ANALISIS DE ADN EN PEZ

Todas las células sanguíneas del pez, tienen núcleos, por tanto a diferencia de
las células sanguíneas del ser humano, todas posen material genético o ácido
desoxirribonucleico (ADN). En el sistema circulatorio de los peces la sangre
consiste de plasma, eritrocitos y leucocitos. Al extraerse contenido sanguíneo
de la vena cabular vía punción, se siguió un protocolo a base de un kit
comercial diseñado para la purificación de ADN total de sangre animal (con
eritrocitos nucleados o no nucleados) tanto de células animales, como de
células humanas. Los criterios básicos que debería cumplir un método para
purificar ADN de cualquier origen incluyen: (1) extracción eficiente, (2) cantidad
de ADN purificado suficiente para las subsiguientes aplicaciones, (3)
eliminación de contaminantes, (4) calidad y pureza del ADN. Los kits
comerciales disminuyen la extracción a unas cuantas horas porque reducen el
número de pasos del procedimiento y, utilizados bajo cada una de las
recomendaciones, garantizan una extracción de alta pureza ya que tanto la
recuperación del ADN como la eliminación de contaminantes son muy
eficientes (Stormer et al, 2007). Las muestras de pez se trataron con diferentes
sustancias que permitieron inactivar las enzimas presentes y favorecer la
liberación del ADN. Primero, al agregar la proteinasa, los ácidos nucleicos
empezaron a liberarse de la solución, separando el ADN de las proteínas y los
lípidos mediante solventes orgánicos y ciclos de centrifugación. Se utiliza la
fuerte tendencia hidrofílica de los grupos fosfato para separarlos en medios
acuosos, mientras que las proteínas y los lípidos se separan en solventes
orgánicos (Sambrook et al. 1989). La fase acuosa y la orgánica se separan por
centrifugación lo que permite aislar al ADN. Después de que son eliminados los
lípidos y las proteínas, se recupera el ADN. Para ello, se adiciona etanol y
soluciones con altas concentraciones de iones de sodio o amonio en donde se
unen a los grupos fosfato. Un nuevo paso de centrifugación permite que el ADN
permanezca en el fondo del tubo mientras que el etanol es desechado
(Formosa et al, 2010). Y por último, una vez que se ha eliminado el etanol, el
paso siguiente es hidratar el ADN y recuperarlo de la matriz para mantenerlo en
solución hasta que el material genético total se recupera en un volumen final de
2 microlitros.
Una vez obtenido el material genético, es importante determinar el rendimiento
mediante espectrofotometría. Parra ello se utilizó un NanoDrop (ND-1000), el
cual es un espectrofotómetro de espectro total (220-750nm) que mide
concentraciones con 1 µl de muestra, con gran exactitud y
reproductibilidad. Este software tiene la capacidad de medir muestras muy
concentradas, sin necesidad de diluirlas, característica que lo hace idóneo para
medir la concentración de ácidos nucleicos y para determinar su
cualidad. Mediante espectrofotometría se puede determinar la concentración y
la pureza de una muestra de ADN basándose en la capacidad de absorbancia
de un compuesto presente en una solución a una longitud de onda determinada
(Hillenkamp F y Karas M, 1990), los valores se encuentran en la tabla 2. De
este modo la concentración de la muestra de ADN se calcula teniendo en
cuenta el valor de absorbancia obtenido a una longitud de onda de 260 nm.
Mientras que la relación de absorbancias A260/280 y A260/230 se utilizan para
evaluar la pureza de las muestras. La relación A260/280 es muy estable y se
considera que un ADN de pureza óptima tiene un valor entre 1.8-2.0. Un ADN
de pureza aceptable debe tener al menos una relación A260/280 > 1.6. Un
valor A260/280 < 1.6 indica una posible contaminación por compuestos
aromáticos como fenoles, carbohidratos, sales caotrópicas y proteínas. Un
radio A260/280 > 2.1 podría deberse a la presencia de ARN en la muestra. Por
otro lado, se considera que el ADN es puro cuando el ratio A260/230 se sitúa
en torno 1.5-2.2. Un ratio menor de 1.5 indicaría presencia de contaminantes
en la muestra. No obstante, esta relación resulta mucho más variable que la
relación A260/280 dependiendo de factores como la concentración de ADN o
de la composición del tampón de resuspensión de la muestra (Labajo,2010).
Tabla 2. Valores indicativos de pureza en muestras de ADN

Para el desarrollo de la práctica, se dividieron tres grupos a lo largo del día:

