GESTIÓN DE RECURSOS Y SERVICIOS FO-SB-

Código
BIBLIOTECARIOS 12/v0
ESQUEMA HOJA DE RESUMEN Página 1/1
RESUMEN TRABAJO DE GRADO

AUTOR(ES):
NOMBRE(S): JENIFER APELLIDOS: CASTRO ESTRADA
NOMBRE(S): APELLIDOS:

FACULTAD: CIENCIAS AGRARIAS Y DEL AMBIENTE

PLAN DE ESTUDIOS: INGENIERÍA BIOTECNOLÓGICA

DIRECTOR:
NOMBRE(S): ADRIAN ÁNGEL APELLIDOS: MUTTO

TÍTULO DEL TRABAJO (TESIS): ANÁLISIS DEL EFECTO INDUCTOR SOBRE LA

CAPACITACIÓN CON DISTINTOS AGENTES EN ESPERMATOZOIDES BOVINOS
CRIOPRESERVADOS Y EVALUACIÓN DE SU CAPACIDAD FECUNDANTE

RESUMEN

En este trabajo se llevó a cabo tratamientos con distintos agentes sobre espermatozoides bovinos
criopreservados con el fin de inducir la capacitación espermática. Seguidamente se evaluó dicho
parámetro mediante la técnica de clortetraciclina (CTC), inducción de la reacción acrosomal con
Lisofosfatidilcolina (LPC) y viabilidad espermática. Por otra parte, se evaluó la capacidad
fecundante de los espermatozoides tratados, mediante maniobras de fecundación in vitro FIV y
se estudió el porcentaje de fecundación mediante la evaluación de pronúcleos y el clivaje
embrionario. En los resultados, el ATP estaría induciendo eventos tempranos asociados a la
capacitación. Los espermatozoides tratados con procaína adquirieron un cambio en el patrón de
motilidad, siendo este un batido asimétrico de la cola con motilidad progresiva. La cafeína
presentó un efecto significativo sobre el porcentaje de fecundación. Por último, las drogas no
tuvieron efecto en las tasas de clivaje embrionario en comparación al control.

PALABRAS CLAVE: capacitación in vitro, producción in vitro de embriones, capacidad

fecundante, clivaje embrionario.
CARACTERÍSTICAS:
PÁGINAS: 107 PLANOS: ILUSTRACIONES: 2 CD ROOM: 1
Elaboró Revisó Aprobó
Equipo Operativo del Comité de Calidad Comité de Calidad
Proceso
Fecha 24/10/2014 Fecha 05/12/2014 Fecha 05/12/2014
COPIA NO CONTROLADA
 ANÁLISIS DEL EFECTO INDUCTOR SOBRE LA CAPACITACIÓN CON DISTINTOS
AGENTES EN ESPERMATOZOIDES BOVINOS CRIOPRESERVADOS Y EVALUACIÓN
DE SU CAPACIDAD FECUNDANTE

JENIFER CASTRO ESTRADA

UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL AMBIENTE

PLAN DE ESTUDIOS DE INGENIERÍA BIOTECNOLÓGICA

SAN JOSÉ DE CÚCUTA

2017
 ANÁLISIS DEL EFECTO INDUCTOR SOBRE LA CAPACITACIÓN CON DISTINTOS
AGENTES EN ESPERMATOZOIDES BOVINOS CRIOPRESERVADOS Y EVALUACIÓN
DE SU CAPACIDAD FECUNDANTE

JENIFER CASTRO ESTRADA

Director:

Adrián Ángel Mutto, Bs.C., Ms.C., Ph.D

UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL AMBIENTE

PLAN DE ESTUDIOS DE INGENIERÍA BIOTECNOLÓGICA

SAN JOSÉ DE CÚCUTA

2017
 Resumen

Los espermatozoides de mamíferos son incapaces de fecundar a un oocito al momento de ser

eyaculados, por lo que necesitan desencadenar el proceso de capacitación espermática previo a la

fecundación en donde sufren una serie de cambios a nivel molecular y metabólico (Ferramosca y

Vincenzo, 2014). Estas modificaciones pueden ser emuladas en condiciones in vitro mediante la

técnica de fecundación in vitro. Una de las etapas críticas de la técnica de fecundación in vitro

radica en el éxito de la inducción de la capacitación espermática. Por esta razón, es

imprescindible profundizar el estudio de la capacitación espermática a nivel molecular, es decir,

los eventos de señalización que involucra este proceso con el fin de elevar las tasas de producción

embrionaria in vitro (Waremkraut, 2017).

Se llevó a cabo tratamientos con pentoxifilina (10 mM), procaína (5 mM), cafeína (10 mM) y

ATP (0.25 mM) sobre espermatozoides bovinos criopreservados con el fin de inducir la

capacitación espermática, como control positivo se utilizó heparina (50 μg/ml) y albumina de

suero bovino BSA (6mg/ml) como control negativo. Seguidamente se evaluó dicho parámetro

mediante la técnica de clortetraciclina (CTC), inducción de la reacción acrosomal con

Lisofosfatidilcolina (LPC) y viabilidad espermática. Por otra parte, se quiso evaluar la capacidad

fecundante de aquellos espermatozoides tratados, para lo cual se realizaron maniobras de

fecundación in vitro FIV, siguiendo la técnica de producción in vitro de embriones. Además, se

estudió el porcentaje de fecundación mediante la evaluación de pronúcleos y el clivaje

embrionario. Según los resultados obtenidos el ATP estaría induciendo eventos tempranos

asociados a la capacitación. Por otro lado, los espermatozoides tratados con procaína adquirieron

un cambio en el patrón de motilidad, siendo este un batido asimétrico de la cola con motilidad

progresiva. Por su parte, la cafeína resultó tener un efecto significativo sobre el porcentaje de
fecundación mediante la evaluación de los pronúcleos. Por lo que, se sugiere la cafeína, le

confiere al espermatozoide la motilidad necesaria para desprenderse de las células del cumulus

que rodean al oocito y pasar por la zona pelúcida, llegando al espacio perivitelino, pero no logra

penetrar el oocito. Por último los tratamientos con las diferentes drogas no tuvieron efecto en las

tasas de clivaje embrionario en comparación al control.

Palabras claves: capacidad fecundante, capacitación in vitro, clivaje embrionario, producción

in vitro de embriones, pronúcleos, reacción acrosomal.

 A mi Familia,
Mi más grande tesoro…
 Agradecimientos

Siempre pensaba en cómo lograr culminar esta parte de mi vida, tuve miedos e intrigas a lo

largo de mi formación y afortunadamente puedo decir que siempre estuve rodeada de personas

que de una u otra manera ayudaron a enfrentar mis miedos y a esclarecer mis dudas, por eso

espero no olvidarme de mencionar a alguien…

Primero quiero agradecer a Dios por permitirme vivir y darme la fuerza para luchar por las

cosas que deseo y disfrutar cada una de ellas. Por mis buenos y malos tiempos.

A Adrián, mi director, nunca voy a olvidar cuando me dijiste que podía ir a tu laboratorio, fue

de mis mejores días. Gracias por permitirme conocerte, por enseñarme a tu manera, que no tengo

que bajar la guardia y que siempre se tiene que intentar de todas las formas posibles, para llegar a

un objetivo. Te tomé mucho cariño así que te voy a extrañar un montón, espero encontrarte de

nuevo más adelante.

A mi familia, quien no solo me ha venido dando su amor y su apoyo incondicional, sino

también la fuerza para impulsarme a volar y seguir adelante con mis ocurrencias. Por

acompañarme en toda esta etapa de formación y por animarme a seguir, mil gracias. A mi mami

(la mejor mujer del mundo y la más linda) que nunca me deja sola, la mujer con la que me

identifico y la que me enseñó a ponerle la frente al mundo, las veces que fuesen necesarias. A

papi (quien es mucho mayor que yo, pero es el amor de mi vida) nunca me falta su apoyo

incondicional, en esta etapa y durante toda mi vida siempre lo demostró, estoy grandemente

agradecida y no me va alcanzar la vida para pagarte todo lo que has hecho por mí, muchas gracias

papi por ser tantas veces mi cómplice. A Quimby y tatita, mis bebés, gracias por seguir mí paso a

paso y alentarme a concluir.

 A mis chicas... Clauchi y Mic, gracias por enseñarme tanto, no solo en lo laboral, sino como

personas, son unas divinas. Clauchi eres mi imagen a seguir te admiro mucho y siento orgullo de

ti y lo que logras día a día. Mic, PARCE eres única me gustan todas tus facetas, incluso cuando

se te sale lo romántica. Bren, Carito, Clari, Maga, Vicki, Vivi, MicavM y Calu, fue un placer

conocerlas y poder trabajar a su lado, gracias por todo. Las quiero mucho.

También quiero agradecer a mis amigos y personas cercanas, quienes con una palabra o un

hecho me tocaron significativamente y a todas aquellas increíbles personas que conocí durante

esta linda y gran experiencia.

Se hace inmensa la lista cuando pienso en las personas a las que debo agradecer, y con las que

quiero compartir este logro. De igual manera, no podía dejar fuera a aquellos compañeros con

los que compartí todos estos años de universidad, los profesores que hicieron parte de mi

aprendizaje y mi desarrollo personal de forma peculiar, a la universidad misma y algunos de mis

familiares. Sin nada más que decir, infinitas gracias...

 Tabla de contenido

Pág.

Introducción 13

1. El problema 15

1.1. Titulo 15

1.2. Planteamiento del problema 15

1.3. Formulación del problema 15

1.4. Justificación 16

1.5. Objetivos 18

1.5.1. Objetivo general 18

1.5.2. Objetivos específicos 18

1.6. Delimitaciones 18

1.6.1. Espacial 18

1.6.2. Temporal 18

1.6.3. Conceptual 18

2. Marco referencial 20

2.1. Antecedentes 20

2.2. Marco teórico 26

2.2.1. El espermatozoide de mamíferos 26

2.2.2. Cambios funcionales del espermatozoide 27

2.2.3. Adquisición de la capacidad fecundante 28

2.2.4 Vías de señalización implicadas en la capacitación espermática 30

2.2.5 Agentes capacitantes 38

 2.2.6 Producción in vitro de embriones 42

2.3 Marco conceptual 46

2.4 Marco legal 48

2.5 Marco contextual 50

3. Metodología 51

3.1. Tipo de investigación 51

3.2. Población y muestra 51

3.2.1. Población 51

3.2.2. Muestra 51

3.3. Hipótesis 51

3.4. Variables 51

3.4.1. Dependientes 51

3.4.2. Independientes 51

3.4.3. Intervinientes 51

3.5. Fases de la investigación 51

3.5.1. Reactivos 51

3.5.2. Procesamiento del semen 52

3.5.3. Tratamiento con las distintas drogas 52

3.5.4. Determinación del estado de la capacitación espermática por la

técnica de clortetraciclina (CTC) 53

3.5.5. Análisis de la viabilidad espermática 55

3.5.6. Inducción de la reacción acrosomal por lisofosfatidilcolina (LPC) 55

3.5.7. Producción in vitro de embriones 57

3.5.8. Tinción de pronúcleos para evaluar porcentaje de fecundación 61

 3.5.9. Análisis Estadístico 63

4. Resultados 64

4.1. Evaluación del efecto de la procaína, pentoxifilina, cafeína y el ATP

sobre la motilidad espermática 64

4.2. Estudio del efecto de los distintos tratamientos en la inducción de

la capacitación espermática 65

4.2.1. Evaluación de la capacitación espermática 65

4.2.2. Estudio del efecto del tratamiento con ATP y cafeína sobre la

viabilidad espermática 70

4.3. Efecto de los tratamientos sobre la capacidad fecundante de los

espermatozoides bovinos criopreservados 70

4.3.1. Efecto de los tratamientos con ATP y cafeína sobre el porcentaje

de fecundación mediante la evaluación de pronúcleos 71

4.3.2. Clivaje embrionario 72

5. Discusión 75

6. Conclusiones 84

7. Recomendaciones 85

Bibliografía 86

Anexos 103
 Lista de figuras

Pág.

Figura 1. Esquematización del espermatozoide de mamífero. 26

Figura 2. Representación esquemática de las vías de regulación de la

capacitación espermática 32

Figura 3. Distintos parámetros de motilidad en espermatozoides bovinos 35

Figura 4. Esquematización de la reacción acrosomal de un espermatozoide 36

Figura 5. Esquema de producción y desarrollo de embriones bovinos 44

Figura 6. Oocito fecundado (cigoto) 45

Figura 7. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas (IIB) 50

Figura 8. Esquematización del tratamiento con las distintas drogas 53

Figura 9. Patrones de la técnica de CTC 54

Figura 10. Determinación de la capacitación espermática mediante la

inducción de la reacción acrosomal por LPC 56

Figura 11. Patrones de la técnica de inducción de la reacción acrosomal por LPC 57

Figura 12. Esquema de la producción in vitro de embriones 58

Figura 13. Acondicionamiento de los ovarios 59

Figura 14. Proceso de recolección y selección de los oocitos 60

Figura 15. Cultivo in vitro de embriones bovinos 62

Figura 16. Determinación de la capacitación espermática inducida por heparina 66

Figura 17. Determinación de la capacitación espermática inducida por heparina

en distintos tiempos 67

Figura 18. Determinación de la capacitación espermática inducida por la

procaína, Pentoxifilina, cafeína y ATP 68

Figura 19. Determinación de la capacitación espermática inducida por ATP

y cafeína por inducción de la reacción acrosomal con LPC 69

Figura 20. Estudio de la viabilidad espermática 70

Figura 21. Efecto de la cafeína y el ATP sobre el porcentaje de fecundación 71

Figura 22. Oocitos bovinos fecundados 72

Figura 23. Efecto de la cafeína y ATP sobre el clivaje embrionario 73

Figura 24. Efecto de la procaína y pentoxifilina sobre el clivaje embrionario 74

 Lista de tablas

Pág.

Tabla 1. Concentración final utilizada por cada tratamiento 52

Tabla 2. Evaluación subjetiva de la motilidad espermática 64

 Anexos

Pág.

Anexo 1. Medios utilizados y sus componentes 103

 13

Introducción

Los espermatozoides de mamíferos son incapaces de fecundar a un oocito al momento de ser

eyaculados, necesitan desencadenar el proceso de capacitación espermática previo a la

fecundación en donde sufren una serie de cambios a nivel molecular y metabólico (Ferramosca y

Vincenzo, 2014).

Durante la capacitación ocurre una serie de cambios celulares, la formación de una cantidad

limitada de especies reactivas de oxígeno y la fosforilación de proteínas en residuos tirosina, estas

alteraciones seguidamente desencadenan en la reacción acrosomal (Shih et al., 2016).

Adicionalmente, cuando el espermatozoide se capacita el orden de los lípidos y las proteínas de

membranas se someten a algunos cambios (Gadella et al., 2008).

Los cambios fisiológicos y morfológicos que conducen a la capacitación y a la reacción

acrosomal tanto in vivo como in vitro se han definido relativamente para pocas especies (Byrd,

1981).

La fecundación es un proceso complejo donde el punto final es la singamia (la unión de los

pronúcleos femenino y masculino), no se trata solo de la penetración del espermatozoide al oocito

sino de una interacción intercelular, altamente especializada en donde una gameta activa a la otra.

