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INSTITUTO COLOMBIANO DEL PETROLEO
UNIDAD DE SERVICIOS TECNICOS Y

LABORATORIOS ICP- UST-I-114002
LABORATORIO DE ESPECTROSCOPIA
Fecha aprobación:
INSTRUCTIVO PARA EL MANEJO DE 20/03/2009
MICROPIPETAS
Versión: 1 Pág.: 1 de 14
RELACIÓN DE VERSIONES
VERSIÓN DESCRIPCIÓN FECHA

1 Emisión del documento. 20/03/2009
ELABORÓ REVISÓ APROBÓ
BEATRIZ MURCIA CELIS

Líder de laboratorio
MARTIN MOJICA ALARCON JORGE HERNANDO HERRERA JAIMES

Profesional 1A del Área de Refinación Jefe Unidad Servicios Técnicos y
Laboratorios
Equipo de trabajo del Laboratorio de

Espectroscopia
ECP-DTI-F-004/V3
Fecha aprobación:
MICROPIPETAS
TABLA DE CONTENIDO
Pág.
1. OBJETO..............................................................................................................3
2. ALCANCE............................................................................................................3
3. GLOSARIO.........................................................................................................3
4. DOCUMENTOS DEROGADOS...............................................................................3
5. REFERENCIAS NORMATIVA................................................................................3
6. DESARROLLO.....................................................................................................4
6.1. INSTRUCCIÓNES PARA PIPETAS EPPENDORF.....................................................4
6.1.1. Principio de diseño.......................................................................................4
6.1.2. Funciones especiales....................................................................................4
6.1.3. Operación...................................................................................................5
6.1.3.1. Pre acondicionamiento de las puntas de las pipetas......................................5
6.1.3.2. Relleno....................................................................................................5
6.1.4. Dispensar...................................................................................................5
6.1.5. Puntas Eppendorf........................................................................................7
6.1.6. Prueba de funcionamiento............................................................................8
7. METODOLOGÍA CALIBRACION...........................................................................8
7.1. PREPARACIÓN................................................................................................8
7.1.1. Numero de pesadas.....................................................................................9
7.2. FRECUENCIA DE CALIBRACIÓN........................................................................9
7.3. CÁLCULOS...................................................................................................10
7.3.1. Limitaciones de Operación...........................................................................10
7.4. Guía de Problemas........................................................................................11
7.5. Limpieza y mantenimiento.............................................................................11
7.5.1. Datos Técnicos..........................................................................................12
7.5.2. Servicio....................................................................................................12
8. REGISTROS......................................................................................................12
9. CONTINGENCIAS.............................................................................................13
10. BIBLIOGRAFÍA.............................................................................................13
11. ANEXOS........................................................................................................13
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Fecha aprobación:
MICROPIPETAS
ECP-DTI-F-004/V3
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MICROPIPETAS
1. OBJETO
El instructivo garantiza el control de volumen gravimétrico de las pipetas siguiendo

el procedimiento de las normas ISO 8655,T6 como lo indica el Manual de usuario
de las micropipetas.
2. ALCANCE
Tiene como alcance la medición de volúmenes pequeños tanto fijo como variable
para toma de muestras liquidas
3. GLOSARIO
Exactitud: se define como la cercanía entre el valor observado y el valor conocido

(verdadero o aceptado como referencia). Esta diferencia constituye el error
sistemático del método. La exactitud del método se determina usando material de
referencia cuando esté disponible. La concentración del material de referencia
usado en la determinación de la exactitud debe estar por encima del límite de
detección del método.
Pipeta: Tubo de cristal ensanchado en su parte media, que sirve para trasladar
pequeñas porciones de líquido de un vaso a otro.
Precisión: está definida como el grado de acercamiento entre los datos generados
de medidas repetitivas bajo condiciones especificadas. La desviación estándar se
usa para expresar la precisión del método.
Tubo de varias formas cuyo orificio superior se tapa a fin de que la presión
atmosférica impida la salida del líquido.
Volumen: Magnitud física que expresa la extensión de un cuerpo en tres
dimensiones: largo, ancho y alto. Su unidad en el Sistema Internacional es el metro
cúbico (m3).
4. DOCUMENTOS DEROGADOS
No aplica
5. REFERENCIAS NORMATIVA
Manuales de operación de micropipetas
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6. DESARROLLO
6.1. INSTRUCCIÓNES PARA PIPETAS EPPENDORF
Existen 28 modelos de volumen fijo entre un rango de 1 uL a 2500 uL, cada pipeta
tiene un código definido por cada color que la identifica:
Volumen (uL) Botón de color control

