consta de siete géneros entre ellos bacillus y Clostridium
ampliamente distribuidos y son de gran importancia clínica. Ambos son bacilos y algunas especies son
móviles por flagelos periticos. Todas las especies clostridium son anaerobios y de hábitat en el suelo. Todos
los basillus realizan una respiración aeróbica y algunas anaeróbicas facultativos capaces también de
fermentar. Debido a su bajo contenido de agua, las endosporas no teñidas son fácilmente visibles al
microscopio.

 GRAM NEGATIVO.-Con esta misma técnica pierden su tinción violeta durante la decoloración y se han
teñido de rosa con el colorante en contraste. En su variedad se encuentran helicoidales, vibroides, aerobias,
microaerofilas todos los miembros crecen en mejores concentraciones de oxigeno inferiores a la del aire.
Este grupo comprende varios organismos interesantes como el compylobacter (agente causante de
diarreas), azospillirium (importantes para el mantenimiento de la fertilidad de los suelos tropicales) viven en
estrecha asociación con las raíces de las plantas. Este grupo incluye especies que afecta en gran medida a la
salud humana y a nuestro medio ambiente.

COLORACIÓN GRAM: La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado
en microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Se utiliza tanto para
poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación a la
diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color
moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella.

CORPÚSCULOS METACROMATICOS: Estas inclusiones se tiñen de rojo con algunos colorantes azules, como
el azul de metileno y se conocen también como gránulos de volutina. Se trata de una forma de reserva de
fosfato inorgánico (poli fosfato) que puede utilizarse en la síntesis de ATP. La volutina se forma
generalmente en células que crecen en ambientes ricos en fosfatos. Los corpúsculos metas cromáticas se
encuentran en algas, hongos y protozoos, así como en bacterias. Estos gránulos son bastante grandes y
característicos en Corynebacierium diphtheriae, el agente etiológico de la difteria, por lo que tienen valor
diagnóstico.
 IV. MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIALES:

Son un tipo de sujeción ajustable,

generalmente de madera, que
forma parte del equipamiento de
PINZA
laboratorio,

Es un utensilio metálico que

permite calentar sustancias,
MECHERO DE proporciona una llama caliente de
BUNSEN hasta 1500 grados centígrados.

Los alcoholes pueden ser

primarios, secundarios o
terciarios, en función del número
ALCOHOL de átomos de hidrógeno.

Nos sirve para hacer las torundas,

es decir, para cubrir y proteger las
ALGODÓN
muestras que hagamos en el
laboratorio.

Pieza o lámina rectangular de

cristal en que se coloca el objeto o
PORTA OBJETOS preparación que va a ser
observado en el microscopio.

Se aplica a la muestra para poder

observar la dicha muestra,
ACEITE DE
reflecta a la luz y se logra enfocar
INMERSIÓN
a una gran ampliación.
 Es un instrumento que permite
observar objetos que son
MICROSCOPIO demasiados pequeños para ser
vistos a simple vista.

Es un material que nos ayuda para

poder realizar las siembras
adecuadamente, tiene una punta
de alambre que cuando lo
ASA DE SIEMBRA
calentamos estamos
descontaminando.

REACTIVOS:

Solución de
toluidina 0.1%en
etanol 10%

ETANOL DE 40% Y Es un alcohol que se presenta en

DE 10% condiciones normales de presión y
temperatura como un líquido
incoloro e inflamable con un punto
de ebullición de 78 °C

KOH Es higroscópico absorbiendo agua

de la atmósfera, por lo que termina
en el aire libre
 Es el halógeno menos reactivo y
YODO
electronegativo.

V. PROCEDIMIENTOS Y RESULTADOS

1. COLORACION GRAM
PROCEDIMIENTO:

1. Desinfectamos el área de trabajo ( alcohol )

2. Esterilizamos los materiales (aza de siembra) con ayuda del

mechero.

3. Sacamos una pequeña porción de muestra de los tubos con

cultivo gram - positiva y gram - negativas.

4. Obtenida la muestra en el aza de siembra la colocamos en el

portaobjetos y realizamos el frotis y la fijación de los
diferentes cultivos de bacterias. Cada colorante que se
utilizara será de una cantidad de 2 ó 3 gotas.
5. Luego de ello cubrimos con colorante (cristal violeta) la preparación,
dejándola actuar en un periodo de un minuto.