La fecundación incluye numerosos eventos como la maduración oocitaria, la reacción acrosomal,

penetración, fusión, reacción cortical, y fusión nuclear de ambos gametos. También mencionan

que la fecundación es una cascada de eventos que resulta de la unión de las gametas y el

establecimiento del potencial metabólico del cigoto (Bellido, 1997).

La aplicación de tecnologías en la reproducción animal, se conoce con el nombre de

biotecnologías reproductivas, la cual tiene importancia en la producción ya que permite la

 14

multiplicación de descendencia de animales de interés zootécnico (Benavides Torres, 2008). En

las últimas décadas se han realizado numerosos estudios para la mejor comprensión de los

sistemas biológicos intervinientes en la formación de embriones, ya sea en la maduración

oocitaria, fecundación o cultivo in vitro de embriones. La aplicación a gran escala de estas

biotecnologías reproductivas puede proporcionar una mejora notable de los recursos ganaderos ya

que permite obtener animales de gran importancia económica (Aponte Landinez et al., 2010).
 15

1. El problema

1.1 Título

Análisis del efecto sobre la capacitación con distintos agentes inductores en espermatozoides

bovinos criopreservados y la evaluación de su capacidad fecundante.

1.2 Planteamiento del problema

El espermatozoide es una célula haploide altamente diferenciada que comprende la gameta

masculina, se forma en los testículos y tiene como función fecundar al oocito, para dar lugar a la

fase donde se fusionan los pronúcleos y por ende la formación del cigoto (Sluder, 2016).

Una vez que los espermatozoides dejan el epidídimo en el tracto reproductor del macho no

poseen capacidad fecundante, deben pasar por una serie de procesos químicos y fisiológicos en el

tracto reproductor de la hembra que se conocen como capacitación espermática (Almog y Naor,

2008). Austin y Chang demostraron la necesidad del espermatozoide por pasar a través del tracto

reproductor femenino para la adquisición de la capacidad fecundante (Austin, 1951; Chang,

1951). Este proceso de capacitación puede ser reproducido in vitro utilizando medios definidos

que contienen metabolitos energéticos, BSA, HCO3- y Ca2+.

Para llevar a cabo la producción in vitro de embriones de distintas especies, se debe emular

eventos fisiológicos y bioquímicos en cada una de las etapas que conlleva a la formación de un

nuevo individuo, uno de ellos la capacitación espermática, aumentando la probabilidad de

obtener resultados que hacen de la biotecnología reproductiva una herramienta para lograr

aumentar la eficiencia reproductiva de los animales.

1.3 Formulación del problema

¿Es posible analizar el efecto de la pentoxifilina, procaína, cafeína, y ATP como inductores de
 16

la capacitación en espermatozoides bovinos criopreservados y evaluar su capacidad fecundante?

1.4 Justificación

La biotecnología de la reproducción comprende técnicas que permiten aumentar la eficiencia

reproductiva de los animales. La producción animal encuentra considerablemente significativa la

capacidad reproductiva, por esta razón la cría de animales de alto valor económico basa su

utilidad comercial en la fertilidad (Palma, 2008).

La técnica de fecundación in vitro (FIV) es una técnica reproductiva que proporciona un

control de las enfermedades reproductivas, el aprovechamiento de animales infértiles y

recuperación de razas, entre otras ventajas. Por otro lado, la creciente demanda de alimentos y

productos de origen animal exige promover la reproducción masiva de animales con alto valor

genético para así elevar la productividad y producción de los mismos (Bueno y López, 2014).

El proceso de fecundación in vivo ocurre posteriormente a una serie de eventos como la

deposición y el transporte de los espermatozoides a través del tracto reproductor femenino,

capacitación y selección espermática, determinando la interacción entre el oocito y el

espermatozoide dentro del oviducto concluyendo en la formación del cigoto. En el caso de la

fecundación in vitro en bovinos el semen debe ser tratado con agentes capacitantes en medios

definidos con el fin de lograr la capacitación espermática, la reacción acrosomal y por ende el

paso a través de las membranas ovocitarias de aquellos espermatozoides previamente

seleccionados con motilidad progresiva (Mutto, 2014). Dos pasos que poseen un roll importante

en el proceso de fecundación in vitro son: la incorporación de agentes inductores de la

capacitación espermática y la utilización de semen congelado-descongelado.

 17

La criopreservación es importante para la preservación de los gametos masculinos de animales

de valor zootécnico. Aunque la motilidad de los espermatozoides se ve afectada de forma

negativa por la criopreservación (Janice, Blodeau y Cormier, 2000), resulta en un mecanismo de

alta eficiencia para la difusión de material genético de excelente calidad en las técnicas de

reproducción como la inseminación artificial (Ribeiro Peresa et al., 2014).

Por otro lado, una de las principales ventajas de las técnicas para producir embriones in vitro

consiste en el alto número de producción y preñeces por unidad de tiempo que se obtienen,

debido al aumento poblacional mundial aparece una alta demanda hacia el consumo de alimentos

que no solo exige cantidad, sino también calidad, por ende, ha llevado a aumentar rápidamente la

población bovina mundial de leche, carne, cuero y demás productos. Ante este contexto, las

asociaciones de criadores y productores ganaderos recurrieron a las herramientas disponibles para

identificar los mejores reproductores mediante programas de selección y mejora genética en pro

de la producción in vitro (Ferré y Cattaneo, 2013).

Por esta razón la estandarización y mejoramiento de protocolos mediante la utilización de

diversos tratamientos para inducir la capacitación en espermatozoides bovinos y a su vez

incrementar la capacidad fecundante de los mismos, se ha venido estudiando con el fin de obtener

un mejor efecto en el proceso clave para la producción animal que es, la fecundación in vitro.
 18

1.5 Objetivos

1.5.1 Objetivo general. Realizar el análisis del efecto sobre la capacitación con

distintos agentes inductores en espermatozoides bovinos criopreservados y evaluar la

capacidad fecundante.

1.5.2 Objetivos Específicos. Efectuar tratamientos con el fin de inducir la

capacitación espermática con heparina, cafeína, pentoxifilina, procaína y ATP en

espermatozoides bovinos criopreservados.

Analizar el efecto de los distintos tratamientos en la inducción de la capacitación de los

espermatozoides bovinos criopreservados.

Evaluar la capacidad fecundante de los espermatozoides tratados con las distintas

drogas.

1.6 Delimitaciones

1.6.1 Espacial. Este proyecto se llevó a cabo en el laboratorio de Biotecnología

aplicada a la reproducción y mejoramiento genético animal del Instituto de

Investigaciones Biotecnológicas IIB-INTECH Dr. Rodolfo Ugalde en La Universidad

Nacional de San Martin (UNSAM), Av. 25 de Mayo y Francia, Campus UNSAM,

Edificio IIB, San Martín, Buenos Aires, Argentina.

1.6.2 Temporal. El tiempo estimado para el cumplimiento de los objetivos

establecidos fue de 8 meses.

1.6.3 Conceptual. El proyecto de investigación se basó en la recopilación de

datos para la evaluación del efecto de ciertos agentes capacitantes en espermatozoides

bovinos criopreservados y su habilidad fecundante. Se fundamentó en conceptos tales

como: biotecnología de la reproducción, capacitación espermática, mecanismo de acción

 19

de la heparina, cafeína, pentoxifilina, procaína y ATP, fecundación in vitro,

espermatozoides bovinos criopreservados, cigoto, pronúcleos y clivaje embrionario.

 20

2. Marco referencial
2.1 Antecedentes
Ghasemzadeh Aliye, Karkon Shayan Farid, Yousefzadeh Solmaz, Naghavi Behzad

Mohammad and Hamdi Kobra, 2016, Women's Reproductive Health Research Center, Tabriz

University of Medical Sciences, Medical Philosophy and History Research Center; Students'

Research Committee, Tabriz University of Medical Sciences, Irán, Study of pentoxifylline

effects on motility and viability of spermatozoa from infertile asthenozoospermic males,

Nigerial Medical Journal 57: 324-328

Diversos estudios han demostrado que la pentoxifilina mejora la calidad, viabilidad y

motilidad de los espermatozoides antes y después de la congelación. El uso de pentoxifilina antes

de la congelación ha conducido a una reducción de la tasa de viabilidad y el aumento de la tasa de

motilidad de los espermatozoides. En otro estudio sobre semen de perro, la tasa de viabilidad más

alta de los espermatozoides ha estado en condiciones de congelación y han sido tratados con 1

mM de pentoxifilina (Ghasemzadeh et al., 2016).

Parrish, 2014, Department of Animal Sciences, University of Wisconsin Madison, Bovine

in vitro fertilization: in vitro oocyte maturation and sperm capacitation with heparin,

Theriogenology 81: 67-73

Investigaciones sobre fecundación in vitro (FIV) de oocitos bovinos con semen congelado

descongelado y heparina como inductor de la capacitación ha sido importante para la mayoría de

los trabajos posteriores con FIV para la investigación o producción comercial de embriones. El

propósito de los experimentos fue demostrar que la heparina es capaz de aumentar la capacidad

fecundante de los espermatozoides bovinos in vitro. La primera observación fue que la heparina

induce la capacitación de los espermatozoides bovinos en lugar de la reacción acrosomal.

 21

Los cambios intracelulares durante la capacitación de espermatozoides bovinos inducidos por

la heparina han sido muy favorecidos por los efectos de la glucosa. Dado que el calcio es

importante para inducir la capacitación de los espermatozoides. La capacitación in vitro de

espermatozoides bovinos con heparina requiere de calcio extracelular que es absorbido y conduce

a un aumento de Ca2+ en la cabeza del mismo (Parrish, 2014).

Ibrahim Barakat, Mohamed A. Danfour, Fatma Galewan, and Mohamed A. Dkhil, 2015,

College of Science, King Saud University, Cell Biology Department, National Research Centre,

Physiology Department, Faculty of Medicine, Egypt, Effect of various concentrations of

caffeine, pentoxifylline, and kallikrein on hyperactivation of frozen bovine semen, BioMed

Research International 2015: 1-7

La cafeína, la pentoxifilina y la calicreína son sustancias que afectan la eficiencia de los

espermatozoides en el proceso de fecundación; Sin embargo, no se han estudiado adecuadamente.

Los espermatozoides bovinos congelados se descongelaron en medio FIV universal

suplementado con 1, 5 y 10 mM de cafeína o pentoxifilina o 1,4 y 8 U/mL de calicreína y luego

se incubaron durante 30 min. Se analizaron los parámetros del semen tratado utilizando un

analizador de semen (CASA). El análisis de los datos mostró que los valores medios relativos a la

progresión y la motilidad de los espermatozoides aumentaron en cafeína y pentoxifilina en

comparación con el grupo de calicreína. Los resultados en este trabajo revelaron que 5mM de

cafeína era la mejor concentración añadida al medio, seguida por 1 o 5 mM de pentoxifilina. Por

lo tanto, se concluye a partir del presente estudio que una concentración de cafeína (5mM) tiene

una eficacia de hiperactivación en comparación con otros tratamientos (Barakat et al., 2015).

Harrison, R.A.P, 2004, Laboratory of Gamete Signalling, The Babraham Institute,

Cambridge, United Kingdom, Rapid PKA-catalysed phosphorylation of board sperm

 22

proteins induced by the capacitating agent bicarbonate, Molecular Reproduction and

Development 67: 337–352

La capacitación in vitro de espermatozoides se puede inducir mediante su incubación en

medios de fecundación donde el bicarbonato y el CO2 parecen ser componentes esenciales. Se ha

demostrado que el bicarbonato presenta cambios inductores y por ende es considerado un agente

capacitante produciendo cambios en los lípidos de la membrana y la motilidad. Los

espermatozoides de mamíferos responden a señales medioambientales a través de vías de

señalización. Numerosos estudios como los de Brokaw, (1987), Visconti et al., (1995) y

Wennemuth et al., (2003) han indicado que el AMP cíclica (AMPc) desempeña una función de

mensajero secundario en la iniciación de al menos algunas de estas vías, aparentemente actuando

en gran medida a través de la estimulación de la proteína kinasa cíclica dependiente de AMP

(PKA).

La via PKA está implicada en los cambios de la motilidad y la arquitectura de los lípidos de la

membrana plasmática del espermatozoide. Estos cambios pueden ser inducidos por bicarbonato

en ausencia de Ca2+, como también pueden ser inducidos por la aplicación directa de análogos de

AMPc, que aun en presencia de H89 un inhibidor específico de la PKA, existe evidencia según

Okamura et al., (1985), Chenet et al., (2000) y Jaiswal y Conti, (2001) de que la estimulación con

bicarbonato de la adenililciclasa aumenta los niveles intracelulares de AMPc y por ende activa la

PKA (Harrison, 2004).

Pablo E. Visconti, Dario Krapf, José Luis de la Vega Beltrán, Juan José Acevedo and

Alberto Darszon, 2011, Department of Veterinary and Animal Science, Paige Labs, University of

Massachusets, USA, Ion channels, phosphorylation and mammalian sperm capacitation,

Asian Journal of Andrology 13: 395-405

 23

Esta revisión examina la participación de los transportadores de iones y fosforilación de los

procesos de señalización necesarios para que los espermatozoides logren la capacitación. Un

cambio crítico en el medio que rodea a los espermatozoides después de la eyaculación es el

cambio en la concentración de HCO3-, Además de la importancia mencionada de este anión para

regular pH, existe una conexión entre HCO3- y la vía AMPc. Esta observación histórica indicó

que Ca2+ regulaba los niveles de AMPc sólo cuando HCO3- estaba presente en el medio de

incubación. Está bien establecido que los inhibidores de la PKA tales como H89 y el inhibidor de

la proteína quinasa peptídica bloquean la motilidad del espermatozoide y otras vías de

señalización aguas abajo Aunque AMPc tiene múltiples objetivos, estos experimentos sugieren

que PKA tiene un papel relevante en la capacitación (Visconti et al., 2011).

Ying-Fu Shin, Shu Ling Tzeng, Wen Jung Chen, Chun Chia Huang, Hsiu Hui Chen,

Tsung Hsien Lee and Maw Shen Lee, 2016, Institute of Medicine, Chung Shan Medical

University, Taiwan, Effects of synthetic serum supplementation in sperm preparation media

on sperm capacitation and function test results, Oxidative Medicine and Cellular Longevity,

2016: 1-8

La albúmina induce la capacitación de espermatozoides en técnicas de reproducción asistida,

aunque el suero sintético ha sido usado clínicamente para reemplazar la albúmina, su efecto como

inductor ha sido raramente investigado, la suplementación con este suero puede variar su efecto

según la combinación de los medios y son estas diferencias las que pueden conducir a variaciones

en los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) de los espermatozoides afectando su

función espermática (Shih et al., 2016).

Becky Marquez y Susan S. Suarez, 2004, Department of Biomedical Sciences, College of

Veterinary Medicine, Cornell University, New York, Different signaling pathways in bovine

sperm regulate capacitation and hyperactivation, Biology of Reproduction 70: 1626-1633

 24

Se ha demostrado que la vía de AMPc regula la fosforilacion de varias proteínas en residuos

de tirosina a través de la activación de la proteína quinasa (PKA). El semen de toro se puede

cultivar en un medio que induce la capacitación pero que no produce motilidad hiperactivada, la

hiperactivación puede ser inducida con procaína o cafeína. Puesto que estos agentes pueden

hiperactivar los espermatozoides sin la capacitación como prerrequisito, proporcionan un modelo

de estudio para la distinción de la vía reguladora de la hiperactivación de la capacitación.

