PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO MÉTODOS DE AISLAMIENTO

Casas Juan David, Chaspuengal Recalde Elmer, Osorio Jorge Hernan

Escuela de Ingeniería de Alimentos- Universidad del valle
Práctica: 13 Febrero 2019- Entrega: 27 Febrero 2019 C= 3,5
RESUMEN
En la práctica de laboratorio se realizó la preparación de agares a partir de cultivos
deshidratados para posteriormente hacer distintos tipos de siembra. Para estos cultivos se
utilizaron muestras de Bacillus cereus ​y un cultivo mixto de ​Escherichia coli + Bacillus
cereus. ​La siembra se llevó a cabo de diferentes maneras; por dilución en serie,
agotamiento, en un medio líquido y en superficie. Como resultado se obtuvo que en el
sembrado por punción, la bacteria ( ​B. cereus ​) presenta movilidad, en el sembrado por
superficie, se evidenció el crecimiento de colonias separadas y en el sembrado por
agotamiento, se obtuvieron colonias puras.
Palabras clave: ​cultivo, aislamiento, esterilidad, microorganismos, crecimiento

INTRODUCCIÓN
En la naturaleza, la mayoría de los microorganismos no se encuentran aislados, sino
integrados en poblaciones mixtas. Para llevar a cabo el estudio de estos microorganismos y
de sus propiedades, es necesario separar unos de otros y trabajar con especies aisladas,
obteniendo cultivos axénicos o puros.
Para obtener cultivos puros a partir de una población microbiana mixta, se utilizan las
denominadas técnicas de aislamiento, que fueron desarrolladas durante el siglo XIX. En un
principio, Lister utilizó diluciones seriadas en medio líquido con esta finalidad, pero la
presencia de contaminación, es decir, de microorganismos no deseados, dificultó el
aislamiento. La escuela de Robert Koch introdujo los medios sólidos, complementados con
agar, y las placas de Petri en Bacteriología, permitiendo así la separación física de las
colonias sobre la superficie del medio de cultivo o en el interior del mismo. El aspecto de las
colonias sirve para diferenciar distintas especies microbianas.[1]
Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un
medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano. Existen diferentes tipos de
siembra de acuerdo al medio utilizado y a los requerimientos que posea el microorganismo
a estudiar; por ejemplo, se recomienda para microorganismos aerobios estrictos una
siembra en superficie y una siembra en doble capa para microorganismos anaerobios
facultativos y microaerofílicos. [2]

OBJETIVOS
General
-Aprender y desarrollar técnicas de siembra de microorganismos para la preparación de
medios de cultivo y desarrollo en condiciones de laboratorio.
Específico
- Replicar técnicas para el desarrollo de medios de cultivos específicos a partir de las
instrucciones del empaque comercial del microorganismo.
-Aplicar técnicas bacterianas para la siembra y aislamiento de microorganismos.
- Obtener mediante la siembra de una población microbiana mixta un cultivo puro.

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 MATERIALES Y MÉTODOS
Instrumentos y materiales utilizados
Los instrumentos utilizados en la práctica fueron los siguientes:
Agua destilada​: la función de este agua es diluir solutos para formar soluciones.
Termoagitador: es empleada para calentar y a la vez mezclar las soluciones, permitiendo
homogeneizar soluciones saturadas.
Erlenmeyer:​ recipiente usado para contener soluciones.
Cajas de petri: ​Recipiente redondo de cristal con una cubierta de la misma forma que la
placa pero algo más grande de diámetro para que se pueda cerrar.
Agar nutritivo: ​es un medio de cultivo comúnmente empleado para todo tipo de bacterias y
generalmente es depositado en cajas de petri.
Balanza Digital: instrumento de pesaje el cual por acción de la gravedad cuantifica la masa
de un objeto.
Caldo nutritivo: Es un medio líquido compuesto por una infusión de carne, CINa,peptona,
extracto de levadura y también fosfato disódico. Es usado como base para otros caldos que
puedan contener más nutrientes.
Asa bacteriológica: ​Hecho de acero con la punta en forma de aro de un tamaño de 5mm.
Se utiliza para transportar pequeñas muestras de la bacteria o de la solución a un medio de
cultivo
Mechero: ​Instrumento utilizado para calentar muestras entre otras cosas.
Asa recta: ​se usa para trasladar una sola colonia a otro cultivo.
Autoclave: ​es un recipiente metálico hermético el cual permite trabajar con vapor de agua a
altas presiones y temperaturas, que sirve para esterilizar material de laboratorio.
Cultivos de microorganismos: ​ Bacillus cereus, Bacillus cereus + Escherichia coli.

