UNIVERSIDAD NACIONAL DE

SAN AGUSTIN
FACULTAD DE INGENIERIA DE PROCESOS
ESCUELA PROFESIONAL DE
INGENIERIA QUIMICA

Curso:
Laboratorio de Bioprocesos (PRACTICA 4)

INMOVILIZACIÓN DE LEVADURAS EN PERLAS DE ALGINATO DE CALCIO

Presentado por:
Olanda Apaza Solanch Katherin
Grupo:
Jueves 8:50 - 10:30 am
CUI:
20150758

AREQUIPA –PERU
2019
INMOVILIZACIÓN DE LEVADURAS EN PERLAS
DE ALGINATO DE CALCIO

OBJETIVOS

 Proporcionar una introducción a las técnicas de la inmovilización

celular y el estudio cuantitativo de la fermentación.

FUNDAMENTO TEORICO

El encapsulamiento dentro del alginato de calcio es la técnica más

utilizada para inmovilizar células. Es especialmente adecuado para las
células vivas, ya que tiende a no dañarlas. Las aplicaciones de este
método versátil incluyen inmovilización de células en biorreactores,
encapsulamiento de protoplastos de plantas y embriones de plantas
("semillas artificiales") para micropropagación,inmovilización de
hibridomas para la producción de anticuerpos monoclonales, y el
encapsulamiento de enzimas y fármacos (ver tabla).
Las células o enzimas para ser inmovilizadas primeros mezclan con una
solución de alginato de sodio. Esta luego se gotea en una solución que
contiene cationes multivalentes (generalmente Ca2 +). Las gotitas a
medida que caen forman esferas, atrapando las células en una rejilla
tridimensional de alginato reticulado iónicamente.
Micrografía electrónica de células Inmovilizadas de levadura en
alginato de calcio. Las cicatrices de los brotes son visibles en algunos
delas células.

La inmovilización de células
La inmovilización de células tiene múltiples aplicaciones en
biotecnología, biomedicina y ambiente. Entre las principales ventajas
que ofrecen las células inmovilizadas se incluyen: la posibilidad de llevar
a cabo reacciones complejas o acopladas, la reutilización de biomasa,
una mayor estabilidad del biocatalizador, mayor productividad, la
facilidad operativa, el bajo consumo de energía, y la baja
contaminación ambiental, entre otras (Martynenko y Gracheva, 2003;
Freemany Lily, 1998; Salter y Kell, 1991).

Para la inmovilización de células por atrapamiento, los geles de alginato

de calcio son los más utilizados (Manojlovicet al., 2006). Entre las
ventajas de este método están la facilidad para manipular las
propiedades gelificantes y la resistencia del gel (Sree et al., 2000).
Una de las aplicaciones más destacables de la inmovilización de células
es la producción de etanol (Núñez y Lema, 1987). Debido a la creciente
demanda de este biocombustible, se incrementa la necesidad de
emplear tecnologías económicas y microorganismos con altos
rendimientos (Lin y Tanaka, 2006).

Si bien el método de inmovilización de células por atrapamiento en

geles tiene varias ventajas, posee también como desventajas la escasa
permeabilidad a moléculas de sustrato con elevado peso molecular y,
en general, limitaciones en la transferencia de materiales a las células.

Sistema inmovilizado y libre

En este aspecto, la fermentación alcohólica con células inmovilizadas
ofrece un mayor rendimiento con un menor empleo de recursos, en
comparación con la fermentación con células libres; además, tiene una
tasa más alta de fermentación, ya que permite operar a una alta
densidad celular por unidad de volumen, y permite la recuperación in
situ de células, con lo que se facilitan las operaciones de recuperación
de biomasa y producto. Esto, a su vez, incrementa la tolerancia de los
microorganismos al etanol y reduce costos de producción de inóculo
(Sree et al., 2000; Norton y D’Amore, 1994).