La cafeína indujo la hiperactivación en casi 100% de espermatozoides móviles pero no

aumentó la fosforilación de la proteína en residuos tirosina. Por otro lado, después de 4 horas de

incubación de los espermatozoides con cafeína, expresó la fosforilación de la proteína en residuos

tirosina asociada a la capacitación pero la hiperactivación se redujo significativamente.

Este estudio demostró que la inducción de la hiperactivación no depende de la vía

AMPc/PKA, esta requiere de Ca2+, lo que indica que la hiperactivación esta mediada por una vía

de señalización independiente de la vía asociada la adquisición de la respuesta acrosomal y no

implica la fosforilación de las proteínas en residuos tirosina por parte de la procaína o la cafeína

(Marquez y Suarez, 2004).

De la Vega Adolfo, Wilde Osvaldo, Cruz M, 1997, Facultad de Agronomía y Zootecnia,

Universidad Nacional de Tucumán, Efecto de la pentoxifilina y la cafeína sobre la motilidad

de espermatozoides bovinos criopreservados, Avances en Ciencias Veterinarias 12: 75-79

El efecto estimulatorio de las metilxantinas sobre la motilidad de los espermatozoides frescos,

es ampliamente conocido, a fin de determinar si es posible obtener un comportamiento similar al

observado en semen fresco se utilizaron concentraciones mayores de cafeína y se probó un nuevo

agente perteneciente a las metilxantinas, la pentoxifilina (De la vega, Wilde Y Cruz, 1997).

Gardón, Matás, y Gadea, 2001, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de

Lomas de Zamora, Argentina, Departamento de Biología Animal, Facultad de Veterinaria.

 25

Universidad de Murcia. España. Efecto del protocolo de preparación de los espermatozoides

bovinos sobre el patrón de reacción acrosomal, Anales de Veterinaria de Murcia 17: 19-26

Se analizó el proceso de reacción acrosomal mediante la tinción con lectinas de muestras de

semen bovino congelado que fueron sometidos a diferentes tratamientos. La adición de heparina

y cafeína supone un aumento significativo del número de espermatozoides con los acrosomas

reaccionados. Lo que confirman que la preparación de los espermatozoides para la fecundación in

vitro afecta al patrón de capacitación y reacción acrosomal, de manera que pueden ser

determinantes para el proceso de fecundación. Los resultados obtenidos muestran un efecto de la

heparina y la cafeína sobre el patrón de reacción acrosomal, reduciendo de forma significativa el

número de espermatozoides intactos (Gardón, Matás y Gadea, 2001).

Los antecedentes anteriormente nombrados fueron necesarios para llevar a cabo esta

investigación debido a que muestran datos y protocolos clave para el desarrollo adecuado de

algunas técnicas a utilizar y la comprensión del mecanismo de acción de cada una de las drogas

empleadas para la capacitación espermática en bovinos.

 26

2.2 Marco teórico

2.2.1 El espermatozoide de mamíferos. El espermatozoide es una célula

haploide altamente especializada que constituye la gameta masculina cuya función es fecundar al

oocito, aportando la información genética complementaria a la gameta femenina para la

formación de un cigoto. Estas células fueron identificadas por primera vez en semen de humanos,

perros, conejos y peces en 1676 por el microscopista Anton van Leeuwenhoek y el estudiante de

medicina Johan Ham. Sin embargo, el espermatozoide fue reconocido como una célula, recién en

1840 por Albert von Koelliker (Yanagimachi, 2012).

En cuanto a su morfología, el espermatozoide está conformado por dos partes principales: la

cabeza y la cola (Figura 1) ambas recubiertas por una membrana plasmática (De Lamirande et al.,

1997). Las divisiones subcelulares en la parte de la cola han sido relacionadas con diferentes

cambios bioquímicos sugiriendo una comunicación muy regulada para cada división (Torres

Fuentes, 2015).

Figura 1. Esquematización del espermatozoide de mamífero (Olivera et al., 2006). Tomado de (Osycka
Salut, 2010)
 27

La cabeza posee un núcleo haploide, el acrosoma y el citoplasma. El núcleo es más compacto,

la condensación de la cromatina es debido al reemplazo de histonas por protaminas y en

consecuencia no ocurre la transcripción. La inactividad transcripcional conlleva a que el

espermatozoide sea dependiente de modificaciones post-traduccionales como la fosforilación de

las proteínas para adaptar su función de acuerdo a las necesidades (Olivera et al., 2006). El

acrosoma cubre el extremo anterior del núcleo, es un saco membranoso que se adhiere al núcleo

en las últimas etapas de la espermatogénesis y contiene acrosina, hialuronidasa y otras enzimas

partícipes en el proceso de la fecundación (Garner y Hafez, 1996).

La cola o flagelo es la parte responsable de la motilidad del espermatozoide. La cola

espermática está conformada por el cuello, los segmentos medios que tienen lugar entre el cuello

y el anillo citoplasmático, principal y caudal. En el centro de ese segmento medio se encuentra el

axonema el cual está cubierto periféricamente por un alto número de mitocondrias dispuestas en

un patrón helicoidal (Vera, 2008).

En el cuello, la porción que une la cabeza con la cola están localizados los centríolos: el

centríolo proximal se sitúa en la parte basal del núcleo y el centríolo distal da origen a los

microtúbulos del axonema. El axonema recorre toda la cola y es la principal porción motora del

flagelo: está compuesto por microtúbulos, moléculas chaperonas, proteínas fijadoras de calcio y

proteínas quinasas/fosfatasas. En la pieza media del espermatozoide se localizan las

mitocondrias que aportan el ATP necesario para el movimiento del flagelo (Scott, 2003; Eddy,

2006; Olivera et al., 2006)

2.2.2 Cambios funcionales del espermatozoide. Al momento que los

espermatozoides abandonan el testículo ya son células altamente diferenciadas pero aún no

poseen la habilidad para moverse o para fecundar un oocito. La maduración espermática consta
 28

del conjunto de habilidades que va adquiriendo el espermatozoide durante su paso a través del

epidídimo.

Una de las modificaciones que experimentan los espermatozoides durante este pasaje es el

desarrollo de la motilidad progresiva (Garner y Hafez, 1996). Por otro lado, a nivel de la

membrana plasmática ocurre una reorganización lipídica y proteica. Las células epididimarias, en

particular las pertenecientes a la cabeza y cuerpo del epidídimo, secretan una variedad de

proteínas, algunas de las cuales se unen a la membrana de los espermatozoides (Yanagimachi,

1994).

Los espermatozoides son susceptibles a los cambios de pH cuando se diluyen

significativamente con secreciones luminales del tracto reproductor femenino durante el

transporte al sitio de fecundación (Hafez, 2002).

2.2.3 Adquisición de la capacidad fecundante. La adquisición de la capacidad

fecundante consta de dos procesos, la maduración espermática que la adquiere durante su tránsito

por el epidídimo del macho y la capacitación espermática la cual se desencadena por su recorrido

por el tracto de la hembra.

Maduración espermática. Durante este proceso, que ocurre en el epidídimo, la membrana

plasmática del espermatozoide sufre una serie de cambios, entre ellos una reorganización lipídica

y proteica que le proveen nuevas propiedades antigénicas y la motilidad necesaria para llevar a

cabo la fecundación (Yanagimachi, 1994).

A nivel estructural, se produce la pérdida de la gota citoplasmática y la formación de puentes

disulfuro en la cabeza y la cola, estas modificaciones le otorgan estabilidad (Olivera et al., 2006).

En paralelo, las células del epidídimo poseen una síntesis elevada de colesterol, que es

transferido a la membrana plasmática del espermatozoide. Esta modificación de la membrana es

 29

crítica durante la maduración, ya que le aporta una gran estabilidad, necesaria para poder

atravesar el tracto femenino (Suzuki, 1990).

Capacitación espermática. La capacitación espermática incluye cambios moleculares y

bioquímicos a través de los cuales los espermatozoides adquieren la competencia de iniciar la

reacción acrosomal y la posterior fecundación. A medida que ocurre la capacitación se van

produciendo cambios a nivel interno y externo en los espermatozoides, a nivel molecular dichos

cambios incluyen: aumento en los niveles de AMPc, incremento de fosforilación de proteínas en

residuos tirosina por una vía dependiente de AMPc (Visconti et al., 2011), Activación de la vía

AMPc/ proteína quinasa A (PKA) (Harrison, 2004), aumento del pH intracelular (pHi) (Zeng,

Oberdorf y Florman, 1996), un aumento de la concentración intracelular de Ca2+ (Byrd, 1981;

Fraser, 1982; Ruknudin y Silver, 1990), se presenta una hiperpolarización de la membrana

(Demarco et al., 2003; Escoffier et al., 2012) sumado a cambios en la composición y fluidez de la

misma por la remoción del colesterol (Davis, 1980; Go y Wolf, 1985; Cross, 1996), generación

de especies reactivas del oxígeno (Lamirande y Gagnon, 1993) y motilidad hiperactivada de los

espermatozoides (Tulsiani, 2012). Este proceso no es distinguible morfológicamente (Bedford,

1970), es reversible (Bedford y Chang, 1962; Bedu-Addo et al., 2005) y ocurre en todos los

mamíferos (Saling y Bedford, 1981).

Los espermatozoides de mamíferos también pueden ser capacitados in vitro incubándolos en

un medio químicamente definido suplementado con sustancias energéticas como el piruvato y la

Albúmina de Suero Bovino (BSA) (Tulsiani, 2012) y en ausencia del fluido seminal. La

remoción de este fluido es esencial ya que contiene factores decapacitantes que se adhieren a la

membrana del espermatozoide (Yanagimachi, 1994). La composición del medio donde se realiza

una capacitación in vitro varía según la especie, pero usualmente son modificaciones de la
 30

solución de Tyrode´s y Krebs-Ringer. Básicamente estos medios contienen iones (Ca2+ y HCO3-),

metabolitos energéticos y seroalbúmina como aceptor de colesterol (Yanagimachi, 1994).

Asimismo, en ciertas especies es necesario incluir un agente capacitante en el medio, como la

taurina o hipotaurina para espermatozoides de hámster (Chung, Randall y Stanley, 1979) y

heparina para espermatozoides bovinos (Parrish, Susko-Parrish y First, 1989).

2.2.4 Vías de señalización implicadas en la capacitación espermática. El

proceso de capacitación espermática fue descripto por Austin y Chang hace ya más de 60 años.

Sin embargo, los mecanismos moleculares propios de este proceso todavía no se comprenden en

su totalidad.

Si bien, existen distintas vías de señalización vinculadas a los diversos eventos que conllevan

a la capacitación espermática, en la Figura 2 se resumen los eventos más destacados de este

proceso.

Como ya se ha mencionado, uno de los primeros eventos que ocurre durante la capacitación,

es la remoción del colesterol de la membrana plasmática del espermatozoide (Langlais y K. D.

Roberts, 1985). Como consecuencia, hay un aumento en la permeabilidad de la misma. Por un

lado, se produce el ingreso de HCO3- al espermatozoide, mediado por un miembro de la familia

de cotransportadores de Na+/ HCO3-: NBC (Demarco et al., 2003), Sumado a ello, hay un

transporte de Ca2+ al interior de la gameta a través de diversos canales. Estos dos eventos

conducen a la activación de un adenilato ciclasa atípica característica de espermatozoides,

denominada Adcyc10 o adenilato ciclasa soluble, la cual resulta en un incremento en los niveles

intra y extracelulares de AMPc (Garty y Salomon, 1987; Osycka Salut et al., 2014). El

incremento de este segundo mensajero resulta en la activación de una PKA, en la cual se fosforila

distintos sustratos en residuos Serina (Ser) y treonina (Thr). Así mismo, la actividad de esta
 31

quinasa es controlada por una fosfatasa Ser/Thr como PP2A, la cual es regulada por una quinasa

de la familia Scr mediante un mecanismo desconocido (Visconti et al., 2011). La fosforilación de

sustratos de PKA deduce en la activación de tirosinas quinasas. Como consecuencia, se produce

un aumento de proteínas fosforiladas en residuos tirosina. Este evento se encuentra asociado con

la capacitación y es utilizado extensamente como indicador del estado de capacitación de los

espermatozoides (Visconti et al., 1995; Galantino Homer, Visconti y Kopf, 1997). En un estudio

reciente en murinos, se identificó la proteína FER, como implicada en la regulación de la

fosforilacion de residuos tirosina durante el evento de la capacitación (Alvau et al., 2016).

Visconti et al., (1995) observaron que si los espermatozoides eran incubados en condiciones

capacitantes pero en ausencia de Ca2+ en el medio, no ocurre un incremento en el patrón de

fosforilación de proteinas en residuos tirosina, incluso en presencia de BSA y HCO3-. Por lo

tanto, el aumento en la fosforilación en residuos tirosina es dependiente de Ca2+ (Visconti et al.,

1995). No obstante, se observó recientemente que la ausencia total de Ca2+ tiene un conrol

negativo sobre la actividad de la PKA y la fosforilación en residuos tirosina al incorporar un

quelante de calcio y otros metales al medio de capacitación, se detectó un incremento en la

actividad de PKA y un fornido aumento en la fosforilación en residuos tirosina, sugiriendo la

existencia de otras proteinas dependientes de Ca2+ que regularían de forma negativa la actividad

de la PKA (Navarrete et al., 2015).

 32

Figura 2. Representación esquemática de las vías de regulación de la capacitación espermática.

Adaptado de (Visconti et al., 2011).

Numerosos estudios señalaron la importancia del Ca2+ en la capacitación de los

espermatozoides. Reyes, Goicoechea y Rosado (1978) demostraton que la presencia de Ca2+

extracelular es necesaria para la capacitación de espermatozoides de conejo (Reyes, Goicoechea y

Rosado, 1978), lo mismo fue señalado por Byrd ( 1981) en espermatozoides de eyaculado en

bovinos (Byrd, 1981), además, Fraser (1982) estudio especificamente los requerimientos de Ca2+

durante el período de capacitación de espermatozoides de ratón extraídos del epidídimo.

 33

Durante la capacitación del espermatozoide con heparina y en presencia de Ca2+ extracelular

el acrosoma acumula Ca2+ y luego comienza a aumentar su concentración en el citoplasma, lo que

indica que el calcio interviene en el desarrollo de la reacción acrosomal y estimula la vía

AMPc/PKA al activar el adenilato ciclasa como se muestra en la Figura 2. En los

espermatozoides bovinos, al capacitarlos con heparina en un pH de 6,70 a 6.92 durante 5 horas,

se demostró que este cambio de pH inicia la motilidad de los espermatozoides y modera la

fosforilación de al menos cuatro proteínas espermáticas (Carr y Acott, 1989).

Por otro lado, se estudió el requerimiento concentración dependiente de sero albúmina bovina

BSA durante la capacitación. Se encontró que los espermatozoides de eyaculado bovino se

capacitan en 2 a 3 horas en un medio definido conteniendo 6 mg/ml de BSA. La dependencia de

la concentración de BSA en la fosforilación fue claramente correlacionada con el estado

capacitado de los espermatozoides, con la competencia de los mismos para experimentar la

reacción acrosomal en respuesta a un estímulo y con la habilidad de fecundar oocitos intactos in

vitro (Visconti et al., 1995). El rol de la BSA durante la capacitación es remover el colesterol de

la membrana plasmática (Go y Wolf, 1985).

