Proyecto: Anticuerpo monoclonal contra VIH

Actualmente hay muchas enfermedades de tipo viral difíciles de erradicar , las cuales no
cuentan con un tratamiento que sea capaz de eliminar al 100% al agente etiológico de dichas
enfermedades , una de ellas es VIH.
En la actualidad la forma más común de contagiarse de VIH es por contacto a través de
secreciones como el semen, fluidos vaginales, sangre o leche materna.
Epidemiológicamente el Centro Nacional para la Prevención y el Control del VIH y el sida ha
dado a conocer los números de pacientes los cuales cursan con diferentes estadios de la
enfermedad siendo un total de 203 mil pacientes mexicanos los infectados.
Para evitar el contagio de dicha enfermedad se han usado varios métodos , como la
abstinencia o el uso de preservativos durante la relaciones sexuales los cuales minimizan el
riesgo considerablemente , en algunas prácticas de riesgo la efectividad de estos métodos
disminuyen considerablemente..

Cuando el uso del preservativo falla y se tiene una alta posibilidad de contraer dicha
enfermedad hay fármacos que disminuyen el riesgo hasta en un 98% el contagio, sin
embargo la administración debe de realizarse días antes a la exposición , en este caso
estamos hablando de profilaxis de preexposición (PREP) o profilaxis de postexposición
(PEP), pero en este último caso (PEP) solo es para emergencias y no reemplaza el uso de
condones o PREP , de tal manera que el uso de estos antirretrovirales se tiene que hacer de
una manera pre y post exposición al VIH , esto tiene muchos inconvenientes ya que se debe
de suministrar al cuerpo de una gran cantidad de fármacos diariamente que pueden traer
como consecuencia efectos adversos como insuficiencia renal o hepatotoxicidad, enfermedad
cardíaca , neuropatías , osteoporosis o incluso diabetes. sin mencionar los casos de
hipersensibilidad a estos medicamentos .
El uso de estos antirretrovirales tiene un gran costo económico , ya que en este momento el
precio de Truvada que es uno de lo medicamentos utilizados ronda alrededor de los 9, 704
pesos mexicanos , lo cual muchas personas no tienen la solvencia económica para recurrir a
dicho tratamiento .
Ante esta situación se ha planteado la creación de un anticuerpo monoclonal específico que
sea eficaz contra VIH en diferentes niveles , desde la preexposición , postexposición e incluso
el tratamiento en general .

En la siguientes páginas se detalla la metodología experimental para crear dicho anticuerpo

el cual se ha propuesto se cree a partir de la técnica de presentación sobre fagos
filamentosos también conocida como phage display , la creación de dicho anticuerpo tiene
muchos beneficios ante esto podemos citar algunos como por ejemplo ; evitar el uso y
administración de antirretrovirales de forma continua evitando así sus efectos secundarios,
una sola aplicación cada 21 días o más dependiendo la concentración de dicho anticuerpo ,
especificidad asegurada casi del 100% contra el agente etiológico, posible eliminación de
dicha enfermedad (dependiendo el estadio) .

La manera de actuar (mecanismo de acción ) de dicho anticuerpo será proporcionado por la

especificidad contra algunos componente de la membrana viral conocido como gp120 que
es una molécula de adhesión de tipo glicoproteína con la cual cuenta VIH para interactuar
con los receptores de los linfocitos TCD4+ que infecta , debido a esta unión se efectuaran
diversos mecanismos que pueden eliminar al virus, en el caso de que el virus se encuentre
intracelularmente cumpliendo su ciclo viral , el anticuerpo tiene una vida media alrededor de
21-23 días para poderlo reconocer cuando este salga de dicha célula y poderlo eliminar
igualmente.

Imagen No 1 “ Interacción entre el virus del VIH gracias a las moléculas de adhesión
conocidas como gp120 y los receptores de los linfocitos TC4+ “

OBJETIVO
Sintetizar anticuerpos monoclonales específicos contra glicoproteínas (gp120) presentes en
la estructura viral de VIH mediante la tecnología de presentación en superficie de fagos con el
fin de servir como tratamiento pre y post exposición al agente viral o como tratamiento en
general contra este agente etiológico causante del SIDA.

METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
INMUNIZACIÓN DEL RATÓN

1-. Obtener el gen que codifica para la glicoproteína gp120 del VIH por método
enzimáticos.

2-. Insertar este gen por tecnología de recombinación genética en el DNA de un virus
de tipo filamentoso generalmente del género Inovirus.

3-.Tener en cuenta que los marcos de lectura deben de quedar cerca de los genes
que codifican para las proteínas presentes en la cápside del virus filamentoso como
pIII y pVIII

4-.Reproducir los nuevos fagos para obtener muchas copias de los mismos con
péptidos en su superficie de la inserción que se acaba de realizar
5-. Inmunizar de manera correcta con estos fagos a algún animal de laboratorio como
un ratón o un conejo para desencadenar respuesta inmunológica.

OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS
1-. Tomar sangre periférica de varios pacientes sanos.

2. Obtener los linfocitos B pertenecientes de cada persona.

3-. Crear un primer específico para los genes que codifican para las regiones pesadas
y ligeras de los anticuerpos humanos .

4-. Una vez obtenidos los genes , amplificar mediante PCR hasta obtener muchas
copias de los mismos.

5-. Recombinar todo este material genético entre cadenas ligeras y pesadas mediante
la técnica de recombinación y randomización .

6-. Clonar las diferentes combinaciones génicas obtenidas mediante la inserción de

estos genes en el ADN de los los fagos conjuntamente con los genes que codifican
para las proteínas estructurales de la cápside.

7-. Replicar estos fagos en la bacteria E. coli

8-. Una vez obtenida esta biblioteca de anticuerpos (anticuerpos en superficie),

seleccionaremos la secuencia génica que contenga el anticuerpo más afín y
específico contra el antígeno (gp120) .

9-.Esto lo realizaremos pasando todos los fagos obtenidos por una cromatografía de
afinidad en donde en la superficie cilíndrica se tiene al antígeno (gp120)

10-. Una vez que los anticuerpos se unan a su antígeno , realizar lavados para que
los anticuerpos que no se hayan adherido sean eliminados.

11-. Realizar la extracción . purificación y caracterización de los anticuerpos que si se

unieron a sus antígenos.

Selección guiada
1-. Combinar las cadenas ligeras y pesadas obtenidas tanto de la afinidad de los
anticuerpos de la cromatografía como de la inmunización de los ratones .
2., Combinar las cadenas pesadas murinas con las cadenas ligeras humanas y
viceversa .

3-. Posteriormente unir las cadenas ligeras humanas con las cadenas pesadas
humanas igualmente , para así obtener un anticuerpo totalmente humano .

4-.Ensamblar este anticuerpo con la unidad estructural del anticuerpo (Fc)

5-. Obtener la secuencia genética de este anticuerpo que es muy afín y selectivo
contra el anticuerpo elegido .

6-. Introducir esta secuencia genética en células CHO o Hela.

7., Cuantificar el anticuerpo en el cultivo celular y elegir las células que secretan gran
cantidad del mismo.

8-. Expandir el clon de células elegidas en diferentes matraces de cultivo celular de

orden y tamaño creciente.

9-. Traspasar estas células a un biorreactor y dejar que generen los biológicos.

10-. Purificar el anticuerpo e ingresarlo en un vía con solución inyectable estéril .