PROCEDIMIENTO
Preparación del agar
Para la preparación del medio de cultivo se siguieron las instrucciones presentes en el
empaque comercial del agar. Se mezcló 2,6g de la muestra con 130 mL de agua destilada,
posteriormente, se hizo uso del termo-agitador el cual calienta y revuelve la muestra al
mismo tiempo. Luego se vertió en 3 tubos de ensayo 20 mL de la solución, en otro tubo 10
mL y por último uno con 5 mL. Seguidamente se llevó al autoclave donde se dejó
aproximadamente por 20 minutos. Con la solución restante se preparó dos cajas de petri;
una con el microorganismo solo (​B.cereus​) y la otra con el mixto (​B.cereus + E.coli​).
Siembra por punción
Para la siembra por punción se tomó una muestra de el cultivo de ​B. cereus con el asa recta
de forma vertical y se introdujo de la misma forma a un tubo con 5mL agar sólido.
Siembra en medio líquido (caldo nutritivo)
Con el asa de inoculación previamente esterilizada se tomó una muestra de B. cereus ​y se
colocó en un tubo de ensayo con el caldo nutritivo suministrado por el laboratorio.
Siembra por dilución
En este método se tomó con el asa en argolla una muestra del cultivo mixto (​B.cereus +
E.coli​) y se introdujo a uno de los tubos con agar líquido previamente esterilizado en el

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autoclave. Después, con el asa en argolla estéril se toma una muestra del tubo 1 y se
siembra en el tubo 2, el contenido del tubo 1 se deposita en una caja petri estéril.
Seguidamente, se toma una muestra del tubo 2 y se siembra en el tubo 3, el tubo 2 se vierte
en una caja petri estéril. Similarmente, el tubo 3 se vierte en una caja petri estéril, por último
las 3 cajas petri son selladas y puestas en la incubadora
Siembra por superficie (agar)
Para este tipo de siembra se tomó una muestra del cultivo mixto (​B.cereus + E.coli​) con la
ayuda del asa en argolla y se hizo el frotis sobre el agar, con la técnica de estría cruzada o
zig zag.
Siembra por superficie ( agar inclinado)
Para este tipo de siembra se utiliza el tubo con 10 mL de agar. Se inclina de tal forma que el
agar se solidifique y permita el sembrado en superficie. Con el asa recta se tomó una
muestra de ​B. cereus y​ en forma de estría simple se distribuye por todo la superficie del
agar.
Siembra por agotamiento en superficie
Para este tipo de siembra se tomó una muestra del cultivo solo (​B.cereus​) con la ayuda del
asa de inoculación. Luego, se hizo frotis de forma continua y de manera paralela sobre la
superficie del agar disminuyendo la cantidad de líneas conforme se avanza en el frotis.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En la actualidad la mayoría de los medios de cultivos se encuentran comercializados;
normalmente bajo el proceso de liofilización por lo cual es necesario volverlos a rehidratar.
En estos casos la preparación del medio de cultivo se reduce sencillamente a pesar la
cantidad deseada del mismo y disolver en agua destilada siguiendo las instrucciones del
fabricante.

Ilustración 1.​ Instrucciones del agar.​

Como está descrito en las instrucciones del producto, por cada 20 g del polvo se debe
adicionar un 1L de agua, pero para la práctica solo fue necesario preparar 130 mL, por lo
tanto se empleó un factor de conversión el cual se muestra a continuación.