Se estimó que el bicarbonato podría tener un rol en la fecundación, debido a la presencia de

este en el útero y en el oviducto en una concentración doble en comparación a la concentración

encontrada en el plasma al incubar espermatozoides de ratón con oocitos intactos en medio sin

bicarbonato, puesto que no hubo fecundación y, además, determinaron que el bicarbonato era

necesario para la reacción acrosomal (Lee and Storey, 1986; Neill and Olds-Clarke, 1987).

además, cuando se presenta una entrada de bicarbonato al espermatozoide, aumenta el pH y

estimula la adenilato ciclasa atípica específica de espermatozoide denominada Adcyc10 (Garty y

Salomon, 1987).
 34

El aumento intracelular del pH es esencial para la iniciación y regulación de distintos eventos

asociados a la capacitación, hiperactivación y reacción acrosomal (Darszon et al., 2007).

Diversos transportadores y canales son participe en la regulación de pHi de espermatozoides de

mamíferos tales como intercambiadores de Na+/H+, transportadores de HCO3- , canales CatSper,

entre otros. En el espermatozoide bovinos, el pHi varía de 6,70 a 6,92 durante la capacitación

espermática inducida por heparina (Vredenburgh Wilberg y Parrish, 1995). Esta modificación en

los niveles del pH es la causa del inicio de la motilidad de los espermatozoides y media la

fosforilacion de al menos cuatro proteínas espermáticas, después de ser eyaculados (Carr y Acott,

1989).

Hiperactivación. Durante el proceso de capacitación espermática, se observa un cambio en el

patrón de la motilidad de los espermatozoides, este proceso denominado hiperactivación se

caracteriza por ser un movimiento de alta amplitud del flagelo asociado a un batido asimétrico del

mismo (Yanagimachi, 1994). En el recorrido hacia el oocito, el espermatozoide se adhiere a las

criptas oviductales (Yanagimachi y Chang, 1963) por lo que este movimiento amplio y acelerado

del flagelo, le permite al espermatozoide moverse en círculos para liberarse de las mismas,

avanzar a través del lumen y alcanzar la ampolla (zona donde ocurre la fecundación),

aumentando las probabilidades de encontrar al oocito (Suarez, 2008), atravesar las células del

cumulus que lo rodean (Suarez et al., 1991) y unirse a la zona pelúcida (Stauss, Votta y Suarez,

1995).

Conforme la especie y las características del medio donde se encuentra el espermatozoide, el

termino hiperactivación varía. Ho y Suarez (2001) sugieren diferenciar la motilidad hiperactivada

en comparación con la motilidad activada. Cuando los espermatozoides se encuentran en contacto

con el plasma seminal, los mismos presentan una motilidad activada (Ho y Suarez, 2001) dicha
 35

motilidad se caracteriza por ser vigorosa y que sigue una trayectoria lineal () en cambio los

espermatozoides hiperactivados recuperados de la ampolla del oviducto, realizan giros más

vastos y presentan un batido flagelar asimétrico (Figura 3B) (Ho y Suarez, 2001).

Las cascadas de transducción de señales que regulan la hiperactivación no se encuentran

completamente descriptas, pero existen una serie de factores fisiológicos tales como Ca2+, AMPc,

bicarbonato de sodio y sustratos metabólicos que son esenciales para el inicio y el sostenimiento

de la motilidad hiperactivada in vitro. El Ca2+ en particular posee un papel importante en la

regulación de la motilidad. Se encontró que la concentración intracelular de Ca2+ es mayor en

espermatozoides hiperactivados que en espermatozoides que presentan motilidad progresiva

(Figura 3C) (Suarez, Varosi y Dai, 1993), así mismo, la concentración de este catión es mayor en

la cola que en la cabeza de un espermatozoide hiperactivado.

Figura 3. Distintos patrones de motilidad en espermatozoides bovinos. (A): batido simétrico del flagelo
de un espermatozoide activado. (B): batido flagelar asimétrico de espermatozoides hiperactivados. (C):
motilidad progresiva de un espermatozoide hiperactivado. Adaptado de (Ho y Suarez, 2001).
 36

En síntesis, para inducir este aumento en el movimiento y flexión del flagelo, una gran

amplitud del desplazamiento lateral de la cabeza y una trayectoria curva se requiere de Ca2+

extracelular, una elevación intracelular de AMPc y disminución del pH intracelular (Arenas et

al., 2010).

Aunque la hiperactivación suele ser consecuencia de la capacitación, los dos eventos están

regulados por diferentes vías, por lo que podrían considerarse como eventos independientes (Ho

y Suarez, 2001).

Reacción Acrosomal. La reacción acrosomal es un proceso que consiste en la fusión en

múltiples puntos entre la membrana acrosomal externa y la membrana plasmática que lo recubre,

lo que permite la liberación del contenido acrosomal a través de los poros formados, que son

fundamentales para el paso por la zona pelúcida (Olivera et al., 2006). Como se mencionó

anteriormente, los cambios fisiológicos que ocurren durante la capacitación, permiten a los

espermatozoides iniciar el proceso de reacción acrosomal (Yanagimachi, 1994).

Figura 4. Esquematización de la reacción acrosomal de un espermatozoide. Tomado de (Fox, 2011).

 37

Cada espermatozoide posee un acrosoma único, cuyo tamaño y forma varía considerablemente

entre las especies (Zhao et al., 2007). La formación de esta vesícula, que deriva a partir del

aparato de Golgi, es un proceso altamente simultáneo y lento en comparación con la biogénesis

de otras vesículas secretoras. En mamíferos, está diferenciación sucede durante la

espermatogénesis (Moreno y Alvarado, 2006). El mecanismo molecular que emprende la

reacción acrosomal involucra la entrada masiva de Ca2+, el aumento del pHi y la producción de

compuestos fusogénicos (Yanagimachi, 1994).

A diferencia de la capacitación, la reacción acrosomal es un proceso exocitótico irreversible y

distinguible morfológicamente (Yanagimachi, 1994). Otra secuela es la fusogenicidad del

segmento ecuatorial, dado que este fragmento de membrana no está involucrado en la

vesiculización de las membranas (Yanagimachi, 1994) lo que conduce a una reorganización

proteica en las que se exponen una variedad de proteínas implicadas en la fusión con el oocito

como lo son Izumo 1 (Okabe, 2011) y CRISP1 (Da Ros V. y col., 2007), entre otras.

Anteriormente, se aceptaba que los espermatozoides experimentaban la reacción acrosomal a

continuación de la interacción con la zona pelúcida del oocito, específicamente mediante la unión

a ZP3 (glicoproteína de la zona pelúcida), en hamster (Cherr et al., 1986; Uto et al., 1988),

conejo (O’Rand y Fisher, 1987) y humanos (Cross et al., 1988). Sin embargo, la obtención de

imágenes en tiempo real de la fecundación in vitro de los complejos cúmulos-oocitos (COCs)

reveló que la mayoría de los espermatozoides experimentan la reacción acrosomal antes de

ponerse en contacto con la zona pelúcida (Jin et al., 2011). A su vez, un número relevante de

espermatozoides iniciaría la reacción acrosomal en el segmento superior del istmo oviductal,

previo al encuentro con el oocito (La Spina et al., 2016).

 38

Ciertas evidencias experimentales estarían demostrando que la reacción acrosomal podría

considerarse como una respuesta ante un agonista derivado del oocito (Kopt, 1990; Roldan y

Harrison, 1990). En los últimos años han surgido grupos de investigación que intentan esclarecer

donde acontece y cuál sería el inductor fisiológico de la reacción acrosomal en los

espermatozoides de mamíferos.

2.2.5 Agentes capacitantes. En diversas especies, los espermatozoides necesitan

de un agente capacitante para desencadenar la capacitación espermática, este evento es

fundamental para llevar a cabo la fecundación in vitro. A continuación, se describen los agentes

capacitantes in vitro utilizados en este trabajo.

Definición y mecanismo de acción

Heparina. La heparina es un grupo heterogéneo de mucopolisacáridos aniónicos de cadena

recta llamados glicosaminoglicanos, está presente en el tracto genital de la hembra y promueve la

capacitación espermática in vitro. Su utilización está ampliamente difundida debido a que

produce la capacitación espermática sin inducir la reacción acrosomal (Breininger et al., 2003).

Además de su uso como inductor fisiológico de la capacitación espermática en bovinos, ha sido

utilizada en otras especies como el porcino (Dapino, Marini y Cabada, 2006) y el equino (Varner,

Bowen y Johnson, 1993; Alm et al., 2001) . Se comprobó que este agente causa un aumento de

pH y de la concentración de calcio intracelular, la fosforilación de proteínas en residuos tirosina

y la modificación de los parámetros de la motilidad (Fernández y Córdoba, 2014). La heparina se

une específicamente a los espermatozoides de manera saturable, reversible, dependiente del pH,

la temperatura y la concentración de Ca2+ en el medio; la heparina promueve la captación de este

ion por parte de las células a través de canales iónicos aumentando los niveles de AMPc.
 39

Su acción inductora estaría relacionada con la sulfatación de compuestos como condroitín

sulfato A, B o C y el ácido hialurónico siendo la heparina el glicosaminoglicano con mayor

efecto inductor capacitante (Reyes, 1992). Según estudios de Parrish et al., (1985) su actividad

como inductor de la capacitación depende de su concentración en el medio de incubación.

(Parrish, Susko-Parrish y First, 1989) Por otro lado el efecto inductor de la heparina es bloqueado

por la presencia de glucosa en el medio, se cree que la glucosa estaría alterando el ATP y el pH

celular, sin embargo, First y Parrish, (1988) señalan que este efecto se podría revertir con la

adición de cafeína al medio sugiriendo un efecto sinérgico entre ambas sustancias (Parrish,

Susko-Parrish y First, 1989).

Se han descrito tasas de fecundación in vitro sobre el 70%, utilizando dosis entre 10 a

20 µg/ml de heparina (Lee y Ax, 1984; Parrish, Susko-Parrish y First, 1989). La heparina se

uniría a los espermatozoides bovinos a las dos horas (Handrow et al., 1984). Sin embargo, la

capacidad fecundante de éstos se empieza a expresar entre 2-3 horas (Florman y First, 1988;

Parrish, Susko-Parrish y First, 1989; De los Reyes, 1992). Por otro lado, se ha demostrado que

las tasas de fecundación in vitro de oocitos bovinos, aumentan significativamente cuando se

agrega cafeína al medio de incubación con heparina (Niwa y Ohgoda, 1988).

Pentoxifilina. La pentoxifilina es un derivado de la metilxantina. La pentoxifilina actúa como

un inhibidor de la metilxantina-fosfato-diesterasa, disminuye los aniones superóxido e inhibe el

factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa) responsable de la fragmentación del ADN y la

apoptosis (Peeker, Abramsson y Marklund, 1997; van Furth et al., 1997). Además, aumenta los

niveles de AMPc intracelular (Yovich, 1993). Estimula la motilidad del espermatozoide, y mejora

la fecundación (Numabe et al., 2001; Henkel y Schill, 2003).

 40

Estudios han demostrado que la pentoxifilina mejora la calidad del espermatozoide humano

(Ghasemzadeh et al., 2016). Conforme algunos estudios, la pentoxifilina influye en la motilidad

del espermatozoide humano, aumenta la proporción de espermatozoides hiperactivados, mejora la

reacción acrosomal y actúa como antioxidante (Gavella, Lipovac y Marotti, 1991) Sin embargo,

en equinos Silva et al. (2009) investigaron el efecto de la pentoxifilina sobre espermatozoides de

semen congelado-descongelado y demostraron que la pentoxifilina no manifiesta un efecto

positivo sobre la motilidad del espermatozoide (Silva et al., 2009). No obstante, incrementa la

proporción de espermatozoides vivos capacitados en la misma especie (Ortgies et al., 2012). Por

otra parte, Barakat et al., (2015) mostraron en su trabajo los efectos beneficiosos de la

pentoxifilina en la mejora de la motilidad de los espermatozoides bovinos (Barakat et al., 2015).

Procaína. La procaína es un anestésico local que induce la hiperactivación en

espermatozoides de diferentes especies de mamíferos y posiblemente aumenta la permeabilidad

de la membrana plasmática. La procaína muestra mejores resultados en la inducción de la

capacitación y la hiperactivación en equinos (Ortgies et al., 2012).

En espermatozoides equinos, la adición de procaína induce la hiperactivación pero no está

asociado en la fosforilación de proteínas en residuos tirosina o la inducción de la reacción

acrosomal (Ortgies et al., 2012).

El efecto de la procaína sobre la motilidad hiperactivada, puede depender de mecanismos que

incluyen la regulación de Ca2+ intracelular. En general, la presencia de procaína, resulta en una

reubicación de Ca2+ dentro de la membrana (Mújica et al., 1994).

Un estudio demostró que la procaína afecta positivamente la motilidad pero no induce la

hiperactivación en espermatozoides de rata (Lindemann, Goltz y Kanous, 1987).

 41

No obstante, los espermatozoides tratados con procaína mostraron motilidad hiperactivada

dependiente de glucosa en la especie porcina (Mújica et al., 1991).

Cafeína. La cafeína es un alcaloide del grupo de las xantinas, inhibe a la enzima

fosfodiesterasa permitiendo la acumulación de nucleótidos cíclicos, especialmente del AMPc

intracelular, provocando un aumento de la actividad flagelar (Garbers et al., 1971; Stefanovich,

1973). La cafeína induce la hiperactivación en casi el 100% de espermatozoides móviles, pero no

aumenta la fosforilación de las proteínas en residuos tirosina. Sin embargo, la incubación con

cafeína durante horas presenta una fosforilación de proteínas en residuos tirosina, pero la

hiperactivación se reduce significativamente (Contreras, 2009).

Las metilxantinas como la cafeína y la pentoxifilina, son ampliamente conocidas por su efecto

estimulatorio que producen un incremento en la motilidad y el vigor de espermatozoides frescos

(Garbers et al., 1971). Por esta razón son utilizados para tratamientos de oligozoospermia y

atenozoospermia en humanos (Aparicio et al., 1980). Sin embargo, aunque concentraciones de 6

mM de cafeína produce efectos positivos en cuanto a la motilidad de espermatozoides de semen

bovino fresco, esta concentración resultó ser ineficiente para semen congelado de la misma

especie (De la vega, Wilde y Cruz, 1997). Por otro lado, se ha informado que la adición de la

cafeína incrementa el calcio intracelular y la hiperactivación inmediata en carnero (Colás,

Cebrián-Pérez y Muiño-Blanco, 2010) y tiene efectos estimulantes que aumentan la motilidad

espermática e inducen reacción acrosomal acrecentando así la velocidad de penetración del

oocito en jabalí (Špaleková et al., 2011). En otro estudio sobre humanos, una mayor

concentración de cafeína (> 2,5 mM) tuvo efectos adversos sobre la fecundación de los

espermatozoides (Imoedemhe et al., 1992), estos mismos resultados también fueron reportados
 42

en bovinos (Bird, Carey y Houghton, 1989). Por ende, se deduce que el efecto de la cafeína puede

ser específico de la especie (Barakat et al., 2015).