1, 2, 5,10 gris
10,15,20,25,30,40,50,75,80,90,100 amarillo
150,200, 250, 300, 400, 500, 750,800, 900, 1000 azul
1500, 2000,2500 rojo
6.1.1. Principio de diseño
El modelo 4800 funciona después de instalar la punta en el cono de la pipeta y

todas las funciones de la pipeta son ejecutadas con un botón de control.
Primer Paso: Medida de volumen: El pistón interior de la pipeta mueve una

específica distancia, levantando o bajando un volumen determinado por la posición.
Segundo Paso: Golpe fuera, se expulsa algún líquido remanente de la punta de la

pipeta después de la liberación del primer paso. El volumen debe ser totalmente
dispensado de la punta, en este golpe de salida.
Tercer Paso: Expulsar la punta de la pipeta.
Sólo las puntas originales para pipetas eppendorf son recomendadas para asegurar
la exactitud y precisión de las pipetas y puntas libres de problemas de expulsión.
6.1.2. Funciones especiales
El procedimiento de optimización en el modelo 4800 es:

 La punta designada impide aspirar líquido con burbuja y que este suba en la
pipeta.
 Un pistón más prolongado para los vol 1, 2.5 y 10 uL para mejor exactitud y
precisión cuando se trabaja con volúmenes pequeños.
 Cerrar el anillo localizado en la punta.
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6.1.3. Operación
Estos son dos métodos recomendados de pipeteado:
Método 1: La muestra es desalojada dentro de la parte seca de la superficie del

vaso. Siempre pre-acondicionado la punta con el procedimiento adecuado.
Método 2: La muestra es desalojada en la superficie liquida ya presente en el vaso.

La punta no debe ser enjuagada usando este método. Este método es
recomendado para volúmenes de 1,2, 5 y 10 uL.
6.1.3.1. Pre acondicionamiento de las puntas de las pipetas
 Sujete la punta a la pipeta
 Aspirar y despachar la muestra líquida varias veces para pre-humedecer la

punta.
 Emplee un solo golpeteo para evacuar y parar con el enjuague final.
 No acondicionar las puntas cuando usa volúmenes de pipetas menores o iguales

a 20uL.
6.1.3.2. Relleno
 Si es apropiado acondicionar las puntas

 Presione el botón de control hacia abajo para el primer paso (midiendo el golpe).
 Sujete la pipeta casi vertical
 Sumerja la punta de la pipeta de 2 a 3 mm en el líquido
 Presione el botón para deslizar hacia abajo, nunca el lomo en posición horizontal.
 Deslizar la punta a lo largo del interior del recipiente
 Limpie alguna gotita que este fuera sobre la punta con pañitos libre de tejido
 Este seguro que la toallita también este estrictamente limpia, para que la
abertura en la punta de la pipeta este libre de contaminación que algunas de las
muestras tienen con el tejido.
6.1.4. Dispensar
Las pipetas deben mantenerse en forma vertical durante la aspiración. Al expirar el

líquido. la presión hidrostática de la columna del liquido en la punta cae, pues el
ángulo de inclinación de la pipeta aumenta. Como consecuencia se produce un
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aumento del volumen de aspiración. La desviación en volumen puede ser estimada

para cualquier tipo de pipeta y para cualquier ángulo de inclinación. Con un ángulo
de 45° divergente de la vertical, el volumen extra para una pipeta de 1000 ul es de
2.9ul es decir el 29%. El la figura podemos observar la influencia de la profundidad
de inmersión y el ángulo de sujeción de la pipeta.
INFLUENCIA DE LA PROFUNDIDAD DE LA INMERSION Y EL ANGULO DE

SUJECION DE LA PIPETA DURANTE LA ASPIRACION DEL LÍQUIDO
 Evacuar el líquido contra un recipiente seco con la punta enjuagada.