grupo 1, grupo 2 y grupo 3. Analizando los índices de absorbancia de los
grupos 1 (primeros 3 resultados) y 3 (últimos cuatro resultados) en la tabla 1
(ver resultados), para estimar la pureza y proporción del ADN de las muestras
de pez realizadas en la experiencia, se puede inferir que todas las muestras
tuvieron en la relación A260/A280 un ADN de pureza optima, puesto que
conserva un valor entre 1.8-2.0. Por otro lado en la relación A260/A230, se
obtuvo el mismo resultado solo las muestras de ADN en pez de un rango entre
2.0 y 2.5, a diferencias de las de humano que se encontraron en un rango entre
0,75-6,78, Posiblemente esto se debió a la menor presencia de componentes
celulares (proteína, lípidos, partículas de músculos), permitiendo la obtención
de muestras de ADN más puras (Osorio et al, 2009), esto se puede ver
representado en la gráfica de la figura 1, donde las líneas más altas
correspondes a las del muestreo de pez. En cuanto a la cantidad de ácidos
nucleicos obtenidos, las muestras con mayor cantidad fueron las de “juanita”,
“das” y “numero 3” con valores mayores a 200 ng/ul, mientras que las demás
asumieron rangos entre 149 y 192 ng/ul, material que quizás se fue en el
sobrenadante a la hora de realizar el proceso.
Comparando la figura 3, “gráfica de valores de ADN en pez del grupo 1” con la
figura 4, “Gráfica de valores de ADN en ser humano del grupo 2” se percibe
como la capacidad de absorbancia de ácidos nucleicos, en función de la
longitud de onda (nm) aumenta más en la muestra de material genético de pez,
que en la de ser humano, esto debido a la ausencia de ADN en algunas células
sanguíneas humanas, como lo explicamos anteriormente (Gamboa, 2011). Los
resultados que tuvieron baja cantidad de ADN, entre rangos de 169,6- 192,1;
permiten entender que hubo un mal procedimiento, a la hora de extraer, tal vez
por la presencia de contaminantes en sus muestras, o porque no se logró la
lisis de la membrana o también por que las proteínas no se desnaturalizaron
completamente, a base de falta enzimática. Cabe aclarar que una muestra bien
purificada debe dar además como resultado un cromatograma con un solo pico,
si se observan mas picos o fluctuaciones o una pendiente que desciende, el
ADN probablemente esta degradado o contaminado, si se observan picos entre
230 y 260 la muestra viene contaminada con disolventes orgánicos, si se
observan después de 280 con proteínas u otros detritos celulares, si se
observan fluctuaciones en general viene contaminado con las sales de los
buffers del kit de extracción que se utilizaron, de esta forma, la de pez al tener
un solo pico se puede definir como muestra pura, en comparación a las
irregularidades de la línea de la gráfica del ser humano (Demeke T & Jenkins
R, 2010). Los métodos caseros de extracción de ADN han demostrado mayor
factibilidad de aplicación por su bajo costo y buenos resultados obtenidos en
diferentes matrices. El estudio de Lopera et al, (2008) demostró la efectividad
del protocolo identificado con sal común, un método bastante tradicional y
económico, que a pesar, del rustico proceso que utilizaron, extrayeron ADN
puro de larvas y aletas de peces. De acuerdo con sus resultados, demostraron
la necesidad de ARN asa durante la extracción para una segura y completa
amplificación, y falsos resultados. Por otro lado, Wasko et al, (2003),
investigando la extracción de ADN a partir de aletas de peces con el protocolo
de fenol-cloroformo, definieron igualmente que el uso de una baja
concentración de ARNsa puede provocar la obtención de ADN de baja calidad.
Por tanto, es indispensable el uso de esta enzima en protocolos de extracción
de muestras en peces. A diferencia de los resultados de Wasko et al. (2003), la
temperatura de 56ºC utilizada durante la digestión de las muestras no afectó la
calidad y cantidad de ADN extraído en los protocolos modificados usados, para
algunos de los resultados en esta práctica. Sin embargo, Wasko et al. (2003)
detectó deficiencias a 50ºC en su estudio, por lo que usó y recomendó una
temperatura de 42ºC, lo cual nos da a entender que cabe la posibilidad que el
factor temperatura haya influido quizás en los resultados que se obtuvieron, ya
que La incubación es muy importante, puesto que se utiliza para acelerar el
proceso de rotura de las membranas y para ayudar a disolver la bicapa de
fosfolípidos mediante la desnaturalización de las proteínas de membrana y
rotura de los enlaces que mantienen los fosfolípidos unidos, es decir que el
calor la ablanda.
Por último, además de conocer la cantidad y calidad del ADN por
espectrofotometría, es importante conocer si el ADN obtenido está integro. La
integridad del ADN se puede observar mediante electroforesis en gel de
agarosa (ver capítulo de electroforesis). . La electroforesis es una técnica para
la separación de moléculas según la movilidad de éstas en un campo eléctrico.
La separación puede realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte
sólido, como por ejemplo, en gel de agarosa, aquí se define la integridad de la
muestra como una única banda definida en la parte superior del gel, y la pureza
a base de la deteción de presencia de ARN en la parte inferior del gel
(Christopher & Austin, 2008). Si el ADN está integro, se debe observar una
banda estrecha cercana al pozo en que se colocó la mezcla de ADN. Al usar
este tipo de gel y realizar un ensayo semiautomático mediante la visualización
con luz UV, el ADN se observa un poco espantado porque los choques
eléctricos fueron altos, además se observa fragementado, puesto que tiene una
banda de más de un cm de ancho o un sendero luminoso en el carril de la
muestra correspondiente al ARN (figura 2) . El ADN fragmentado dificulta la
amplificación de productos de PCR de alto peso molecular y afecta la
reproducibilidad de las técnicas (Fierro, 2001). En el proceso, los grupos fosfato
de su esqueleto de azúcares-fosfato le otorgan una carga negativa a las
moléculas de ADN, por lo que comienzan a moverse a través de la matriz de
gel hacia el polo positivo. Cuando el sistema está encendido y pasa corriente
por el gel, se dice que el gel está corriendo. Una vez que los fragmentos se
separaron, el ADN se hizo visible con un brillo característico que le dio la
tinción utilizada para electroforesis (Can, 1989). En general, la muestra de ADN
de pez fue la que mejor cantidad y calidad obtuvo, que fue lo que se esperaba
por la cantidad de material genético que contenía en sus eritrocitos, esta
extracción medianamente íntegra y sin contaminantes es esencial para tener
éxito en la obtención de datos genéticos, es el primer paso en la lista de
técnicas moleculares que nos llevarán a comprender mejor y conservar la
diversidad biológica a partir del conocimiento de genes y genomas que
anteriormente era inaccesible para le ecología y la evolución de los peces.
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