6. Lavamos cuidadosamente con agua destilada (eliminación del exceso de

colorante).

7. Se cubre la preparación con colorante (lugol) por un minuto, con el

objetivo de aumentar la afinidad entre el colorante y las células.

8. Utilizamos el agente decolorante (alcohol – acetona) lavando con

sumo cuidado dicha preparación dejando actuar por un minuto.

9. En seguida echamos colorante de contraste (safarina). las bacterias gam

- positivas se teñirán de color azul y las gran negativas color rosa debido
a este colorante.

10. finalmente secamos la muestra al aire libre, le añadimos 2 gotas aceite

de inmersión y observamos en el microscopio con el objetivo de
inmersión (100X).
RESULTADO:

2. TINCION SIMPLE

PROCEDIMIENTO:

1. Desinfectar nuestra área de trabajo.

2. Encender el mechero y esterilizar el asa de siembra.

3. Dejar enfriar el asa de siembra para tomar la muestra de microorganismos, después

acercar el tubo hacia la muestra quitarle el tapón y flamear rápidamente la
boca del tubo, introducir el asa en el tubo y tomar cuidadosamente la
muestra.

4. Hacer el frotis y secarlo y fijarlo.

5. Cubrir con colorante /azul de metileno/ la
preparación y dejarlo actuar durante 1 minuto.

6. Lavar suavemente con agua destilada para eliminar el exceso de colorante.

7. Secar al aire y echar 2 gotas de aceite de inmersión.

8. Observar en el microscopio con el objetivo de 100X.

RESULTADOS:
  Lugo del montaje al microscopio óptimo. Observamos flagelos finos filamentos de color
rojo. Cuerpo bacteriano de color azul.

Bacillus subtilis

3. COLORACION DE CORPUSCULOS METACROMATICOS: METODO DE

LOEFFLER.
En esta parte de la coloración de corpúsculos metacromaticos realizamos la práctica donde se
pueden encontrar en muestras de saliva de humanos.

Para realizar la Seguidamente

practica de continuando con el
metacromatico con Luego de poner la procedimiento a la
la saliva primero muestra en el cubre muestra le pusimos
pusimos la muestra objeto durante 1 azul de metileno
de la saliva en el minuto. durante un minuto.
cubre objeto .

Luego de observar en el
Seguidamente a la microscopio pues vemos
Luego de eso le muestra le pusimos
enjuagamos con agua estos resultados con
aceite de cedro para puntos de color azul
destilada y le pasamos luego ser observado en
a secar por 1 minuto. claro y granulaciones.
el microscopio.
 RESULTADOS:

 En cuanto al procedimiento de la coloración de corpúsculos metacromaticos pues después de ver

en el microscopio encontramos bacillus diferidos y su color es azul claro con granulaciones y las
granulaciones son de color más oscuros pues después de haber consultado que las granulaciones
pues se debe a la alcalinidad que se presentan.

4. TINCION DE NUCLEO EN LEVADURAS

PROCEDIMIENTO:

Prepara un frotis con células de levadura con

agua de llave

seque al aire, fije la lama muy suavemente.

Bañe el porta durante un minuto con solución

etanol al 40%.

Bañe en agua de caño

Bañe la solución con KOH y dejarlo reaccionar
por una hora. Si se empieza a deshidratar
agregue KOH

Lave bien en la llave

Aplicar azul de toluidina por dos minutos.

Lave con etanol al 10% sacuda el exceso de

alcohol y seque al aire

Prepara otra porta objeto y procede solo

ahsta el segundo paso

En vez de KOH colocar azul de toluidina por 2

minutos y continué con el frotis.
RESULTADOS:

Los resultados se observaron en el microscopio con lentes de 100x.

5. Tinción de núcleo en levaduras

Los núcleos se tiñen de color azul oscuro o rosa y el citoplasma rosa claro.

El núcleo (azul oscuro o rosa)

El citoplasma (rosa claro)

 6. COLORACIÓN DE MEMBRANA CELULAR: MÉTODO DE KNAYSI
La membrana citoplasmática es de naturaleza lipoproteica y da una reacción acida uniéndose
intensamente con colorantes básicos y neutros. No obstante esta propiedad, el doble contorno de la
membrana se aprecia mejor cuando se retrae el protoplasma o cuando se trata con algún solvente
orgánico que pueda diluir las grasas y deje expuesto el contorno a la acción de los colorantes.