La inmovilización de levaduras en perlas de alginato y poliacrilamida se

ha utilizado con éxito en la fermentación de vino blanco y en la
producción de etanol (Cachon y Divies, 2001). Debido a cambios en la
composición de las células por interacción con el soporte de alginato,
estos catalizadores se vuelven más activos y se observa que la
fermentación ocurre a mayor velocidad respecto a los casos en los que
se emplean levaduras libres (Galazzo y Bailey, 1990). Otra ventaja
importante de estos sistemas inmovilizados es que el soporte protege la
levadura de la acción de inhibidores, metales pesados, fenoles y
temperaturas extremas. Además, a diferencia de los flóculos de
biomasa, estos sólidos al ser más sencillos de manejar, permiten un mejor
control de la actividad catalítica en reactores de tipo lote y continuos.

El “atrapamiento” de levaduras en matrices sólidas puede realizarse por

difusión de las células en matrices sólidas sintetizadas previamente
(Barón y Willaert, 2004) o por formación de las matrices alrededor de las
células (Ramakrishna y Pakasham, 1999). Este método de inmovilización
permite conseguir grandes concentraciones de biomasa (Stewart y
Russel, 1986) con el uso de reactores fluidizados (Verbelenet al., 2006).
Además se pueden inmovilizar en matrices independientes células que
no podrían coexistir en contacto directo debido al efecto “killer” (Pérez
e et al., 2001). No obstante, al igual que los otros métodos de
inmovilización presenta desventajas. Las más importantes son los
posibles problemas de difusión de nutrientes y productos a través de la
matriz porosa y la pobre resistencia mecánica de los soportes sólidos
(Verbelen et al., 2006).

MATERIALES Y REACTIVOS

Materiales utilizados en la práctica.

Equipo

 • Jeringa de plástico de 10 ml (sin aguja)

 • Vasos pequeños o vasos de plástico desechables, 2
 • Frasco cónico de 250 mL.
 • Tapón para encajar en el matraz, perforado para tomar un
candado de fermentación.
 • Bloqueo de fermentación
 • Colador de té
 • Varilla agitadora de vidrio

Materiales

 • 4% de solución de alginato de sodio, 25 ml

 • Solución de cloruro de calcio al 1.5%, 100 ml
 • Levadura de panadería, seca, 2,5 g
 • 8% de solución de sacarosa, 150 ml
 • Solución indicadora universal, 1 ml, diluida con 1 ml de agua
destilada o des ionizada,
METODOLOGIA

DISOLVER LA LEVADURA

Solución de Alginato
Mezclado Solución de Levadura

Inmovilización

Recuperación y
Acondicionamiento
PROCEDIMIENTO

Mezclar la levadura seca con 25 ml de agua destilada en un vaso

pequeño.

Cubrir y dejar re hidratar durante 10 minutos a temperatura

ambiente.
Añadir 25 ml de solución de alginato de sodio a la suspensión de
levadura. Revuelva bien.
 Absorba un poco de la mezcla de levadura / alginato en una
jeringa.
Agréguelo, gota a gota, a la solución de cloruro de calcio.

Deje que las perlas de células de levadura inmovilizadas se

endurezcan en la solución de cloruro de calcio durante 5-10
minutos. El alginato será reticulada iónicamente por los iones de
calcio.
Separe las perlas de la solución con el colador de té.
Coloque las perlas en una solución de azúcar en un matraz
cónico. Tapónar el matraz con un tapón que ha sido equipado
con una llave de fermentación. Si se agrega un indicador
universal ala llave de fermentación, el indicador cambiará de
color a medida que se produce dióxido de carbono.

RESULTADOS Debido a no contar con el alginato adecuado no se logro

formar las perlas de Calcio.

CONCLUSION

- Las levaduras inmovilizadas sobreviven bastante tiempo en cloruro

de calcio. Aun así, conviene ponerlas a fermentar de vez en
cuando.

- El alginato de sodio debe ser puro y de buena calidad; no

obtuvimos buenos resultados con el que se vende en los
comercios de productos alimenticios, pero tal vez sea necesario
aumentar y ajustar la concentración
CUESTIONARIO

1. Para que es importante la inmovilización de levadura

 El aumento de la estabilidad de la enzima;

 La posible reutilización del derivado, por lo que disminuyen los
costes del proceso.
 La posibilidad de diseñar un reactor enzimático de fácil manejo y
control, adaptado a la aplicación de la enzima inmovilizada.