HACCP
1-, Establecer un equipo multidisciplinario de HACCP
2-. Describir el producto
Caja con 8 jeringas precargadas con concentración de 40 mg en 1 mL cada una de
vidrio ámbar para aplicación parenteral los cuales contienen al principio activo que
son Anticuerpos monoclonales específico contra componentes estructurales del VIH,
coadyuvante polisorbato 80 . manitol y solución estéril inyectable , con un pH de 7.2 ,
envase al vacío son la presencia de atmósfera modificada, almacenamiento de 2 a 8
° C , en caso de no contar con refrigerador o nevera puede mantenerse estable el
producto a temperatura ambiente hasta por 14 días , después de estos días
desecharlo , distribución en camiones que tengan cámara fría, vida de anaquel de 6
a 9 meses aproximadamente en perfecto estado , administración por vía parenteral
ya sea en el muslo o en el abdomen , deberá de sacar de la nevera el producto y
dejarlo de 15 a 30 minutos fuera hasta que alcance temperatura ambiente, una vez
que suceda esto lavarse las manos y tomar una toallita impregnada de alcohol , limpiar
la zona , pellizcar la piel de manera como los diabéticos se ponen insulina e insertar
la aguja en un angulo de 45°C y administrar el producto .

3-. Determinar la aplicación del sistema

Anticuerpos monoclonales específicos contra glicoproteinas gp120 pertenecientes a
VIH.

4-. Elaboración de un diagrama in situ

5-. Verificación del diagrama in situ

6-. Enumeración de todos los riesgos

Riesgos físicos.

1. Que la inmunización de los animales en una zona o región ideal para que
la activación de la respuesta inmune sea eficaz.
2.
3. Que las temperaturas en el termociclador sean las óptimas.
4.
5. Pegar el antígeno de manera estable en la superficie de la cromatografía
de afinidad
6.
7. Que todos los anticuerpos presentes en la superficie del fago tengan
interacción con el antígeno .
8.
9. Observar que la eliminación de los fagos no sea del 100% ya que nos
indicaría falta de interacción o de afinidad entre antígeno- anticuerpo .
10.
11. Que el clon elegido de las células HELA o CHO de un producto estable y
constante del anticuerpo de interés.
12.
13. Que dentro del biorreactor todas las condiciones se encuentren
estandarizadas para un buen proceso .
14.
15. Realizar de manera adecuada control de calidad al proceso y a producto
terminado con el fin de que cumpla todas las características deseadas.
16.
17. Que el medicamento sintetizado cumpla con los altos estándares indicados
según la COFEPRIS en cuanto al proceso preclínico , clínico y en la fase
de aprobación y registro .
Riesgos Químicos

Que los primers cumplan con todas las características para que sean
totalmente funcionales y específicos

Que las condiciones dentro de los termocicladores sean óptimas para la

correcta obtención del material amplificado ( DNA polinerasa, TAQ, Conc Mg,)

Que los Ph seanlos óptimos durante todas las fases yprocedimientos

Que el medio celular contenga todos los nutrientes necesarios para las células
en cuestión elegidas.

Que el envase en el cual se va a ingresar el producto esté libre de

contaminaciones, priones y pirógenos.

Realizar pruebas de mejoramiento de administración e interacción con células

blanco de acuerdo a zonas de aplicación y coadyuvantes empleados.

Riesgos Biológicos.
Que las enzimas de restricción no sean específicas para el gen del interés

Que el gen insertado en el DNA del virus filamentoso no se exprese de manera

correcta en su superficie viral

Que el marco de lectura del gen que codifica para la proteína del parásito
quede antes , después o entre los genes que codifican para ciertas proteínas
de la cápside viral como por ejemplo pIII o pVIII de los virus filamentosos

En dado caso que los marcos de lectura de los genes queden entre pVIII ,
observar si no hay fracaso , en el momento del montaje de la partícula viral ya
que suele fracasar según la literatura.

Que la proteína expresada en la cápside viral sea totalmente inmunógena, es

decir que el sistema inmune se active ante esta estructura ( que tenga los
receptores) .

Que la toma de sangre periférica a los donadores sea totalmente aséptica y

como material estéril

Que los pacientes no tengan enfermedades genéticas, infecciosas o de

cualquier índole .

Cerciorarse de que los genes amplificados sean los correctos mediante un

corrimiento en electroforesis.