MATERIALES:

REACTIVOS
 PROCEDIMIENTO

Preparación para la Coloración de la Membrana Celular (BACTERIA DE BACILLUS Y E. COLI):

PRIMER Preparamos el repectivo frotis extrayendo

PASO las muestras de bacterias(Bacillus y E.Coli)

hecho ya la frotis pasamos las dos laminas

SEGUNDO con las bacterias por el ETER durante 5
PASO minutos; realizamos esto para que las
bacterias esten bien adheridas a las laminas.

TERCER
pasado los 5 minutos vertimos unas cuantas
PASO
gotas de liquido de bouin sobre ambas
muestras y la dejamos reposar 10 minutos

CUARTO
Y QUINTO
PASO
 Pasados los minutos
escurrimos ambas
muestras con agua
destilada de manera
vertical y hechando el
agua a la parte superior
de la lamina para que
este no caiga un chorro
de agua muy fuerte y la
muestra se salga.
Hecho esto ambas
muestras seguimos el
Hecho todos estos pasos
mismo procedimieto procedemos a observar
vertimos una gota de
al microscopio con el
lugol y colocamos el objetivo de 100x.
respectivo cubreobjeto
de ambas muestras de
bacterias.

RESULTADOS:

 Colocando ambas muestras en el microscopio con el objetivo de 100x.

No pudimos observar muy bien porque habíamos enjuagado mucho ambas muestras y no
se veía bien, entonces volvimos hacer el mismo procedimiento a ambas bacterias y resulta
que observamos que la membrana celular se vio un color pardo oscuro y el citoplasma
amarillo.

RECOMENDACIÓN:
 o No colocar mucho el fijador de bouin ni lugol en las láminas, porque no se podrá
observar muy bien las bacterias.

o No echar directamente a la muestra un chorro de agua con la pizeta, porque la

muestra se podría salir, para eso se debe de inclinar las láminas donde se
encuentran las muestras y echar agua desde la parte superior, para que no caiga
directamente en la muestra.

CONCLUSION:

 Esta tecnica de knaysi que utilizamos es muy escencial para este tipo de muestra ya que
nos sirvio para identificar la coloracion de membrana plasmatica de color pardo oscuro
como el citplasma de color amarillo.

VI. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

COLORACION GRAM

TINCION SIMPLE
COLORACION DE CORPUSCULOS METACROMATICOS: METODO DE LOEFFLER.
 Pues una vez realizado la practica en el laboratorio sobre el corpúsculos metacromasticos pues
observamos que se presentaba con granulaciones de color oscuro y algunos puntos claros de color
azul claro pues eso es debido a la alcalinidad que se presenta pero si un caso no presentaría las
granulaciones seria a la baja alcalinidad en la saliva pues eso es viendo desde otro punto de los
resultados.

TINCION DE NUCLEO EN LEVADURAS

VII. CONCLUSIONES

COLORACION GRAM
Concluimos que en la práctica de laboratorio pudimos identificar que la morfología de las bacterias
(escherichia coli, saccharomyces, bacillus, estafilococos) y el tipo de tinción que presenta. Las gram
positivas poseen una gruesa capa de peptidoglucano la cual impide que escape el complejo cristal
violeta – lugol. Es por ello que tiñen un color azul (escherichia coli, saccharomyces), mientras que
la capa peptidoglucano de las bacterias gram negativas es delgada y se encuentra a una
membrana externa lipidica susceptible a la decoloración con alcohol acetona; estas bacterias
teñirán de color rosa debido a la safarina (colorante de contraste)( bacillus, estafilococos).
 TINCION SIMPLE
 Con esta práctica aprendimos a realizar adecuadamente la preparación correcta de un
frotis para poder realizar posteriormente las tensiones más utilizadas para el laboratorio
de microbiología que son indispensables para el correcto estudio de los
microorganismos.

 Así mismo mediante la realización de las tinciones logramos observar la forma y

agrupación y características de las bacterias.

 La tinción simple es una herramienta muy útil en el laboratorio de microbiología así como
análisis clínicos siendo ineludible conocer su fundamento y procedimiento, para poder
tener una correcta interpretación de los datos que nos otorga la diferenciación de Gram
positiva y negativas concluimos que debido a la estructura de sus paredes celulares
tendrán o no propiedades patológicas diferentes .