 Sujete la punta contra el interior de la pared del recipiente o directamente contra
la superficie del líquido
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 Presione el botón de control lentamente hacía abajo a el primer pare (midiendo

el golpe) y esperar 1 a 3 segundos
 Entonces continúe a pulsar el botón de control hacia abajo o el segundo pare
(golpe a fuera), este entregará el liquido remanente en la punta de la pipeta.
 Mientras continua sujetando el botón de control hacia abajo, deslice la punta
fuera a lo largo de las paredes del vaso.
 Expulsar la punta de la pipeta presionando el botón de control hasta el pare final.
Dispensando el volumen en el líquido

 Sumerja la punta en el líquido según la profundidad indicada en la siguiente tabla
 Lentamente presione el botón de control dos veces, para el primero paso.

(parar para un procedimiento de enjuagado) siempre dejar el botón deslizarse en
la pared lentamente.
 El golpe hacia abajo y deslizarse la punta en la pared del vaso
 Expulse la punta
Importante
 Nunca pipetee líquido sin ajustar la punta correctamente a la pipeta
 Nunca ponga las pipetas acostadas con líquido en la punta
6.1.5. Puntas Eppendorf
Pipetear con Eppendorf el capilar estrecho y sobre la punta, el flujo del líquido muy
lentamente. Es una técnica de pipeteado segura.
6.1.6. Prueba de funcionamiento
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Use microbalanza de 5 cifras.

Prueba gravimétrica de exactitud y precisión.
Múltiples dispensadas con agua destilada son pesadas individualmente.
Cálculos para el funcionamiento para ajustar el peso de agua para condiciones
ambientales y estos datos son utilizados para determinar la precisión y exactitud de
las pipetas.
7. METODOLOGÍA CALIBRACION
7.1. PREPARACIÓN
 El ensayo debe realizarse en una sala sin corrientes de aire

 En la sala de ensayo debe haber un exceso de un 50% de humedad relativa y
una temperatura constante entre 15°C y 30 °C
 Debe utilizarse agua destilada como liquido de ensayo.
 Acondicionar la pipeta antes del control mediante 5 pipeteados con el líquido de
ensayo con una punta de pipeta nueva. Después desechar la punta.
 Llene con una cantidad justa de agua destilada un vaso de precipitado,
suficientes para el número de medidas
 Medir la temperatura del líquido de ensayo.
 La balanza esta calibrada
 Ubicar en la balanza el recipiente de pesar (beaker de 5ml, Un vaso con una
pequeña abertura de área de superficie, un vaso pequeño o un vial es
recomendado). Tarar
 Aspirar el liquido de ensayo y pipetear en el recipiente de pesar
 Pesar la cantidad pipeteada.
 Calcular el volumen pipeteado al hacerlo se debe tener en cuenta la temperatura.
El factor de corrección de temperatura se consulta en la tabla 1 Extracto de DIN
EN ISO8655-6
 Todos los ítems involucrados en las mediciones deberán estar equilibrados a la
Temperatura del cuarto por 2 o 3 horas antes de las lecturas.
 Con pipetas de volumen variable se deben probar 3 volúmenes diferentes
 Volumen nominal : mayor volumen que puede ajustar el usuario y establecer
el fabricante
 50% del volumen nominal
 El límite inferior del volumen útil o el 10 % del volumen nominal
Tabla de factor de corrección de temperatura.
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7.1.1. Numero de pesadas
 Realizar por lo menos 10 pipeteadas y 10 pesadas.
7.2. FRECUENCIA DE CALIBRACIÓN
 La calibración de las micropipetas debe realizarse una vez por año, o si es

necesario por la caída o golpe de alguna de ellas.
Nota:
Un pipeteado incorrecto puede ser causado por goteo de la pipeta. La pipeta puede
estar goteando en las pruebas, ajuste la punta, llene la punta con líquido y observe
presencia de humedad
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7.3. CÁLCULOS
Los cálculos se realizan consignando la información obtenida en el formato UST-F-

114015 de calibración de micro pipetas
Ajuste los valores de los pesos por los cambios en la densidad del agua con respecto
a la temperatura, la presión barométrica y la rata de evaporación. Use la siguiente
formula para determinar la exactitud y precisión.
Volumen Nominal = Vo = Lectura esperada
Formulas Variables
 Xi V = Valor medio
V Xi = Resultados de las pesadas
n
N = Número de pesadas
Vm = Volumen medio
Vm  X * Z X = Valor medio
Z = Factor de corrección
Por ejemplo (1,0029 uL/mg a 20°C, 1,013 hPa)
Vm  Vo %E = Exactitud
%E  * 100
Vo Vm = Volumen medio
Vo = Volumen nominal
s = Desviación Estándar
sZ *