ATP. La Adenosina Trifosfato es una molécula compleja que contiene el nucleósido adenina

y una cola que consta de tres fosfatos (Bergman, 1999). La disponibilidad de ATP juega un rol

fundamental en la capacidad que tiene el Ca2+ de inducir la hiperactivación (Ho, Granish y

Suarez, 2002). La conversión del ATP en ADP + P proporciona la energía necesaria para

impulsar al espermatozoide, por ello se ha determinado que este nucleótido está vinculado con la

capacidad fecundante del mismo (Munuce, 2008). La mayoría del ATP producido por los

espermatozoides se utiliza para fomentar la motilidad (Kamp, Büsselmann y Lauterwein, 1996),

Bohnensack y Halangk (1986) determinaron que el 75% del ATP producido por los

espermatozoides bovinos es utilizado de esta manera (Bohnensack y Halangk, 1986). El ATP

puede ser formado por 2 procesos: respiración oxidativa y glicólisis, ambos de los cuales ocurren

en espermatozoides bovinos (Krzyzosiak, Molan y Vishwanath, 1999). Además, se realizaron

algunos estudios bioquímicos para demostrar por primera vez evidencia directa de la presencia de

la actividad de captación de calcio dependiente de ATP en la membrana plasmática aislada de la

cabeza de espermatozoides de toro, estos resultados, sugieren la participación del ATP en la

regulación del calcio intracelular en el proceso de capacitación y la reacción acrosomal

(Breitbart, Darshan y Rubinstein, 1984).

2.2.6 Producción in vitro de embriones. La biotecnología reproductiva

comprende un conjunto de técnicas, desde la inseminación artificial hasta la clonación, que

permiten aumentar la eficiencia reproductiva de los animales (Palma, 2008). Dichas técnicas

surgieron con el objetivo de acelerar el mejoramiento genético de los hatos al aumentar la

descendencia de machos y hembras de buena genética y reducir los intervalos generacionales.

 43

Emergieron desde el siglo XX, se hicieron indispensables para la producción de embriones in

vitro y clonación animal (Mutto, 2014). La producción in vitro de embriones bovinos (PIV) tiene

aplicaciones interesantes lo cual argumenta su extensión de la investigación en esta área, además

es una técnica ampliamente utilizada en bovinos, que permite producir embriones de forma

masiva. Se establecieron cinco generaciones biotecnológicas en la reproducción animal: núcleos

pluripotentes (1908), transferencia de embriones y control hormonal del celo (1970), producción

in vitro de embriones (PIV) y sexado del semen (1980), clonación de células somáticas (1990) y

transgénesis (2000) (Thibier, 2001).

Los pasos fundamentales para llevar a cabo este proceso de producción in vitro son tres:

Maduración in vitro de los oocitos obtenidos de ovarios por medio de punción folicular, la

fecundación in vitro de los oocitos maduros y el cultivo in vitro de los embriones (Figura 5)

(Berg y Reichenbach, 1988). En cuanto a la eficiencia, la producción de embriones realizada in

vitro es menor en comparación al proceso in vivo, aproximadamente el 90 % de oocitos

inmaduros reanudan la meiosis I y extruyen el primer cuerpo polar in vitro, lo que se conoce

como maduración del núcleo oocitario; cerca del 80 % es fecundado y experimenta por lo menos

un clivaje. Sin embargo, la mayor pérdida (60-70 %) ocurre en la última parte del proceso, en el

cultivo in vitro entre los estadios de cigoto y blastocisto (Lonergan et al., 2003). Una posible

causa de las tasas de pérdida podría estar relacionada con la capacitación espermática al ser

ineficiente los tratamientos sobre los espermatozoides. El número de espermatozoides que se

emplea en la fecundación in vitro es aquel que produce la máxima tasa de fecundación con el

mínimo de poliespermia (Salgado, Rugeles y Alvarez, 2005), por cada oocito se requiere de 5000

espermatozoides en una fecundación in vitro (Lu, Cran y Seidel, 1999).

 44

Es conveniente evaluar la calidad embrionaria, para esto existe una variedad de parámetros

que se deben analizar para conocer la viabilidad del proceso de producción in vitro de embriones

y así poder mejorar y poner a punto ciertas técnicas dentro de los pasos que conlleva la PIV, los

parámetros para evaluar calidad embrionaria son: determinación del porcentaje embrionario,

niveles de eclosión y cuantificación del número de células por embrión.

Figura 5. Esquema de producción y desarrollo de embriones bovinos. (1): Maduración ovocitaria, (2):
tratamiento de los espermatozoides, (3) fecundación in vitro, (4) cultivo de embriones hasta el estadio de
blastocisto.

Una de las técnicas para evaluar el éxito de la fecundación in vitro es analizar la presencia de

dos pronúcleos (Figura 6). Durante años las características estructurales asociadas con la

formación y desarrollo de los pronúcleos en condiciones in vivo han sido tratadas en una serie de

especies de animales de granja, porcinos: (Szollosi y Hunter, 1973; Laurincik, Hyttel y Kopecny,

1995), bovinos: (Crozet, 1984; Hyttel, Xu y Greve, 1988; Laurincík et al., 1998), cabras: (Crozet,

Théron y Chemineau, 1987) y ovejas: (Crozet, 1988). Estas investigaciones han demostrado que

ciertos eventos surgen en la formación de los pronúcleos e interactúan dinámicamente a través

del primer ciclo celular embrionario.

 45

Figura 6. Oocito fecundado (cigoto). Se muestran dos pronúcleos (PN) junto con la cola del
espermatozoide penetrante (ST). Adaptado de (Marquez and Suarez, 2004).

En el cigoto bovino, se encuentran al menos dos tipos distintos de entidades: cuerpos

precursores de nucléolos (NPBs) y racimos de gránulos similares a la cromatina (Laurincík et al.,

1998). Se estima que los sitios de procedencia de la formación de los nucléolos son los NPB, este

proceso ocurre durante el cuarto ciclo celular en el embrión bovino (King et al., 1988; Kopecny

et al., 1989). Por otro lado se sabe que existe una tasa limitada de transcripción en los pronúcleos

bovinos y que el ARN ribosómico (ARNr) aparentemente no está sintetizado.

En bovinos, se puede observar los pronúcleos entre las 19-20 horas post-fecundación in vitro,

se les clasifica normalmente como penetrados cuando en el citoplasma del cigoto se observan los

dos pronúcleos (Figura 6), uno masculino y otro femenino (Contreras et al., 2010).

Desde el punto de vista económico, producir embriones de forma in vitro a gran escala es un

procedimiento costoso, debido a que se requiere de un laboratorio equipado con los materiales y

reactivos necesarios para cada etapa del proceso y de personal altamente calificado. Sin
 46

embargo, estos aspectos se ven compensados por la posibilidad de producir embriones

masivamente en un corto lapso de tiempo (Mucci, 2006).

Actualmente existe una gran ineficiencia en la capacitación in vitro de los espermatozoides

durante el desarrollo de una fecundación in vitro, puesto que son requeridos al menos 5000

espermatozoides por oocito en esta metodología (Yang, Jiang y Foote, 1993), mientras que, in

vivo, el número de espermatozoides que llegan al lugar donde ocurre la fecundación, es

significativamente menor. Por todo esto, el proceso de fecundación in vitro demanda la necesidad

de seguir estudiando la capacitación espermática a nivel molecular, es decir, la comprensión de

los diversos eventos de señalización que este proceso involucra con el fin de hacerla más

eficiente in vitro.

2.3 Marco conceptual

Espermatogénesis. Es el proceso de formación de las células sexuales masculinas.

Proceso mediante el cual se desarrollan los gametos masculinos y se lleva a cabo en los tubos

seminíferos bajo influencias hormonales (Zamora Matlalcuatzi, 2013), donde se da origen a

células llamadas espermatogonias.

Espermatozoide. Es una célula haploide altamente diferenciada que constituye el gameto

masculino. Su función principal es fecundar el ovocito aportando la información genética

complementaria para la formación del cigoto (Osycka Salut, 2010).

Plasma seminal. Es una mezcla compleja de secreciones de testículos, epidídimo y

glándula accesoria, no sólo sirve como portador de espermatozoides en el tracto genital femenino

sino también como un agente de señalización y como soporte nutricional de los espermatozoides

(Bergeron et al., 2016).

Capacitación espermática. La capacitación espermática es un proceso en el cual los

 47

espermatozoides de los mamíferos sufren cambios a nivel estructural y bioquímico adquiriendo la

habilidad para fecundar el oocito. Algunos de estos cambios implican un aumento en la

permeabilidad de la membrana, en los niveles de Ca2+ y fosforilación de las proteínas en residuos

tirosina (Rodríguez Almeida et al., 2008).

Capacidad fecundante. Yanagimachi, (1994) definió la capacidad fecundante de los

espermatozoides como la habilidad que tienen estas células para fecundar un oocito

fisiológicamente normal y estructuralmente intacto, consta de un complejo proceso que incluye

una serie de fases como el desencadenamiento de la reacción acrosomal y la penetración de la

zona pelúcida que le aportan al espermatozoide las cualidades adecuadas para fecundar (Gadea,

2001).

Cigoto. El cigoto es una estructura resultado de la unión entre la gameta masculina y la

gameta femenina, es decir, el espermatozoide y el oocito respectivamente; donde se lleva a cabo

la fusión de los pronúcleos en un proceso llamado singamia (Sluder, 2016).

Blastocisto bovino. Un blastocisto es la primera diferenciación de dos tipos celulares, el

macizo celular interno y el trofoblasto. También se define como un embrión de 6 a 7 días de

desarrollo que presenta una estructura celular compleja formada por aproximadamente 200

células. Según Kubisch et al., (2001) la tasa alcanzada de blastocistos es el parámetro más usado

para medir la eficacia de la producción in vitro de embriones (Ahuja Aguirre et al., 2009).

Criopreservación. La criopreservación es un proceso que tiene como objetivo principal el

mantenimiento de la viabilidad y funcionalidad celular a muy bajas temperaturas. Sin embargo,

puede presentar problemas como variaciones en las propiedades químicas que podrían alterar las

membranas celulares y las organelas (Ávila Portillo et al., 2006).

 48

2.4 Marco legal

Ley 89 de 1993. Por la cual se establece la Cuota de Fomento Ganadero y Lechero y se crea el

Fondo Nacional del Ganado, para el manejo de los recursos provenientes del recaudo de la Cuota

de Fomento Ganadero y Lechero, el cual se ceñirá a los lineamientos de políticas del Ministerio

de Agricultura para el desarrollo del sector pecuario.

Ley 395 de 1997. Por la cual se declara de interés social nacional y como prioridad sanitaria la

erradicación de la fiebre aftosa en todo el territorio colombiano y se dictan otras medidas

encaminadas a este fin. Para cumplir con este objetivo, el Gobierno nacional a través del

Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, particularmente el Instituto Colombiano

Agropecuario, adoptará las medidas sanitarias que estime pertinentes.

Ley 427 de 1998. Por la cual se reglamentan los títulos genealógicos, las exhibiciones, los

espectáculos para los semovientes de razas puras del sector equino y bovino y se crean

mecanismos para su protección y propagación.

Ley 914 de 2004. Por la cual se crea el Sistema Nacional de Identificación e Información de

Ganado Bovino Sinigán, a través del cual se dispondrá de la información de la especie bovino y

sus productos, desde el nacimiento de este, como inicio de la cadena alimenticia, hasta llegar al

consumidor final. También El Sistema Nacional de Identificación e Información de Ganado

Bovino estará fundamentado en la universalidad, obligatoriedad, gradualidad y trazabilidad.

Ley 916 de 2004. Por la cual se establece el Reglamento Nacional Taurino. El presente

reglamento tiene por objeto la regulación de la preparación, organización y desarrollo de los

espectáculos taurinos y de las actividades relacionadas con los mismos, en garantía de los
 49

derechos e intereses del público y de cuantos intervienen en aquellos. Los espectáculos taurinos

son considerados como una expresión artística del ser humano.

Ley 1375 de 2010. Por la cual se establece las tasas por la prestación de servicios a través del

Sistema Nacional de Identificación y de Información del Ganado Bovino. Créase a favor de la

Nación Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, quien obrará como sujeto activo, una tasa

generada por los servicios de registro e información del ganado prestado a través del Sistema

Nacional de Identificación y de Información del ganado bovino, Sinigán, creado por la Ley 914

de 2004.

Resolución 00072 de 2007. Por la cual se adopta el Manual de Buenas Prácticas de Manejo

para la producción y obtención de la piel de ganado bovino y bufalino.

Decreto 1500 de 2007. Por el cual se establece el reglamento técnica a través del cual se crea

el Sistema Oficial de Inspección, Vigilancia y Control de la carne, Productos cárnicos

comestibles y derivados cárnicos destinados para el consumo humano y los requisitos sanitarios y

de inocuidad que se deben cumplir en su producción primaria, beneficio, desposte, desprese,

procesamiento, almacenamiento, transporte, comercialización, expendio, importación o

exportación.

Resolución 005131 de 2007. Por la cual se establecen las condiciones para el registro de los

transportadores de ganado bovino y bufalino y la guía de transporte ganadero.

 50

2.5 Marco contextual

El presente proyecto se llevó a cabo en el Instituto de Investigaciones Biotecnológicas (IIB) en

la ciudad de Buenos aires, en el laboratorio de Biotecnologías aplicadas a la reproducción y

mejoramiento genético animal bajo la dirección del Doctor Adrián Ángel Mutto. Se utilizó semen

bovino criopreservado, seguidamente se realizó la capacitación espermática utilizando agentes

inductores como la heparina, cafeína, pentoxifilina, procaína y ATP y se evaluó su capacidad

fecundante mediante ensayos de FIV.

Figura 7. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas (IIB), Universidad Nacional de San Martin,

Buenos Aires, Argentina.
 51

3. Metodología

3.1 Tipo de investigación

Descriptivo experimental, desarrollo del evento de la capacitación espermática mediante la

utilización de distintos agentes inductores en espermatozoides bovinos y evaluación de su

capacidad fecundante.

3.2 Población y muestra

3.2.1 Población. Semen y ovarios de la especie bovina

3.2.2 Muestra. Espermatozoides, oocitos, cigotos y embriones de 2 a 8 células.

3.3 Hipótesis

La cafeína, pentoxifilina, procaína y el ATP inducirían la capacitación espermática y

mejorarían la capacidad fecundante de los espermatozoides bovinos criopreservados.

3.4 Variables

3.4.1 Dependientes. Motilidad, tasas de capacitación, fusión de los pronúcleos y

tasas de clivaje.

3.4.2 Independientes. Semen criopreservado de toro paisano raza Aberdeen

Angus, agentes inductores de la capacitación espermática, ovarios provenientes de faena,

condiciones de cultivo.

3.4.3 Intervinientes. Aspecto morfológico de los espermatozoides y calidad de

los ovarios.

3.5 Fases de la investigación

3.5.1 Reactivos. Los reactivos utilizados fueron adquiridos de Sigma Chemical

Company, de lo contrario se especifica su origen. La composición de los diferentes medios

utilizados se encuentra detallada en el Anexo. En todos los casos se ha controlado el pH= 7,4 y la
 52

Osmolaridad entre 275 y 300.

3.5.2 Procesamiento del semen. Se trabajó con espermatozoides de semen

bovino criopreservado correspondiente al toro Paisano: Aberdeen Angus, 09/06/2008, CIALE

S.A.

Las dosis de semen se descongelaron en baño térmico a 38°C por 30 segundos, el semen fue

descargado en medio H-TALP (ver anexo – tabla 1) y posteriormente se pasó por una columna

de lana de vidrio y se centrifugó A 800 g durante 10 minutos. El sobrenadante se descartó y se

resuspendió el pellet.

La concentración espermática obtenida se determinó utilizando una cámara de Neubauer.