COLORACION DE CORPUSCULOS METACROMATICOS: METODO DE LOEFFLER.

 En conclusión diríamos que la practica en el laboratorio sobre el corpúsculos metacromaticos nos

ayudarían a ver sobre la alcalinidad de nuestra saliva y así tendríamos que saber sobre cada uno
de nosotros pienso que es muy interesante realizarnos ese tipo de prácticas en el laboratorio.

TINCION DE NUCLEO EN LEVADURAS

Para realizar las coloraciones especiales se puede emplear diferentes métodos e instrumentos, lo
importante es que logremos el objetivo que se tiene en cada práctica, en este caso es ver las
diferentes estructuras microbianas a través de las coloraciones especiales que se puede emplear
en cada método.

Además se quiere identificar si cada muestra pertenece al grupo del Gram positivos o negativos.

TINCIÓN DE NÚCLEO EN LEVADURAS

Se observó la levadura en forma de cocos, con color azul claro.

Gram positivo

VIII. RECOMENDACIONES

COLORACION GRAM
 TINCION SIMPLE
COLORACION DE CORPUSCULOS METACROMATICOS: METODO DE LOEFFLER.
1. Se recomienda verter los líquidos reguladores de pH, NaOH (básico) y el HCl (ácido), gota a
gota para regular de manera exacta el agar y evitar accidentes con exceso de los mismos.
2. Utilizar los materiales de laboratorio con cuidado, por ser frágiles.
3. Leer la práctica y pedir orientación al docente antes de ingresar al laboratorio, para el
desarrollo correcto de la actividad.

TINCION DE NUCLEO EN LEVADURAS

x. ANEXOS

CUESTIONARIO

1. Investigue cuales son las estructuras celulares o moléculas responsables de la

tinción simple realizada. De ejemplos de otros colorantes que se podrían
utilizarse.

Una de las herramientas principales en el estudio de las células es la tinción diferencial.

Una tinción diferencial es cuando dos o más reactivos se aplican para impartir color a la
célula, mientras que una tinción simple implica la adición de un solo reactivo.las proteínas
son sustancias anfotericas que puede ionizar ya sea como ácidos o como base, Como las
proteínas constituyen la mayor parte de los sólidos en la célula ellas participan en la
mayor parte de las reacciones de teñido.

http://es.scribd.com/doc/62416626/Manual

Colorantes que podrían utilizarse:

- Azul metileno Loeffer

- Azul de lactofenol

- cristal violeta

- Safranina
- Fusina diluida

2. ¿Cuáles son las principales precauciones de manejo del microscopio y porque se

debe de utilizar el aceite de inmersión al hacer el estudio microscopio de
bacterias?

Precauciones:

 No tocar las lentes con las manos. si ocurriera limpiar suave y cuidadosamente con
papel filtro o papel de óptica.
 No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina.
 No forzar los tornillos giratorios( macrometrico,micrométrico,platina,revolver y
condensador)
 Nunca cambiar de objetivo agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras
se está observando la muestra a través del ocular.
 Mantener limpia y seca la platina del microscopio.
 Concluido las prácticas de laboratorio revisar el microscopio.

3. El aceite de inmersión se utiliza eliminar casi completamente la desviación de los

rayos de luz y se aumentar la eficacia de los objetivos de los microscopios.
Nos ayuda a enfocar objetos muy pequeños, como las bacterias individuales y
aplicaciones de alta resolución.

http://www.tecnicaenlaboratorios.com/Nikon/Info_aceite_de_inmersion.htm

4. ¿Cuáles son las ventajas o ilimitaciones de la tinción simple?

Ventajas:

La ventaja de esta técnica es su sencillez, lo que permite observar en minutos las distintas
morfologías, tamaños y agrupaciones bacterianas.

Desventaja:

La desventaja consiste en que no es posible diferenciar si en la muestra existen

microorganismos de distinta composición química.

Título Microbiología Estomatológica

Autor Negroni
Edición 2

Editor Ed. Médica Panamericana, 2009

5. ¿Cuáles son las fuentes de error más frecuentes en la preparación del frotis?