Obteniendo los gramos necesarios que son 2.6g de agar liofilizado para preparar con 130

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mL de agua destilada.
En la preparación de los medios de cultivos se pudieron identificar algunos factores que
pueden afectar las propiedades del agar. Para la preparación del agar se debe someter a
temperaturas altas, debido a que el agar está compuesto principalmente por un polímero
llamado agarosa, el cual es insoluble en agua a temperatura ambiente, pero al aumentar la
temperatura, las estructuras de doble hélice de la agarosa se unen para formar estructuras
tridimensionales que retienen moléculas de agua en sus intersticios y forman, así, geles
termorreversibles. [3]
Tipos de sembrado para obtención de cultivos puros
Siembra por punción
Generalmente esta se realiza en medios de cultivo semisólido, ya que este me permite
identificar si el microorganismo es o no móvil. En la ​ilustración 2 ​se puede apreciar un poco

de turbidez en la parte superior del cultivo, esto quiere decir

presenta motilidad,
que el microorganismo debido
de la zona donde se hizo la picadura, pero porafactores
que se puede observar
externos como que el crecimiento
la técnica (siembra
se difunde alrededor
tipo punción) o el tamaño de la muestra que se trató de inocular, no se pudo observar a lo
largo del tubo de ensayo. La movilidad que presentan estas bacterias se debe a una
estructura filamentosa, proteica, helicoidal, delgada y rígida, de longitud y diámetro uniforme
llamada flagelo, la cual actúa como un apéndice bacteriano para la locomoción y en algunos
casos también para adhesión.[4]

​ iembra por punción.

​Ilustración 2: S
Siembra por dilución en serie
Este método se basó en la siembra en serie de una muestra de ​B. Cereus ​directamente en
tubos de agar líquido. Al realizar las diluciones seriadas se obtiene que la primera dilución
tiene una proporción de 1/10 con respecto a la muestra del microorganismo sembrado y al
medio de cultivo; por lo que al realizar siembras sucesivas de un tubo hacia otro se produce
una disminución del microorganismo; como en el medio líquido no tiene lugar la formación
de colonias esta disminución no se puede evidenciar fácilmente, es por eso que se deposita
las muestras en placas o cajas petri y se deja incubar [5]. En la ​ilustración 3, 4,5 ​se
evidencia claramente la disminución de colonias en el medio cultivado después de la
siembra seriada y el tiempo de incubación.

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Siembra​ ​por​ ​superficie
Para estudiar las propiedades de un organismo, es necesario no sólo su aislamiento a partir
de una población microbiana natural mixta, sino también su mantenimiento y el de su
descendencia en estado aislado, en un ambiente artificial en el que se impida el acceso de
otros microorganismos.[6] En este caso la siembra se realizó usando la técnica de estría
cruzada, en la que se utilizó un cultivo mixto (​E.coli y B. cereus)​ , la finalidad de esta
siembra es el conteo y la obtención de colonias aisladas; en la ​ilustración 6 se puede
observar claramente que las bacterias ​E. Coli y B. cereus se desarrollaron de forma
independiente o aisladas. Al ser un cultivo mixto se puede evidenciar algunas diferencias
entre las colonias formadas, como el tamaño, la forma de agrupación y una muy leve
variación de color.

Ilustración 6: c​ ultivo mixto de E. Coli y B.Cereus

Siembra en superficie en agar inclinado

Usando el método de siembra por estría simple se inoculó una muestra de ​B. cereus
deslizando el asa sobre la superficie expuesta del agar de manera que se marque con
movimiento en zigzag o surcos en la superficie; en este caso, y cómo se puede apreciar en la
ilustración 7​, el microorganismo presentó un crecimiento filiforme y un poco abundante sobre la
superficie cultivada, esto debido a que el ​B. cereus es un microorganismo anaerobio
facultativo el cual requiere oxígeno para la producción de la toxina emética, pero crece
mejor en condiciones de aerobiosis[7].

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Los tubos inclinados son muy útiles tanto para cultivos aerobios como para anaerobios
facultativos. Además las características del cultivo tales como pigmento son fáciles de
observar en este tipo de cultivo.

Ilustración 7: s​ iembra por agotamiento en agar inclinado.

Siembra por agotamiento en superficie
Para la siembra de la bacteria sola ( ​B.cereus ) se logró observar un crecimiento irregular y
de color blanco con un poco de turbidez a lo largo de las líneas marcadas por el asa con el
inóculo, tal como se muestra en la ​ilustración 8. E ​ l objetivo de este tipo de siembra es
obtener a partir de un elevado número de bacterias, un número reducido de ellas
distribuidas individualmente a lo largo de la superficie de la placa. Al incubar está, cada una
de las bacterias originara una colonia. Las colonias individuales constituyen cada una un
cultivo puro. [8]
Según la CONACYT (Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste de México), el
crecimiento de esta bacteria en agar sangre, produce colonias blanquecinas, grandes,
extendidas e irregulares, este mismo autor aclara que puede crecer en un intervalo de pH
de 4.9-9.3. [9] ​Esto último, puede dar a entender que el pH del medio en el que se sembró
la bacteria se mantuvo en ese rango y por eso hubo un crecimiento óptimo.