3.5.3 Tratamiento con las distintas drogas. Se prepararon soluciones stock de

10 mM de pentoxifilina, 10 mM de cafeína, 5 mM de procaína, 9 mM de ATP diluidas en medio

H-TALP. Dichas soluciones se guardaron alicuotadas a -20°C.

Tabla 1.
Concentración final utilizada por cada tratamiento para la capacitación in vitro de los
espermatozoides bovinos criopreservados.

Tratamientos Concentraciones

Procaína 5 mM

Cafeína 10 mM

Pentoxifilina 10 mM

ATP 0.25 mM
 53

Los tratamientos con cada droga, esquematizado en la Figura 8 se realizaron de la siguiente

manera: para inducir la capacitación espermática los espermatozoides fueron incubados con 10

mM de pentoxilina, 10 mM de cafeína, 5 Mm de Procaína y 0.25 mM de ATP respectivamente

en medio IVF-SOF para ensayos posteriores de fecundación in vitro y en medio H-TALP

suplementado con BSA (6mg/ml) (ver anexo – tabla1) para las demás técnicas de evaluación del

estado de capacitación espermática. Se utilizó una concentración de 1.5x106 espermatozoides/100

µl, durante 15 minutos. Como control positivo se utilizó heparina (50 μg/ml), y como control

negativo se incubó el mismo número de espermatozoides en medio de capacitación H-TALP o

IVF-SOF sin drogas.

Figura 8. Esquematización del tratamiento con las distintas drogas.

3.5.4 Determinación del estado de capacitación espermática por la técnica

de clortetraciclina (CTC). La clortetraciclina es un quelante fluorescente de cationes divalentes

que se une a las proteínas de la membrana, y en presencia de Ca2+, emite una fluorescencia de
 54

intensidad variable (Storey et al., 1984), este marcado fluorescente permite analizar las

alteraciones del estado de la membrana plasmática asociado al intercambio de Ca2+, que es uno

de los eventos característicos del proceso de capacitación espermática. La técnica de CTC

permite identificar tres patrones distintos en relación al estado capacitado/no capacitado del

espermatozoide (Fraser, Abeydeera y Niwa, 1995) como se esquematiza en la Figura 9.

 Patrón F: fluorescencia en toda la cabeza refiere a un espermatozoide intacto no

capacitado (Imagen a).

 Patrón B: presenta fluorescencia sólo en la región post-acrosomal cuando el

espermatozoide está intacto y capacitado (Imagen b).

 Patrón AR: se observa fluorescencia en la zona ecuatorial o simplemente carece de

fluorescencia cuando se encuentra reaccionado (Imagen c).

Figura 9. Patrones de la técnica de CTC. (a): Patrón F: espermatozoide intacto no capacitado, (b): Patrón
B: espermatozoide intacto capacitado, (c): Patrón AR: espermatozoide reaccionado, banda de fluorescencia
en el segmento ecuatorial (flecha). Adaptado de (Fraser et al, 1995).

Con el objetivo de determinar el estado de capacitación espermática, se analizaron mediante la

técnica de CTC espermatozoides bajo las diferentes condiciones mencionadas previamente.

Para el análisis mediante la técnica de CTC, se tomaron 30 μl de diluyente CTC y se agregó el

mismo volumen de muestra de los distintos tratamientos, posteriormente, las células fueron
 55

fijadas en suspensión con glutaraldehído 0,2 % y guardadas a 4 ºC hasta el momento de su

evaluación.

Se observaron 200 espermatozoides por muestra, Para el análisis se utilizó un microscopio de

fluorescencia Nikon Eclipse 80i, a una magnitud de 400X, con un filtro de excitación a 365 nm y

uno de emisión entre 430-650 nm.

3.5.5 Análisis de la viabilidad espermática. Luego de las capacitaciones

espermáticas in vitro con los diferentes tratamientos, los espermatozoides fueron incubados en

estufa a 38,5 ºC, 5% CO2 y se le agregó 2 μg/ml del colorante Hoechst 33258 (H258) por 5

minutos para analizar la viabilidad. La suspensión fue fijada con paraformaldehído 0,2% durante

30 minutos a temperatura ambiente. Finalizada la fijación, las muestras fueron lavadas por

centrifugación con PBS durante 10 minutos a 800g. Por último, las células fueron montadas en

portaobjetos con Glicerol:PBS (7:3 v/v).

Las células con ausencia de coloración fueron clasificadas en viables, y en no viables cuando

presentaron marca en la cabeza. Se contaron 200 células por tratamiento y se calculó el

porcentaje de población viable para cada caso. Para el análisis se utilizó un microscopio de

fluorescencia Nikon Eclipse 80i, a una magnitud de 600X, con un filtro de excitación a 365 nm y

uno de emisión entre 430-650 nm.

3.5.6 Inducción de la reacción acrosomal por lisofosfatidilcolina (LPC). La

técnica fue realizada según la descripta por Galantino-Homer (1997) la cual se esquematiza en la

Figura 10. Después de los tratamientos, la suspensión de espermatozoides fue dividida en dos

alícuotas: una de ellas fue incubada con 5 μM de LPC (inductor de la reacción acrosomal) y la

otra sin LPC (control de la reacción acrosomal espontánea). Luego de 10 minutos de incubación
 56

en estufa a 38,5ºC, 5% CO2, se agregó 2 μg/ml del colorante vital Hoechst 33258 (H258) por 5

minutos para analizar la viabilidad. La suspensión fue fijada con paraformaldehído 0,2% durante

30 minutos a temperatura ambiente. Al finalizar la fijación, las muestras fueron lavadas por

centrifugación con PBS durante 10 minutos a 800g. Seguidamente, los espermatozoides fueron

montados en portaobjetos. Los patrones de fluorescencia se analizaron utilizando la técnica de

PSA-FITC (la Pisum sativum aglutinina (PSA)), una lectina que se une a glicoproteínas del

acrosoma y permite analizar el estado del mismo. Para esto, las muestras fueron permeabilizadas

con metanol a 4ºC durante 10 minutos. Se lavaron con PBS y luego se incubaron durante 1 hora

con 10 μg/ml de PSA-FITC a temperatura ambiente y en ausencia de luz. Al finalizar la

incubación, las células fueron lavadas con PBS y montadas con Glicerol:PBS (7:3 v/v).

Figura 10. Determinación de la capacitación espermática mediante la inducción de la reacción acrosomal

por LPC, evaluada con PSA-FITC.

Los patrones fueron clasificados en: intactos si los espermatozoides presentaban el acrosoma

entero o reaccionados si los espermatozoides poseían el acrosoma alterado o ausente (Figura 11).

A su vez, los mismos espermatozoides fueron clasificados según la viabilidad en: viables si no

revelaban fluorescencia, o no viables si los espermatozoides manifestaban fluorescencia en su

cabeza.
 57

Los resultados se reportaron como el porcentaje de espermatozoides reaccionados vivos

inducidos por LPC, menos el porcentaje de espermatozoides vivos que han sufrido reacción

acrosomal espontánea (sin LPC), evaluados por PSA-FITC.

Figura 11. Patrones de la técnica de inducción de la reacción acrosomal por LPC. A: Espermatozoide
intacto; B: Espermatozoide reaccionado. Imagen tomada con microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse
80i, a una magnitud de 600X. Adaptado de (Waremkraut, 2017).

Se observaron 200 espermatozoides por muestra, en un microscopio de fluorescencia Nikon

Eclipse 80i, a una magnitud de 600X. Para análisis de viabilidad se utilizó un filtro de excitación

a 365 nm y uno de emisión entre 430-650 nm., mientras que para el análisis del estado del

acrosoma se hizo uso un filtro de excitación a 365 nm y uno de emisión entre 430-650 nm.

3.5.7 Producción in vitro de embriones bovinos. La PIV de embriones es una

técnica compleja que se extiende por 10 días en bovinos. En la Figura 12 se esquematiza el proceso

de producción de embriones, explicado en detalle en las siguientes secciones.

 58

Figura 12. Esquema de la producción in vitro de embriones. (MIV) maduración in vitro, (FIV)
fecundación in vitro, (CIV) cultivo in vitro (Waremkraut, 2017).

Obtención y acondicionamiento de los ovarios

Los ovarios fueron obtenidos a partir de vacas faenadas, proporcionados por el frigorífico

Cocarsa SA, ubicado en la localidad de San Fernando, provincia de Buenos Aires. Estos fueron

transportados en un termo con solución fisiológica suplementada con 100 μg/mL de

estreptomicina a temperatura ambiente, una vez en el laboratorio los ovarios fueron lavados con

agua tibia y se colocaron en baño térmico a 35°C con solución fisiológica para su posterior

procesamiento.
 59

Figura 13. Acondicionamiento de los ovarios. (A): ovarios acondicionados en solución fisiológica (B):
lavado de los ovarios provistos por el matadero.

Recolección y selección de los complejos oocitos células del cumulus

Los complejos oocitos células del cumulus (COCs) fueron recolectados por punción de los

folículos de 2–7 mm de diámetro utilizando jeringas con agujas de 21g (Figura 14A) el líquido

folicular extraído fue depositado en tubos Falcon de 50 ml que contenía 1 mg de heparina, la cual

previene que los COCs se aglutinen, se dejó reposar durante un tiempo de 10-15 minutos en la

incubadora hasta visualizar la formación de un pellet formado por los COCs que decantaron

(Figura14B). Se tomó el pellet con una pipeta Pasteur y se vació el contenido en una placa de

Petri de búsqueda. Se seleccionaron los COCs de grado 1 y 2 (según el manual de la International

Embryo Transfer Society, IETS por su nombre en inglés) es decir, aquellos que presentaban 3 o

más capas de células del cumulus, citoplasma homogéneo y sin presencia de granulaciones

citoplasmáticas (Figura 14C).

 60

Figura 14. Procesamiento de recolección y selección de los oocitos para llevar a cabo el proceso de
maduración in vitro. (A): Punción folicular. (B): Pellet que formaron los COCs decantados. (C): Selección
de los COCs de grado 1 y 2.

Los COCs fueron lavados en medio TCM-199- Hank´s WM atemperado a 38.5 °C (ver anexo

– tabla 1) y luego en medio de maduración in vitro MIV (ver anexo – tabla 1) equilibrado a 38,5

°C con una atmósfera de 5 % de CO2 y 99 % de humedad para realizar la maduración de los

mismos en placas de cuatro pocillos (Nunc, USA).

a) Maduración in vitro de oocitos

Los COCs seleccionados y lavados fueron cultivados en 500 μl de medio de maduración TCM

199 (Tissue Culture Medium-199-Earl´s) suplementado con 10% de Suero Fetal Bovino (SFB) y

rhFSH (Puregón, Organon, Ca, USA) (ver anexo – tabla 1) en placas de 4 pocillos (Nunc, USA),

previamente equilibrado en estufa a 38,5 °C con una atmósfera de 5 % de CO2 y 99 % de

humedad. Se dispusieron en grupos de 30 COCs por pocillo. Se incubaron en dichas condiciones

por un lapso de 20-24 horas. Pasado este tiempo, se determinó el porcentaje de maduración in
 61

vitro de modo directo observando la extrusión del primer cuerpo polar y de modo indirecto

observando la expansión de las células del cumulus con una lupa estereoscópica (30x).

b) Fecundación in vitro

Acondicionamiento de los oocitos maduros

Pasadas las 24 h de la maduración, los COCs fueron lavados en gotas de medio de

fecundación in vitro IVF–SOF (ver anexo – tabla 1) equilibrado a 38.5 °C con una atmósfera de 5

% de CO2 y 99 % de humedad y luego fueron pasados a la placa de cuatro pocillos (Nunc, USA)

conteniendo 400 µl de medio de fecundación IVF-SOF suplementado con heparina (50 μg/ml) a

los pocillos correspondientes al control positivo de la FIV y 350 µl de medio IVF-SOF en los

demás pocillos (tratamientos). Las placas se incubaron a 38,5°C por 19 h, en una atmósfera de

5% CO2 y 99% de humedad.

Procesamiento del semen para la fecundación.

El procesamiento del semen se realizó como se describió anteriormente en la sección 1, a

continuación, una vez determinada la concentración espermática para cada tratamiento y pasados

los 15 minutos de incubación se tomó una alícuota de cada tratamiento y se co-cultivaron los

COCs con una dosis inseminante de aproximadamente 800.000 espermatozoides.

3.5.8 Tinción de pronúcleos para evaluar el porcentaje de fecundación.

Pasadas las 19 horas de la fecundación se tomó un pool de presuntos cigotos y fueron denudados

y lavados en DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco, USA) luego, se fijaron en una

solución de paraformaldehído al 4% durante 30 min. Transcurrido este tiempo los presuntos

cigotos fueron teñidos en solución de colorante Hoechst 33342 (Bis-Binzimida; 5 μg/ml) durante

20 min. Posteriormente fueron colocados en gotas de 100 μl y visualizados mediante un

 62

microscopio invertido de fluorescencia Nikon Eclipse 80i. Las imágenes fueron tomadas a una

magnitud de 600X.

c) Cultivo in vitro de embriones

Transcurridas las 18-19 h de la fecundación, los presuntos cigotos fueron denudados por

acción mecánica utilizando una pipeta de 200µl. se tomaron los presuntos cigotos libres de

células del cumulus y se lavaron en gotas de medio TCM-199- Hank´s WM atemperado a 38.5

°C y por último se los lavó en gotas de medio de cultivo comercial BO-IVC de IVF

BIOSCIENCE previamente equilibrado en estufa gaseada con 5 % CO2 y 99 % de humedad.

Cada pocillo contenía 500μL de medio BO-IVC con 400μl de aceite mineral, a 38.5 °C, 5 %

CO2, 5 % O2, 90 % N2.

El clivaje se realizó a las 24 h de cultivo embrionario, visualizando a través del estereoscopio

la presencia de embriones de dos o más células (Figura 15) se retiraron los oocitos muertos y los

no fecundados, dejando aquellos que se encontraban clivados y se determinó el porcentaje de

fecundación (Nº células clivadas/Nº células no clivadas).

Figura 15. Cultivo in vitro de embriones bovinos. (A): Embrión bovino de dos células. (B): Embrión
bovino de cuatro células. (C): Blastocistos bovinos.
 63

3.5.9 Análisis estadístico. Los resultados obtenidos se analizaron con el

Software Estadístico GraphPad PRISM®. Versión 5.0. En todos los casos, los datos se

expresaron como los valores medios. Los tratamientos de los distintos experimentos fueron

sometidos a una prueba de análisis de la varianza (ANOVA) de un factor. Cuando esta prueba

resultó significativa (p<0,05) se realizaron contrastes a posteriori aplicando los test de Tukey.
 64

4. Resultados

4.1 Evaluación del efecto de la procaína, pentoxifilina, cafeína y ATP sobre la motilidad

espermática

La motilidad espermática se evaluó de forma subjetiva, mediante la observación de una

muestra de semen de cada tratamiento con un microscopio de contraste de fases sobre una platina

de 37°C, la motilidad se valoró de acuerdo a su capacidad de movimiento de la siguiente manera:

(-) Inmótiles.

(+-) motilidad acelerada, sin progresión.

(+) Progresión lenta

(++) Motilidad progresiva continua y moderada velocidad.

(+++) Motilidad progresiva, rápida.

(++++) Motilidad progresiva muy rápida, células difíciles de seguir visualmente.

Tabla 2.
Evaluación subjetiva de la motilidad espermática.