Fuentes de error:

 Precipitación del colorante en forma de agujas, por exceso de calos del

portaobjetos antes de su adicción.
 Contaminación bacteriana de los reactivos.
 Artificios coloreados, procedentes de la muestra o de suciedad del
portaobjetos.
 Mala técnica de coloración que no refleja la realidad de las características tinto
riales del microorganismo.
 Las bacterias gram positivas viejas, muertas o en contacto con antimicrobianos,
pueden parecer gram negativas por alteración de sus propiedades físicas y
químicas.
 Hay bacterias grampositivas que pierden el colorante con facilidad y pueden
aparecer gramnegativas al mismo tiempo.
 Las bacterias con tinción bipolar pueden dar lugar a confusión en su
morfología.
 Las bacterias que tiñen débilmente pueden pasar desapercibidas.
 Hay microorganismos que no se tiñen con esta tinción.

Título Microbiología clínica práctica

Autores Pedro García Martos, Fernando Paredes Salido, María Teresa Fernández del Barrio

Edición 2

Editor Servicio Publicaciones UCA, 1994

6. ¿Explica en forma completa la teoría que explica la tinción Gram. Investigue

otros dos ejemplos de tinción diferencial?
Tinción gram:
Se utiliza para diferenciar tipos de bacterias.las muestras bacterianas se extienden
sobre un porta, se tiñen con un colorante violeta, se tratan con alcohol acetona (un
 decolorante) y finalmente se contratiñen con un colorante rojo. Las bacterias
grampositivas retienen el primer colorante, y aparecen azul oscuro al microscopio,
por ejemplo las bacterias que tienen una gruesa capa de peptidoglucano en su
pared. En las bacterias gramnegativas, el alcohol acetona lava el colorante violeta y
les permite tomar la contaminación, de forma que aparezcan rojas al microscopio.
La pared celular de estas bacterias tiene una capa externa de lipoproteína sobre
una delgada capa de peptidoglucano. La tinción se denomina asi en honor del
bacteriólogo danés H. C. J. Gram (1853 – 1938), que fue quien primero describió la
técnica (después modificada) en 1884.

Ítulo Diccionario de Ciencias

Diccionarios Oxford-Complutense
Diccionario de ciencias, Domingo Agustín Vázquez

Traducido por Domingo Agustín Vázquez

Edición Ilustrada

Editor Editorial Complutense, 2000

ISBN 8489784809, 9788489784802

N.º de páginas 1128 páginas

Ejemplos:
Tinción de ácido – alcohol resistencia. (fija de modo firme solo a las
bacterias que poseen ceras en las paredes de sus células).

Título Introducción a la microbiología

Autores Gerard J. Torture, Berdell R. Funke, Christine L. Case

Edición 9

Editor Ed. Médica Panamericana, 2007

Tinción de ziehl – Neelsen (la técnica es capaz de diferenciar dos grandes

grupos de eubacteria: BAAR positivas y BAAR negativas).BAAR: bacilos
acido alcohol resistentes.
http://www.slideshare.net/josemagarinos/tinciones-diferenciales-aspectos-
tecnicos
 7. ¿Cuáles son las fuentes de error más frecuentes en la tinción Gram?

Los peores obstáculos de la Tinción, que impiden conseguir el resultado perseguido, son los
errores del técnico. Para evitarlos hay que elegir bien los reactivos y ser muy cuidadosos al
ejecutar la técnica. A continuación describimos algunas de las fuentes de error: Impurezas en los
reactivos de Tinción.
• Concentración inadecuada de los reactivos de tinción.
• pH inadecuado.
• El colorante se fija a la célula por mecanismos físico-químicos, que se alteran si el Ph no es el
apropiado.
• Los colorantes pueden ser ácidos, básicos o neutros.
• Tiempo de Tinción incorrecto.
• Temperatura suficiente.

8. ¿Cuál es la base bioquímica de la coloracion Gram?

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el
microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la
rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Estos
pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de
determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares,
centros de actividad respiratoria,

9. Si cambiara el orden de empleo de los colorantes primarios y de contraste cree

que la tinción seguiría permitiendo distinguir entre bacterias grampositivas y
gram negativas.

Si por que primero se tien que fijar la muestra

10. Existe alguna relación entre el tipo de morfología y la tinción de gram.

La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en

microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas.
 11. Qué tipo de morfología y de agrupación ha podido observar en las muestras de los
cultivos de Eschericha, Saccharomyces, Bacillus y Stafilococus.