 Xi  Vm 2 Z
Xi
= Factor de corrección
= Resultados de las pesadas
n 1
Vm = Volumen medio
%CV = Coeficiente de variación
100 * s s = Desviación Estándar
%CV 
Vm Vm = Volumen medio
7.3.1. Limitaciones de Operación
Limitaciones físicas
 Diferencias de temperatura entre la pipeta y el líquido a ser medido, puede ser

eliminado por enjuague de la punta varias veces.
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 Desviaciones entre el volumen actual pipeteado y el volumen nominal puede ser

tolerado sin embargo, estos deben ser minimizados en orden de desempeño
para fallas con especificaciones.
 Líquidos con altas presiones de vapor pueden producir errores de volumen.
Limitaciones Químicas
 El material plástico de las pipetas es altamente resistente a solventes orgánicos,

sin embargo evitar operar la pipeta con estos por que pueden entrar en el cono
de la misma.
7.4. Guía de Problemas
Error Causa Solución

Gota en el interior De la No hay un mojado uniforme en el Reemplace una por una nueva punta
punta de la Pipeta plástico en la pipeta.
Goteado de pipetas la punta está suelta
Contaminación del pistón Limpie el pistón(ver 9.1)
Cono suelto Apretar el cono
Pistón dañado reemplace el sello
Pipeteadas de volumen La punta está mala
demasiado pequeño
Irregular movimiento en Contaminación del pistón Limpie el pistón(ver 9.1)
el botón de control
Hinchazón en el sello del o-ring Abra la pipeta y destornille en el
causado por incorrecto pipeteado empalme central y deje secar, si es
de solventes orgánicos o líquidos necesario, limpie el pistón y sello con
cáusticos. solución jabonosa, enjuague con agua
destilada y lubrique suavemente. Si
no reemplace el sello Ver sec.9.1
7.5. Limpieza y mantenimiento
Mantenimiento
Si este modelo es usado correctamente, es requerido un mantenimiento limitado.
Limpieza
Todas las partes de la pipeta pueden ser limpiadas con solución jabonosa o iso-
propanol. Después de limpias enjuague con agua destilada y seque.
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El pistón puede ser lubricado ligeramente con grasa de silicona.(Ver secc 10)
Nota: Ser muy cuidadoso al destornillar la nariz de la pipeta, está apretada abajo.
7.5.1. Datos Técnicos
Modelo Exactitud Precisión

1 uL ±2.5% ≤ 1.8%
2 uL ±2.0% ≤ 1.2%
5uL ±1.5% ≤ 0.8%
10uL ±1.0% ≤ 0.5%
15uL ±1.0% ≤ 0.5%
20uL ±0.8% ≤ 0.3%
25uL ±0.8% ≤ 0.3%
30uL ±0.8% ≤ 0.3%
40uL ±0.8% ≤ 0.3%
50uL ±0.7% ≤ 0.3%
75uL ±0.7% ≤ 0.3%
80uL ±0.7% ≤ 0.3%
90uL ±0.7% ≤ 0.3%
100uL- 2500 uL ±0.6% ≤ 0.2%
Liquido: Agua destilada

Temperatura de Referencia: 21°C ± 0.5
Numero de mediciones: 15 mediciones
7.5.2. Servicio
Servicio y reemplazo de componentes
Para acceder al pistón, abra el instrumento destornillando por la parte de la mitad

de la pipeta en el botón de el centro de empalme. Empuje el botón en la parte de la
mitad por todo el recorrido hacia abajo, para limpiar extraer el pistón. Mientras
sujeta el botón de abajo el pistón viejo es fácilmente removido, tirar el metal que
esta conectado a la barra.
8. REGISTROS
 Formato ICP-UST-F-114015 Calibración de Micropipetas. Archivado en la carpeta

de registros de calibración, capítulo 5 del manual de procedimientos técnicos.
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9. CONTINGENCIAS
El laboratorio en todas las áreas instrumentales cuenta con Micro pipetas , en caso
que una de ellas este fuera de servicio.
10. BIBLIOGRAFÍA
Instrucciones de manejo de las transferpette –Brand, certificadas por la ISO 9001-