Tratamiento 0 min 10 min 15 min 30 min 45 min

Heparina (control) + + ++ +++ +++

BSA + + ++ +++ +++

Procaína 5 mM + +- ++++ +++ ++

Pentoxifilina 10 mM + ++ +++ +++ ++

Cafeína 10 mM + ++ +++ +++ ++

ATP 0.25 mM + ++ +++ ++ +

 65

Dada la elevada concentración espermática, se observaron movimientos en forma de remolino

y zigzag, la mayoría de estos movimientos se visualizaron a los 15 y 30 minutos de incubación

con procaína, pentoxifilina, cafeína y ATP donde se registró el mayor índice de población con

motilidad rápida progresiva. Sin embargo, después de 45 minutos de incubación se percibió que

en todos los tratamientos los espermatozoides perdían motilidad, excepto aquellos tratados con

heparina. Si bien, a los 15 minutos de incubación los espermatozoides adquirieron una motilidad

rápida y además progresiva, es importante mencionar que aquellos espermatozoides tratados con

5mM de procaína presentaron una motilidad progresiva más rápida que la de las demás drogas.

4.2 Estudio del efecto de los distintos tratamientos en la inducción de la capacitación

espermática

El estudio de la capacitación espermática presenta la dificultad de no evidenciar cambios

morfológicos visibles para su estudio. Dentro de las técnicas más utilizadas para determinar la

capacitación de los espermatozoides bovinos se encuentran la técnica de CTC (la cual permite

identificar patrones debido al movimiento del calcio asociado a la membrana plasmática) y la

técnica de la inducción de la reacción acrosomal en respuesta a LPC, la cual es analizada con la

lectina Pissum sativum aglutinina (PSA) unida a FITC, esta se basa en que únicamente un

espermatozoide capacitado iniciará frente a un inductor el proceso de reacción acrosomal.

4.2.1 Evaluación de la capacitación espermática. Se llevaron a cabo estudios

de capacitación in vitro utilizando la técnica de CTC en presencia de las distintas drogas. Se

utilizó heparina, conocido agente capacitante de espermatozoides bovinos, como control positivo

de la capacitación espermática.
 66

El control positivo heparina (Figura 16), se evaluó a los 45 minutos, ya que los resultados de

CTC expresaban índices más altos de capacitación en dicho tiempo como se muestra en la Figura

17, en comparación con los demás tiempos evaluados.

% Espermatozoides Patrón B de CTC 80

*

60
(Capacitados)

40

20

0
SA

a
rin
B

a
ep
H

Figura 16. Determinación de la capacitación espermática inducida por heparina. Las barras indican el
porcentaje de espermatozoides intactos capacitados (patrón B) evaluados por la técnica de CTC. Las
muestras fueron incubadas durante 45 min con medio H-TALP con BSA (6mg/ml) y heparina (50 μg/ml).
El gráfico muestra el promedio para cada tratamiento ± el error estándar. “Paired t test" (* = p<0.05) n=4.

La heparina presentó diferencias significativas frente al control, Estos resultados apoyan, junto

con numerosos trabajos, la teoría de que la heparina es un buen inductor de la capacitación en

espermatozoides bovinos in vitro (Parrish, Susko-Parrish y First, 1989; Miller, Winer y Ax, 1990;

Galantino Homer, Visconti y Kopf, 1997; Alwan y Saleem, 2013). A continuación se presentan

los resultados obtenidos por CTC luego del tratamiento con heparina a distintos tiempos.
 67

% Espermatozoides Patrón B de CTC

% Espermatozoides Patrón B de CTC

80 80 *

60 60
(Capacitados)

(Capacitados)
40 40

20 20

0 0
' ' ' '
15 15 30 30
a a
SA rin SA rin
B a B a
ep ep
H H
% Espermatozoides Patrón B de CTC

% Espermatozoides Patrón B de CTC

80
* 80

60 60
(Capacitados)

(Capacitados)

40 40

20 20

0 0
' ' ' '
45 45 60 60
a a
SA rin SA rin
B a B a
ep ep
H H

Figura 17. Determinación de la capacitación espermática inducida por heparina en distintos tiempos vs
BSA por CTC. Las barras indican el porcentaje de espermatozoides intactos capacitados (patrón B) evaluados
por la técnica de CTC. Las muestras fueron incubadas durante tiempos de 15, 30, 45 y 60 min con medio H-
TALP suplementado con BSA (6mg/ml) y heparina (50μg/ml). El gráfico muestra el promedio para cada
tratamiento ± el error estándar. Test Repeated Measures ANOVA “Tukey's Multiple Comparison Test”
(*=p<0.05) n=4.
 68

Los datos arrojados por el CTC indicaron diferencias estadísticamente significativas entre los

tiempos de 30 y 45 minutos de incubación, siendo este último el tiempo donde se observó mayor

índice de espermatozoides capacitados (Figura 17).

Para inducir la capacitación y evaluar la acción de cada una de las drogas, los espermatozoides

bovinos fueron incubados con los distintos tratamientos durante 15 minutos y se realizó el control

correspondiente con BSA (Figura 18).

*
*
**
% Espermatozoides Patrón B de CTC

80

60
(Capacitados)

40

20

0
a a a
SA ín in ín TP
B a fil af
e A
oc xi
Pr n to C
Pe

Figura 18. Determinación de la capacitación espermática inducida por la procaína, pentoxifilina,

cafeína, ATP vs BSA por CTC. Las barras indican el porcentaje de espermatozoides intactos capacitados
(patrón B) evaluados por la técnica de CTC. Las muestras fueron incubadas durante 15 min con medio H-
TALP con BSA (6mg/ml), procaína (5 mM), pentoxifilina (10 mM), cafeína (10 mM) o ATP (0.25 mM).
El gráfico muestra el promedio para cada tratamiento ± el error estándar. Test Oneway ANOVA "Tukey's
Multiple Comparison Test" (* = p<0.05; ** = p<0.01) n=4.
 69

De acuerdo a los datos obtenidos, el ATP presentó diferencias significativas frente al control,

indicando ser el tratamiento con mayor efecto positivo sobre la inducción de la capacitación

espermática. Por otro lado, se observó una cierta tendencia al utilizar la cafeína lo que conllevó a

seguir estudiando el efecto inductor de estos dos tratamientos.

En espermatozoides bovinos, la reacción acrosomal inducida por LPC es considerada como un

indicador final de la capacitación. Si bien hay una tendencia en los resultados obtenidos, el ATP

y la cafeína no mostraron diferencias estadísticamente significativas comparadas con el control

(Figura 19).

30
Reaccionados Vivos
% Espermatozoides

20

10

SA TP na
B A f eí
a
C

Figura 19. Determinación de la capacitación espermática inducida por ATP y la cafeína por inducción
de la reacción acrosomal con LPC. Las barras muestran el porcentaje de espermatozoides reaccionados
vivos inducidos por LPC, menos el porcentaje de espermatozoides vivos que han sufrido reacción acrosomal
espontánea (sin LPC), evaluados por PSA-FITC. Las muestras fueron incubadas durante 15 min con medio
H-TALP suplementado con BSA (6mg/ml), ATP (0.25 mM) o cafeína (10mM). El gráfico muestra el
promedio para cada tratamiento ± el error estándar. Test Oneway ANOVA "Tukey'sMultipleComparison
Test" n=4.
 70

4.2.2 Estudio del efecto del tratamiento con ATP y cafeína sobre la

viabilidad espermática. Se determinó la viabilidad de los espermatozoides incubados con ATP o

cafeína en las diferentes condiciones para estudiar el efecto de los tratamientos sobre este

parámetro. La viabilidad espermática no se vio afectada en ninguna de las condiciones, siendo los

porcentajes obtenidos cercanos al 100% en todos los casos (Figura 20).

150
% Viabilidad

100

50

SA TP na
B A f eí
a
C

Figura 20. Estudio de la viabilidad espermática. Las barras indican % de espermatozoides viables. Las
muestras fueron incubadas durante 15 min con medio H-TALP suplementado con BSA (6mg/ml), ATP
(0.25 mM) o cafeína (10 mM). Se muestra el promedio para cada tratamiento ± el error estándar. El gráfico
muestra el promedio para cada tratamiento ± el error estándar. Test Oneway ANOVA "Tukey's Multiple
Comparison Test" n=4.

4.3 Efecto de los tratamientos sobre la capacidad fecundante de los espermatozoides

bovinos criopreservados
 71

Con el objetivo de evaluar la capacidad fecundante de los espermatozoides tratados en las

distintas condiciones, se realizaron maniobras de fecundación in vitro y se analizó porcentaje

de fecundación mediante evaluación de pronúcleos y el clivaje embrionario.

4.3.1 Efecto de los tratamientos con ATP y cafeína sobre el porcentaje de

fecundación mediante la evaluación de pronúcleos. Con el fin de profundizar el estudio sobre

la capacidad fecundate de los espermatozoides tratados con ATP y cafeína, se evaluó la

penetración de los espermatozoides y la formación de pronúcleos a las 19 h post fecundación in

vitro. Para evaluar el estado de fecundación se tomó en cuenta los siguientes criterios: a).

Presencia de la cabeza del espermatozoide en el espacio perivitelino del oocito, b). Formación de

dos pronúcleos. En la Figura 21 se muestra el efecto de estos tratamientos sobre la capacidad

fecundante de los espermatozoides bovinos.

100 *
80 *
% Fecundación

60

40

20

0
TP
a

na
(-)

SA

rin

eí

A
SA

af
ep
B

C
H

Figura 21. Efecto de la cafeína y el ATP sobre el porcentaje de fecundación mediante la evaluación de
pronúcleos. Las barras indican el porcentaje de oocitos fecundados. La evaluación se realizó 19 h Post FIV.
Se muestra el promedio para cada tratamiento ± el error estándar. Test Oneway ANOVA "Tukey's Multiple
Comparison Test" (*= p<0.05) n=4.
 72

Además de la heparina, la cafeína mostró diferencias significativas frente al control con BSA.

Por otra parte, se observó que el ATP no difirió del control con BSA y además presentó índices

muy bajos de fecundación.

Figura 22. Oocitos bovinos fecundados. (A): la cabeza de un espermatozoide (SP) en el espacio
perivitelino. (B): dos pronucleos (PN) formados a las 19 h post FIV.

4.3.2 Clivaje Embrionario. Se realizaron ensayos de fecundación in vitro

utilizando espermatozoides previamente incubados con los tratamientos. El análisis de clivaje

embrionario fue realizado a las 24 h de cultivo observando embriones a partir de dos células.

Se utilizó como control positivo medio IVF-SOF con heparina, y para dilucidar el efecto de la

BSA sobre los espermatozoides se utilizó medio IVF-SOF sin BSA (Figura 23A).
 73

**
A B **
100 *** 100
* **
80 80

% Clivaje
% Clivaje

60 60

40 40

20 20

0 0
(-) SA in
a
SA
a n a
r rin eí
SA B
pa
B
pa af
B e e C
H H
C *
100

80
% Clivaje

60

40

20

0
a
SA r in TP
B A
e pa
H

Figura 23. Clivaje embrionario. (A) Efecto de la BSA sobre los espermatozoides. (B,C) Efecto de la cafeína
y el ATP sobre el clivaje embrionario. Las barras indican el porcentaje de oocitos fecundados que clivaron. Los
espermatozoides fueron incubados durante 15 min en medio IVF-SOF sin BSA, IVF-SOF con BSA, cafeína
(10 mM) y ATP (0.25 mM). La heparina (50μg/ml) se mantuvo las 18 h de FIV. Se muestra el promedio para
cada tratamiento ± el error estándar. Test Oneway ANOVA "Tukey's Multiple Comparison Test" (*= p<0.05;
**= p<0.01; ***= p<0.001) n=4.

No se observaron diferencias significativas con respecto al control negativo en el número de

oocitos fecundados que clivaron para los tratamientos con cafeína y ATP.
 74

Los datos obtenidos a partir del análisis del clivaje demostraron que la procaína y la

pentoxifilina no tienen efecto alguno sobre el clivaje embrionario (Figura 24).

A B

100
* ** 100
** *
80 80
% Clivaje

% Clivaje
60 60

40 40

20 20

0 0
a

a
A

A
rin

ín

rin

lin
BS

BS
a

ifi
pa

pa
oc

ox
He

He
Pr

nt
Pe
Figura 24. Clivaje embrionario. (A, B) Efecto de la procaína y la pentoxifilina sobre el clivaje
embrionario. Las barras indican el porcentaje de oocitos fecundados que clivaron. Los espermatozoides
fueron incubados durante 15 min con medio IVF-SOF con BSA, Procaína (5 mM) y Pentoxifilina (10 mM).
La heparina (50μg/ml) se mantuvo las 18 h de FIV. Se muestra el promedio para cada tratamiento ± el error
estándar. Test Oneway ANOVA "Tukey's Multiple Comparison Test" (*= p<0.05; **= p<0.01; ***=
p<0.001) n=4.
 75

5. Discusión

La producción in vitro de embriones bovinos es la técnica más utilizada en la actualidad ya

que permite producir embriones de alto valor genético en forma masiva y en un corto lapso de

tiempo (Mucci, 2006). Esta técnica junto a otras metodologías reproductivas dispone de

numerosas aplicaciones relevantes desde el punto de vista económico. La extensión de la

investigación en esta área se justifica dada la elevada producción de embriones bovinos in vitro a

nivel mundial (Mucci, 2006).

En un principio, se presentaron inconvenientes para lograr la fecundación in vitro en

mamíferos por carencia de conocimiento acerca del comportamiento de las gametas in vivo, lo

que para reproducirlas en los sistemas in vitro parecía ser un trabajo arduo. Una de las etapas

críticas de esta técnica radica en el éxito de la inducción de la capacitación espermática, si bien

hay una diversidad de estudios dedicados a la comprensión y funcionamiento de los eventos

relacionados a este proceso, en la actualidad aún la inducción de la capacitación in vitro de los

espermatozoides durante el desarrollo de una fecundación in vitro es ineficiente. Por esta razón,

es imprescindible profundizar el estudio de la capacitación espermática a nivel molecular, es

decir, los eventos de señalización que involucra este proceso con el fin de elevar las tasas de

producción embrionaria in vitro (Waremkraut, 2017).

Como ya se ha mencionado, la capacitación espermática es un proceso complejo que implica

cambios estructurales y funcionales en el gameto masculino (Ferramosca y Vincenzo, 2014). La

misma puede ser desarrollada en condiciones in vitro utilizando medios definidos en ausencia del

fluido seminal (Yanagimachi, 1994) y en algunas especies es necesario incorporar un agente

capacitante en el medio, como por ejemplo, en la especie bovina, se han utilizado distintos

agentes que promueven la capacitación, la heparina (Hernández, 2001; Parrish, Susko-Parrish y

 76

First, 1989; Salgado, Rugeles y Alvarez, 2005; Benavides Torres, 2008; Aponte Landinez et al.,

2010; Fernández y Córdoba, 2014), el AMPc (Osycka Salut et al., 2014), la cafeína (De la vega,

Wilde y Cruz, 1997; Marquez y Suarez, 2004; Barakat et al., 2015) la anandamida (Gervasi et al.,

2011), especies reactivas del oxígeno (Rodriguez et al., 2005), entre otros.