 ESCHERICHA COLI: pertenece a la familia Enterobacteriaceae y dentro de ella al grupo

coliformes, que se caracteriza por fermentar la lactosa con producción de ácido y gas a
37°C. Además, esta bacteria es capaz de llevar a cabo dicha fermentación a 44°C. Es de
interés su investigación en alimentos por ser indicador de contaminación fecal, que
implica una mala manipulación del producto. Características estructurales y fisiológicas:

. Bacilos Gram Negativos

. Citocromo C oxidasa negativos

. Fermentadores de la glucosa

. Fermentadores de la lactosa

. Productores de indo a 44°C

. Reductores de nitratos a nitritos.

 SACCHAROMYCES: El género Saccharomyces incluye muchos tipos diferentes de levaduras

y forma parte del reino de los hongos. La incapacidad para utilizar nitratos y la capacidad
de fermentar varios carbohidratos son las características típicas de los Saccharomyces. Sus
colonias pueden crecer y madurar en 3 días y muestran un color amarillo oscuro. Muchos
miembros de este género se consideran muy importantes en la producción de alimentos.
Un ejemplo es el Saccharomyces cerevisiae, que se usa en la producción de vino, pan y
cerveza. Otros miembros de este género son: S. bayanus, utilizado para la producción de
vino y S. boulardii, usado en medicina. Más recientemente, se ha demostrado que el S.
boulardii es una subespecie del S. cerevisiae.

 BACILLUS: Algunas de estas bacterias son productoras de esporas (Bacillus, Clostridium)

resisten algunos procesos de conservación utilizados en la industria alimentaria en los que
las formas vegetativas se destruyen y son causa de alteraciones. También especies de
estos géneros provocan enfermedades alimentarias.

 STAFILOCOCUS: Especie perteneciente a la familia de micrococcaceae, microrganismo

ubicuo que se encuentra en el hombre y muchos animales como parte de la flora normal.
algunas cepas son capaces de elaborar entero toxinas aunque también es responsable de
algunas supuraciones y septicemias.
12. Indique que etapas debe de seguir para preparar una extensión de las siguientes
muestras: yogurt, saliva, una colonia bacteriana, re suspendida en agua, sedimento de un
rio.

YOGURT: Bacterias del yogurt. (A) Extensión de yogurt donde se pone de manifiesto la
presencia de bacillus lacticus con su típica morfología bacilar. (B) Aspecto de lactobacilus
observados con el microscopio electrónico de barrido. (C) Extensión de yogurt donde se
pone de manifiesto la presencia de Streptococcus lacti formando parejas (diplococos) o
cadenas (estreptococos). Las extensiones (A y C) están teñidas con azul de metileno.

SALIVA: Para preparar una extensión de saliva en el laboratorio se puede tener una
pequeña muestra o poca muestra de saliva y luego fijarlo con azul de metileno y luego con
agua destilada y una vez concluido con la practica se debe de realizar el observado en el
microscopio para luego poder identificar los microrganismos o bacterias que se encuentran
presentes.

13. ¿Cuál es la finalidad tiene fijar las muestras cuando se realiza un frotis bacteriano.

La fijación es muy importante ya que tiene por objeto provocar modificaciones en la

composición físico-químico de la bacteria de forma que esta conserve definitivamente una
estructura similar a la que tenia en vivo, sin deformarse como consecuencia de los
tratamientos a que se vera sometida durante la tinción. Pero también sabemos que la
fijación impide el arrastre de los microrganismos al quedar estos adheridos al portaobjeto y
hace que la pared celular sea más permeable a los colorantes.
 14. Señale las ventajas y desventajas de la tinción simple respecto del examen en fresco.

 VENTAJAS: La ventaja principal es que nos permite observar estructuras que en su forma
natural carecen de coloración suficiente para ser distinguidas por microscopio. Otra
ventaja es que nos permite distinguir entre diferentes tipos celulares, ya que distintas
células responden de manera diferente a las tinciones, además de que, mediante el uso de
las llamadas técnicas histoquímicas, podemos teñir un determinado tipo celular y hacer
que sólo estas células se tiñan, mientras que las otras no, así podemos seguir células que
tengan una enzima determinada o donde tenga una reacción particular que no ocurra en
otras, siempre que se usen colorantes adecuados.

 DESVENTAJAS: La principal desventaja es que, debido al tratamiento al que debe

someterse un tejido vivo para su tinción, las células acaban muriendo, con lo cual, no es
posible observar esas células activas en su estado natural, sino muertas.