Ilustración 8: s​ iembra por agotamiento de B. cereus.

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Siembra en medio líquido (caldo nutritivo)
El crecimiento en medios de caldo se indica por la aparición de turbidez, motas o floculación
en el medio, mientras que el control sin inocular permanece transparente y sin turbidez
después de la inoculación. ​El cultivo de bacterias actúa como una suspensión coloidal que
intercepta la luz a través de ellas. Se debe de tener en cuenta [10]:
-​La cantidad de luz absorbida es directamente proporcional a la concentración de células.
-Mientras más alto sea el porcentaje de transmitancia, más bajo es el número de células en
suspensión​.
Para el cultivo en un medio líquido ( ​ilustración 9​), se notó un crecimiento en forma de
sedimento, es decir, creció en la parte inferior del tubo de ensayo, esto puede deberse,
debido a que el caldo nutritivo es un medio líquido y por ende la bacteria se puede mover
libremente. ???? No posee flagelos!!!

Ilustración 9. ​B.cereus en caldo nutritivo

CONCLUSIONES
Como resultado de la práctica, se puede concluir que los medios de cultivo juegan un papel
importante en el desarrollo y crecimiento de los microorganismos, ya que dependiendo del
tipo de bacteria que se desee incubar, se elige un medio de cultivo apropiado con los
nutrientes necesarios para su desarrollo. Además, es importante tener en cuenta que la
técnica de sembrado también influye en el crecimiento de estos microorganismos.

La importancia de las técnicas de siembra para

obtención de cultivos puros y para preservación
de microorganismos
BIBLIOGRAFÍA
[1] laboratorio de microbiología (2018) ‘MICROBIOLOGÍA GENERAL IDENTIFICACIÓN DE
MICROORGANISMOS’, pp. 1–27.
[2] Santambrosio, E. and Ortega, M. (2009) ‘SIEMBRA Y RECUENTO DE
MICROORGANISMOS’. Disponible en
https://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnologia/practicoIII.pdf​.
(consultado el 20 de febrero 2019)
[3]AGAR GEL. (2003). Agar-Agar : Propiedades y Especificaciones. Recuperado 25 febrero,

7
2019, de http://www.agargel.com.br/agar-tec-es.html
[4] Cavallini, E. R. (2005). Bacteriología general: Principios y prácticas de laboratorio .
Editorial Universidad de Costa Rica. (p. 79). (consultado el 23 de febrero 2019)
[5]Cano Rueda, Sara. Métodos de análisis microbiológico, normas iso, aislamiento.
“​Métodos generales de aislamiento”​, disponible en:
http://www.analizacalidad.com/docftp/fi148anmic.pdf​ (consultado el 23 de febrero 2019)
[6] Junco Díaz, R. and M Rodríguez Pérez, C. (2001) ‘Cultivo y crecimiento de los
microorganismos’, pp. 45–54.
[7] MINISTERIO DE PROTECCIÓN SOCIAL, & Instituto Nacional de Salud. (2011). Perfil de
riesgo ​Bacillus Cereus en alimentos listos para el consumo industrializado. Disponible
en:​https://www.minsalud.gov.co/sites/rid/Lists/BibliotecaDigital/RIDE/IA/INS/Perfil-bacillus-ce
reus.pdf​ (consultado el 23 de febrero 2019)
[8] Cervera Sanz, S. (2011) “Prácticas de Microbiología”. 2nd edn. España: Universidad de
la rioja

[9] Cortes, S., Diaz, R. and Salgado, C. (2017) ‘ Bacillus cereus : Las
enfermedades’,
[10] ​Forbes B., 10,
Samhpp. D.
3–9.
y Weissfeld A. (2009). Diagnóstico microbiológico. Argentina. Ed.
Panamericana. p.284