14001.
SCHOTT DURAN Laborglaskatalogre 2003.
11. ANEXOS
No aplica
Para mayor información sobre este documento dirigirse a quien lo elaboró, en nombre de la dependencia
responsable:
Beatriz Murcia Celis

Tel: 6847084
Laboratorio de Espectroscopia
ECP-DTI-F-004/V3

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VERSIÓN DESCRIPCIÓN FECHA

ELABORÓ REVISÓ APROBÓ

BEATRIZ MURCIA CELIS

MARTIN MOJICA ALARCON JORGE HERNANDO HERRERA JAIMES

Equipo de trabajo del Laboratorio de

El instructivo garantiza el control de volumen gravimétrico de las pipetas siguiendo

Exactitud: se define como la cercanía entre el valor observado y el valor conocido

Manuales de operación de micropipetas

6.1. INSTRUCCIÓNES PARA PIPETAS EPPENDORF

Volumen (uL) Botón de color control

6.1.1. Principio de diseño

El modelo 4800 funciona después de instalar la punta en el cono de la pipeta y

Primer Paso: Medida de volumen: El pistón interior de la pipeta mueve una

Segundo Paso: Golpe fuera, se expulsa algún líquido remanente de la punta de la

Tercer Paso: Expulsar la punta de la pipeta.

6.1.2. Funciones especiales

El procedimiento de optimización en el modelo 4800 es:

 Cerrar el anillo localizado en la punta.

Estos son dos métodos recomendados de pipeteado:

Método 1: La muestra es desalojada dentro de la parte seca de la superficie del

Método 2: La muestra es desalojada en la superficie liquida ya presente en el vaso.

6.1.3.1. Pre acondicionamiento de las puntas de las pipetas

 Sujete la punta a la pipeta

 Aspirar y despachar la muestra líquida varias veces para pre-humedecer la

 Emplee un solo golpeteo para evacuar y parar con el enjuague final.

 No acondicionar las puntas cuando usa volúmenes de pipetas menores o iguales

 Si es apropiado acondicionar las puntas

Las pipetas deben mantenerse en forma vertical durante la aspiración. Al expirar el

aumento del volumen de aspiración. La desviación en volumen puede ser estimada

INFLUENCIA DE LA PROFUNDIDAD DE LA INMERSION Y EL ANGULO DE

 Evacuar el líquido contra un recipiente seco con la punta enjuagada.

 Presione el botón de control lentamente hacía abajo a el primer pare (midiendo

Dispensando el volumen en el líquido

 Lentamente presione el botón de control dos veces, para el primero paso.

6.1.5. Puntas Eppendorf

6.1.6. Prueba de funcionamiento

Use microbalanza de 5 cifras.

 El ensayo debe realizarse en una sala sin corrientes de aire

Tabla de factor de corrección de temperatura.

7.1.1. Numero de pesadas

 Realizar por lo menos 10 pipeteadas y 10 pesadas.

7.2. FRECUENCIA DE CALIBRACIÓN

 La calibración de las micropipetas debe realizarse una vez por año, o si es

Los cálculos se realizan consignando la información obtenida en el formato UST-F-

Volumen Nominal = Vo = Lectura esperada

7.3.1. Limitaciones de Operación

 Diferencias de temperatura entre la pipeta y el líquido a ser medido, puede ser

 Desviaciones entre el volumen actual pipeteado y el volumen nominal puede ser

 Líquidos con altas presiones de vapor pueden producir errores de volumen.

 El material plástico de las pipetas es altamente resistente a solventes orgánicos,

7.4. Guía de Problemas

Error Causa Solución

7.5. Limpieza y mantenimiento

Si este modelo es usado correctamente, es requerido un mantenimiento limitado.

7.5.1. Datos Técnicos

Modelo Exactitud Precisión

Liquido: Agua destilada

Servicio y reemplazo de componentes

Para acceder al pistón, abra el instrumento destornillando por la parte de la mitad

 Formato ICP-UST-F-114015 Calibración de Micropipetas. Archivado en la carpeta

Instrucciones de manejo de las transferpette –Brand, certificadas por la ISO 9001-