15. Con los resultados de una tinción simple se puede saber si la muestra teñida es un
cultivo puro.

La tinción simple es en que se utiliza un solo colorante se utiliza azul de metileno o

safranina de naturaleza básica y pienso que la muestra si pueda que salga un cultivo puro
ya que solo se utiliza un solo tipo de colorante.

http://docencia.izt.uam.mx/gra/bioquimica1pdfs/1-1_celulas_procariontes.pdf
15. ¿Qué es una vacuola de gas? Explique su estructura y función.

Es un cuerpo de inclusión orgánico realmente extraordinario. La vacuola de gas, está

presente en muchas cianobacterias, así como en bacterias fotosintéticas purpuras y
verdes, y en algunas bacterias acuáticas como Halobacterium y Thiothrix. Estas bacterias
flotan en o cerca de la superficie, gracias a las vacuolas de gas que les confieren
flotabilidad.

Estructura:
Las vacuolas de gas son agregados de un gran número de estructuras pequeñas, huecos,
cilíndricas, denominadas. La pared de las vesículas de gas no contiene lípidos y está
compuesta únicamente por pequeñas proteínas. Concretamente, se trata de la repetición
de un único tipo proteico conformando un cilindro rígido que es hueco e impermeable al
agua, pero totalmente permeable a los gases atmosféricos. Las bacterias con vacuolas de
gas pueden regular su flotabilidad para permanecer en la profundidad necesaria para
obtener una intensidad de la luz.
PRESCOTT MICROBIOLOGÍA QUINTA EDICIÓN PÁG. 54

16. Defina quimiotaxis, carrera y giros.

La quimiotaxis se define como la capacidad que tienen ciertos microorganismos para

percibir gradientes de concentración de sustancias y a su vez dirigir su movimiento a favor
o en contra de ese gradiente. Esto les permitiría encontrar condiciones óptimas para su
crecimiento y supervivencia.

Giro carrera

17. Explique de forma general la manera en que las bacterias son atraídas por
sustancias como nutrientes, y repelidas por materiales tóxicos.

La mayoría de las bacterias se desplazan mediante flagelos, apéndices locomotores en

forma de hilos que se extienden hacia fuera de la membrana plasmática ya que un
incremento en la concentración de nutrientes facilitará una mayor interacción de PQM.
FOTOS

Fotos del laboratorio

PINSAS COCINA BURETAS

ALGODON AGUA DESTILADA VASOS PRESIPITADOS

BURETAS MUESTRAS DE YOGURT ENSENDIDO DE MECHERO

 REACTIVOS BACTERIAS COLORACION G + -

BACTERIA BASILUOS ESTERILIZACION DEL MATERIAL MUESTRAS DESINFECTADAS

PRIMERA COLORACION LIMPIEZA DE LA MUESTRA LIMPIEZA CON AGUA DESTILADA

 1 MUESTRA 2 MUESTRA 3 MUESTRA

OBSERVACION DE LA MUESTRA 4. MUESTRA 5. MUESTRA

USO DE REACTIVOS USO DE REACTIVOS FIJACION DE LA MUESTRA

bacillus
saccharomyces

1 MUESTRA BACTERIA SECADO DE LAS BACTERIAS 2 MUESTRA BACTERIA

metacromaticos

3. MUESTRA BACTERIA BACTERIA BASILUOS FIJACION DE REACTIVOS

saccharomyces
E . coli

BACTERIA – LEVADURA VERDE BACTERIA

MALAQUITA

Nucleo de la levadura E . coli

BACTERIA LEADURA MUESTRA 6 MUESTRA 7

BIBLIOGRAFÍA:

 PRESCOTT MICROBIOLOGÍA QUINTA EDICIÓN PÁG. 70

 http://docencia.izt.uam.mx/gra/bioquimica1pdfs/1-1_celulas_procariontes.pdf
 Beishir, L. “Microbiology in practice. A self-instructional laboratory course”.5ª Ed. Harper
Collins Pub. Inc., 1991.
 Case, C.L. y T.R. Johnson. “Laboratory experiments in Microbiology”. The
Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1984.
 Claus, GW. “Understanding microbes: A laboratory textbook for microbiology”. 1ª Ed.
W.H. Freeman and Co. New York, 1989.
 Collins, C.H. y P.M. Lyne. “Microbiological methods”. Butterworth & Co. (Pub) Ltd., 1985.