Que la recombinación entre genes que codifican para cadenas pesadas y

ligeras sea eficiente y estable.

Una vez identificadas las estructuras estables, clonar este material genético e
ingresarlo mediante enzimas de restricción al DNA del fago de tal manera que
se expresan en la superficie conjuntamente con las proteínas de la cápside .

Realizar la caracterización y obtención del material genético que codifican para

los anticuerpos que se unieron al antígeno en la cromatografía.

Al unirse las cadenas ligeras humanas con las cadenas pesadas humanas ,
realizar una caracterización para constatar que este proceso se haya llevado
a cabo de manera correcta y que el anticuerpo sea 100% específico .

Identificar que los anticuerpos no contengan información de tipo murino

mediante secuenciación.
Secuenciar los genes de este anticuerpo estable e ingresar por recombinación
genética de tal modo que su expresión sea estable .
7-.Determinación de PCC

PCC LÍMITES MEDIDAS CORRECTIVAS

1-Que la glicoproteína sea Antigenicidad Elegir preferentemente las

antigénica Baja-Alta moléculas que nos den una
respuesta antigénica alta.

2-.Evitar desnaturalización de Temp. 2° C- 5°C Monitorear la temperatura en

los anticuerpo diferentes niveles de los procesos
siempre asegurándose se encuentre
en los márgenes permisibles.

3-. Preservación del Forma vida 1/2 Tomar en cuenta que la mejor
biofármaco Acuoso 2°C-4°C 1 mes
manera de mantener todas las
25-50% glicerol o 1 año
etilenglicol, -18°C--- -20°C
características del anticuerpo
intacto sería que el producto final
se encontrará liofilizado.
congelado a -20 - -80° Años

Liofilizado Años

4-.Primers específicos Temperatura de asociación - Tomar en cuenta la cantidad de

3°C- -7°C (de temp de fusión).
45% y el 55% de G/C
Oligonucleotidos 21-25
oligonucleótidos no sea muy
grande ya que va a tener poca
especificidad y por otra parte si
es muy pequeño no la tendrá en
absoluto y podría unirse a
distintas secuencias repetidas.
La cantidad de G/C deberá estar
dentro de ese rango ya que si
esta cantidad es modificada se
verá reflejada directamente en la
Tm .

Tomar en cuenta la temperatura

de fusión y respecto a esto
trabajar con distintas
temperaturas de asociación
hasta observar la que mejor se
adecúe.
 5-.Contaminación Aire 0-5UFC Podría usarse un buen sistema de
Materiales 0 UFC filtración dentro de los laboratorios
que impida la contaminación de
reactivos y materiales como filtros
HEPA.
Trabajar siempre en zonas estériles
como campanas de flujo laminar.

Monitorear qué medios de cultivo y

recipientes se encuentren
totalmente estériles continuamente.

10-.Establecimiento de procesos de verificación

Realizar procesos de verificación de acuerdo al punto PCC que se propuso anteriormente

en cada proceso de la creación del fármaco;
● En la fabricación( etapas desde proceso hasta la obtención de producto terminado)
● Pruebas de calidad en producto terminado
● Verificación en cuanto a la distribución del producto
● Precio final del producto
● SEguimiento del producto en el mercado (posibles RAMS)
●

11-.Establecimiento de un sistema de registro y documentación

Realizar sistemas de registros para cada PCC en específico , procesos y uso de
equipos para llevar a cabo un control riguroso .
Imagen No 3 “ Ejemplo de un documento de registro de materia prima necesaria para los
procesos “
REFERENCIAS
PRECIO TRUVADA
https://www.farmaciasanpablo.com.mx/medicamentos/especialidades-medicas/s---t/truvada-
30-tabletas-caja/p/000000000030370003

CASOS VIH Y SIDA 2018

https://www.gob.mx/censida/documentos/epidemiologia-registro-nacional-de-casos-de-sida

http://apps.who.int/medicinedocs/es/d/Jh1795s/3.html