2. Que tipos de inmovilizaciones celular existen

2.1.1. Métodos de Inmovilización Irreversibles

El concepto de inmovilización irreversible implica el enlace del
biocatalizador a un soporte de manera permanente, por lo cual el
biocatalizador no puede ser liberado sin destruir o modificar su actividad
biológica o el soporte. Los procedimientos más comunes de
inmovilización irreversible son el enlace covalente, enlace cruzado,
atrapamiento y micro encapsulado.

a) Formación de enlaces covalentes

Los métodos de acoplamiento en general pueden dividirse en 2 clases:

1) activación de la matriz o soporte por adición de una función reactiva
en un polímero y 2) modificación del polímero para producir un grupo
activado. Los procesos de activación son comúnmente diseñados para
generar grupos electrofílicos en el soporte, el cual durante el
acoplamiento reaccionan con los fuertes nucleófilos en las proteínas.

Figura 1. Enzimas inmovilizadas en un soporte

físico por enlace covalente, las enzimas se
encuentran orientadas
espacialmente en el soporte
b) Formación de enlaces cruzados

Con esta técnica los soportes no son necesarios, ya que la

inmovilización se da por un enlace directo entre enzimas, que puede ser
mediado o no por un agente de unión. Generalmente se añade el
agente de bajo peso molecular (ej. glutaraldehído) a la enzima en
solución, uniendo covalentemente los grupos funcionales de las enzimas
para formar agregados (Figura 2). Este método tiene como ventaja su
sencillez, sin embargo, es susceptible a cambios pequeños de pH y
temperatura en las condiciones de operación (Gódia-Casablancas,
2005).

Figura 2. Enzimas inmovilizadas por enlaces

cruzados (líneas negras).

c) Atrapamiento
El método de atrapamiento está basado en la oclusión de las enzimas
dentro de una red polimérica que permite al sustrato y a los productos
pasar a través de ellos y retener las enzimas (O’Driscoll, 1976). Este
método difiere de los métodos de acoplamiento covalente descritos
anteriormente, ya que las enzimas no están enlazadas a la matriz o
soporte.
2.1.2 Métodos de Inmovilización Reversible
En el método de inmovilización reversible, las enzimas inmovilizadas

Por adsorción

El método de adsorción emplea soportes orgánicos o inorgánicos que

presentan un adsorbente activo (monocapastiol auto ensambladas,
oro, entre otros) en los cuales, las enzimas son atraídas y retenidas por
medio de interacciones iónicas o fuerzas débiles (puentes de hidrógeno,
fuerzas de Van der Waals, interacciones hidrofóbicas) (Figura 5) (Wood
et al., 1997). Este método consiste en poner en contacto la enzima en
solución acuosa con un soporte adsorbente por un lapso de tiempo
dado (2-48 h), para después lavar el soporte y eliminar la enzima que no
fue inmovilizada. Presenta la ventaja de mantener intacta la actividad
de la enzima, ya que la unión es débil y no afecta su conformación, sin
embargo, esta característica hace que al mismo tiempo la unión sea
reversible y sensible a cambios de pH y temperatura.

Figura 5. Enzimas inmovilizadas en un soporte

físico. A) Por adsorción, la región positiva de la
proteína interactúa
con el soporte negativo.

Adsorción no específica. El método de inmovilización reversible más

simple es la adsorción no específica, el cual se basa en la adsorción
física o enlace iónico (Messing, 1976; Woodward, 1985).
BIBLIOGRAFIA

 ARROYO, D. M. (1998). Inmovilización de enzimas.Fundamentos, métodos y

aplicaciones. Ars Pharmaceutica, 23 - 39.

 Bryshila Lupo Pasin, C. G. ( 2012). Microencapsulación con alginato en alimentos.

Técnicas y aplicaciones. Revista Venezolana de Ciencia y Tecnología de Alimentos.,
130-151.

 Garzón-Jiménez, C. B.-H. (23-34). INMOVILIZACIÓN MICROBIANA: TECNICAS Y

USOS EN EL TRATAMIENTO DE RESIDUOS TÓXICOS. Revista Sistemas Ambientales,
2008.