La incubación de espermatozoides bovinos con heparina aumenta los niveles de capacitación y

favorece las tasas de fecundación in vitro (Parrish, Susko-Parrish y First, 1989). La eficiencia de

la heparina frente a este proceso y sus costos, han sido el motivo de su uso frecuente como agente

capacitante en esta especie. Este glicosaminoglicano se asocia al espermatozoide provocando

cambios en su membrana plasmática alterando los sacáridos presentes en su superficie,

incrementa los niveles intracelulares de AMPc y Ca2+, eleva el pH intracelular (Mahmoud y

Parrish, 1996; Lane et al., 1999) y junto con el Ca2+ y el HCO3- presentes en el medio, se

desencadena la activación de la vía del AMPc/PKA involucrada en la señalización clásica

descripta para la capacitación espermática (Galantino Homer, Visconti y Kopf, 1997).

Los resultados obtenidos en este trabajo corroboran los datos reportados en estudios previos en

bovinos (Aponte Landinez et al., 2010; Fernández y Córdoba, 2014; Parrish, 2014), ya que la

heparina aumentó significativamente los niveles de capacitación de los espermatozoides bovinos

e incrementó la capacidad fecundante de los mismos (Figura 16).

Estudios sobre la capacitación espermática han demostrado que la misma está correlacionada

con cambios en la fluidez de la membrana plasmática, metabolismo y motilidad del

espermatozoide (Visconti et al., 1995).

Se ha demostrado que la procaína induce hiperactivación en espermatozoides de diferentes

especies de mamíferos, posiblemente aumentando la permeabilidad de la membrana plasmática al

calcio (Ortgies et al., 2012). McPartlin et al. (2009), indican en sus resultados en equinos que la
 77

hiperactivación inducida con procaína no es regulada por la fosforilación de proteínas en residuos

tirosina y la reacción acrosomal asociadas a la capacitación espermática, similar a los hallazgos

en bovinos (McPartlin et al., 2009). Así mismo, Marquez y Suarez, (2004) demostraron en su

trabajo que una concentración de procaína (5 mM) indujo inmediatamente hiperactivación en casi

el 100% de los espermatozoides móviles bovinos, pero no aumentó la fosforilación en residuos

de tirosina. En este trabajo, los resultados mostraron que los espermatozoides tratados con

procaína (5 mM) adquirieron una motilidad más rápida y progresiva en comparación a las demás

drogas mediante una evaluación subjetiva de la motilidad espermática (Tabla 2), lo que podría

coincidir con estudios que reportan un incremento y un cambio en el patrón de motilidad con este

tratamiento en espermatozoides bovinos (Marquez y Suarez, 2004), equinos (McPartlin et al.,

2009) y de cobayos (Mújica et al., 1994). No obstante, la procaína no tuvo efecto sobre la

capacitación espermática y la capacidad fecundante de los espermatozoides en comparación al

control negativo, por consiguiente, se sugiere que el efecto de la procaína está mediado por una

vía de señalización Ca2+ independiente de la vía clásica de capacitación (Marquez y Suarez,

2004).

Las metilxantinas como la cafeína y la pentoxifilina, han sido utilizadas en diversas especies

con el fin de analizar su efecto sobre la motilidad espermática. El efecto estimulante de estos

agentes podría ser causado por un aumento del contenido de AMPc (Stefanovich, 1973; Yovich,

1993; De la vega, Wilde y Cruz, 1997). Además, se ha informado, que los medios químicamente

definidos con cafeína (Niwa y Ohgoda, 1988) y con heparina (Parrish, Susko Parrish y First,

1989) son capaces de inducir la capacitación de espermatozoides bovinos para la fecundación in

vitro.
 78

Los resultados obtenidos en esta tesis mostraron que el tratamiento con cafeína (10mM) sobre

los espermatozoides bovinos proporcionó un efecto positivo sobre la motilidad (Tabla 2)

coincidiendo con los resultados reportados en bovinos donde se reportó que concentraciones altas

de cafeína (10mM) confieren un efecto positivo sobre la motilidad (Wilde, De la vega y Parra,

1990). Sin embargo, aunque se observó una tendencia sobre la inducción de la capacitación con

cafeína frente al control negativo, ese aumento no alcanzó significación estadística (Figura 18).

Además, los resultados mostraron que los espermatozoides tratados con pentoxifilina

adquirieron un incremento el movimiento del flagelo, similar aquellos tratados con cafeína. En

sus estudios Barakat et al., (2015) muestran que no hubo diferencias significativas entre los

tratamientos de cafeína y pentoxifilina sobre la motilidad de los espermatozoides bovinos

(Barakat et al., 2015), lo que respalda el efecto similar de ambos agentes sobre la motilidad

espermática. A pesar de ello, se ha reportado que el porcentaje de motilidad espermática no

presenta cambios significativos con el tratamiento con pentoxifilina en la especie humana (Lewis,

Moohan y Thompson, 1993).

De igual manera, se ha estudiado el requerimiento de ATP, donde la disponibilidad del mismo

es fundamental en la capacidad que tiene el Ca2+ de inducir la hiperactivación (Ho, Granish y

Suarez, 2002). La captación de calcio dependiente de ATP en la membrana plasmática aislada de

la cabeza de espermatozoides de toro, sugirió la participación de la bomba de calcio dependiente

de ATP en la regulación del calcio intracelular en el proceso de capacitación y la reacción del

acrosoma (Breitbart, Darshan y Rubinstein, 1984).

Los resultados obtenidos de CTC en este trabajo, proponen que el tratamiento con ATP,

además de la heparina induciría la capacitación espermática en bovinos (Figura 18). En contraste,

las tasas de clivaje inducida por ATP fueron bajas y aunque se observó una tendencia en los
 79

resultados de LPC, no se presentaron diferencias significativas frente al control (Figura 19) en

comparación a los resultados en un trabajo que indican que el ATP es un inductor de la reacción

acrosomal en espermatozoides de toro, humano y ratón (Torres Fuentes, 2015). Cabe destacar,

que la técnica de CTC permite estudiar eventos tempranos relacionados a la capacitación,

mientras que la técnica de evaluación de la reacción acrosomal inducida por LPC, es un estudio

de un evento tardío del proceso de la capacitación. Sin embargo, la capacitación in vitro requiere

de un tiempo mayor de 30 minutos, como se ha reportado para heparina, para llegar al suceso

final (Salgado, Rugeles y Alvarez, 2005). Es posible que al evaluar dicho parámetro a los 15

minutos no se esté induciendo la capacitación completa, es decir, los tiempos en que se realizaron

las mediciones son menores que los tiempos requeridos para poder evaluar el efecto del LPC. Por

ende, no se estaría viendo el efecto inductor por parte del ATP sobre la reacción acrosomal como

evento final de la capacitación espermática. Por ejemplo, en espermatozoides bovinos

criopreservados, se ha reportado la necesidad de una capacitación con heparina durante al menos

30 minutos para divisar el efecto mediante la técnica de inducción de la reacción acrosomal por

LPC (Blottner, Fasinski y Pitra, 1989). No obstante, se observó que la exposición de los

espermatozoides con el ATP en un periodo de 15 minutos es suficiente para inducir eventos

asociados a la capacitación.

En efecto, los cambios en la motilidad del espermatozoide en condiciones in vitro, proveen la

habilidad al mismo de penetrar las células del cumulus y la zona pelúcida más eficazmente que

los espermatozoides que no pueden sufrir este tipo de modificación (Stauss, Votta y Suarez,

1995)

Aunque, los espermatozoides tratados con procaína, pentoxifilina y la cafeína manifestaron un

cambio en el patrón de la motilidad, no se encontró efecto en la inducción de la capacitación

 80

espermática ni en el clivaje embrionario en los tiempos de incubación utilizados (Figuras 18, 23 y

24). Esto podría deberse a que dichos tratamientos inducen la hiperactivación en los

espermatozoides bovinos sin la capacitación espermática como requisito previo (Marquez and

Suarez, 2004). Durante el estudio del clivaje embrionario se pudo percibir que el uso de la

procaína va en detrimento con la calidad oocitaria, dado que se les observó cambios

citoplasmáticos y muertos, Este efecto tóxico se pudo confirmar al observar que las tasas de

clivaje estaban muy por debajo del control negativo. De igual manera, se reportó el efecto

adverso de la procaína en hamster donde los oocitos expuestos a este agente tuvieron alteraciones

en la zona de la reacción cortical causando poliespermia (Silva Machorro, 2012).

Además, cabe destacar que el ATP no solo presentó diferencias significativas frente al control

en el CTC, sino también con las demás drogas excepto con la cafeína, lo que implicó un interés

acerca de la capacidad fecundante de los espermatozoides tratados con estos dos tratamientos

(Figura 18).

Aunque, los índices de espermatozoides capacitados que presentaron el patrón B en la técnica

de CTC con el tratamiento de ATP son significativamente mayores, no coinciden con los

resultados arrojados por la técnica de LPC, las tasas de clivaje embrionario y porcentaje de

fecundación mediante la evaluación de pronúcleos en donde no se presentaron diferencias

significativas frente al control. Sumado a esto, la cafeína, no tuvo efecto en los resultados de LPC

(Figura 19), a pesar de haberse presentado una cierta tendencia, no se presentó diferencia

significativa alguna.

Si bien, la cafeína confiere un efecto positivo sobre la motilidad (Wilde, De la vega y Parra,

1990), algunos estudios señalan que el uso de la cafeína a mayor concentración puede tener

efectos adversos en los espermatozoides. En conejos, Lopez y Alvariño (2000) encontraron que la
 81

cafeína no mejoró la fecundación, independientemente de su capacidad para aumentar la

motilidad de los espermatozoides a mayor concentración (10 mM) (López y Alvariño, 2000). En

otro estudio sobre humanos, una mayor concentración de cafeína (>2.5 mM) mostró efectos

adversos sobre la capacidad fecundante de los espermatozoides y el clivaje embrionario

(Imoedemhe et al., 1992). Los mismos resultados también se informaron en humanos (Aitken et

al., 1983) y bovinos (Bird, Carey y Houghton, 1989). Los resultados en el clivaje embrionario

podrían apoyar los estudios anteriormente citados acerca del efecto adverso de la cafeína ya que

los mismos presentaron porcentajes por debajo de control (Figura 23). Sin embargo, en este

trabajo se observó una diferencia significativa frente al control negativo en el estudio del

porcentaje de fecundación mediante la evaluación de los pronúcleos. Es importante mencionar,

que al momento de realizar la evaluación de pronúcleos, se les consideró fecundados a aquellos

oocitos que presentaron los dos pronúcleos como también aquellos oocitos que contenían un

espermatozoide dentro de su espacio perivitelino.

Momozawa y Fuduka (Momozawa y Fuduka, 2003) recomendaron el uso del medio de

fecundación sin cafeína en la FIV bovina. Por otra parte, se podría decir que el estudio del

porcentaje de fecundación mediante evaluación de pronúcleos no es del todo confiable al ser este

un estudio subjetivo y dependiente de un criterio de evaluación de dicho parámetro. No obstante,

vale decir, que los espermatozoides expresan la fosforilación de proteínas en residuos tirosina

asociado a la capacitación después de 4h de incubación con cafeína en semen fresco de bovinos,

pero la hiperactivación se reduce significativamente (Marquez y Suarez, 2004).

En otro aspecto, las tasas de clivaje alcanzados en este trabajo sin la utilización de un agente

capacitante externo (BSA), se podría atribuir a que el proceso de criopreservación induce niveles

basales de capacitación en el espermatozoide (Naresh y Atreja, 2015). Por esta razón no se

obtuvieron porcentajes nulos para el control con BSA en las técnicas de CTC, inducción de la
 82

reacción acrosomal por LPC y clivaje embrionario. Además, los resultados del clivaje

embrionario en ausencia de BSA, confirman el efecto del mismo sobre la capacitación

espermática en este trabajo (Figura 23A) y respaldan los estudios acerca de que la albúmina

sérica es un componente clave en la capacitación de los espermatozoides de los mamíferos

(Ravnik, Albers y Muller, 1993). De igual manera, Noguchi et al., (2008) sugieren que la

eliminación de colesterol por la albúmina es una señal importante y un factor esencial para la

capacitación y la hiperactivación, a partir de sus resultados donde suspendieron espermatozoides

de hámster en un medio sin BSA, y no ocurrió hiperactivación en absoluto (Noguchi et al., 2008).

En base a los resultados obtenidos en el desarrollo de esta tesis, se propone que el tratamiento

con ATP induce eventos tempranos asociados a la capacitación, como cambios en la membrana

del espermatozoide. Lo cual sugeriría un efecto de un flujo de calcio al interior del

espermatozoide generando la energía necesaria para inducir motilidad pero no concluye el

proceso completo de la capacitación espermática.

Durante la capacitación, ocurre primero la remoción del colesterol de la membrana plasmática

del espermatozoide por acción de la albúmina, esto aumenta la permeabilidad de la membrana

(Langlais y Roberts, 1985; Fujinoki, 2011). Entonces un flujo de Ca2+ se produce a través de la

estimulación de HCO3- (H. C. Ho y Suarez, 2001; Fujinoki et al., 2006) y se activa los sistemas

de mensajero secundario, para finalmente producir AMPc. De manera que la disponibilidad de

ATP es fundamental en la capacidad que tiene el Ca2+ de inducir la hiperactivación (Ho, Granish

y Suarez, 2002). Por ende, la concentración y tiempo de incubación utilizados de ATP en este

trabajo podría haber tenido un efecto sobre el ingreso de Ca2+ necesario al interior de la gameta

para activar el adenilato ciclasa, lo que resulta en un incremento en los niveles de AMPc y demás

eventos asociados a la vía clásica de capacitación.

 83

Además, dado que el tratamiento con ATP, actúa como agente capacitante en espermatozoides

bovinos según la técnica de CTC, pero no coinciden con los datos arrojados en el LPC, clivaje

embrionario y el porcentaje de fecundación mediante la evaluación de pronúcleos, surgió

entonces una hipótesis, el ATP podría estar induciendo eventos muy tempranos de la capacitación

como lo es un movimiento del calcio asociado a la membrana plasmática, y no estaría induciendo

en totalidad los eventos característicos ligados a la capacitación espermática.

Pese a que, Salicioni et al, (2007) dividen la capacitación en eventos rápidos y lentos

(Salicioni et al., 2007), los eventos rápidos y tempranos incluyen la activación del movimiento

asimétrico y vigoroso de los flagelos. Los eventos lentos y tardíos incluyen la adquisición de la

capacidad de llevar a cabo la reacción acrosomal y la fosforilación de las proteínas en residuos

tirosina, ambos procesos parecen estar regulados ampliamente por moléculas similares como por

ejemplo el HCO3- y el AMPc (Salicioni et al., 2007). Actualmente, hay descriptas numerosas

vías de señalización involucradas en la motilidad y capacitación espermática demostrando que la

misma es un proceso complejo (Shi kai yWan xi, 2016).

A partir de los resultados obtenidos en este trabajo y en base a los antecedentes mencionados,

se sugiere el tratamiento de espermatozoides con pentoxifilina en combinación con heparina,

dado que podría ser efectivo en la fecundación in vitro en bovinos (Numabe et al., 2001).

Asimismo, se sugiere un tratamiento con cafeína y heparina en la fecundación in vitro en dicha

especie puesto que el efecto sinérgico podría aumentar la eficiencia de la capacidad fecundante

en espermatozoides bovinos criopreservados (Park, Ohgoda and Niwa, 1989).

 84

6. Conclusiones

De acuerdo al análisis del efecto inductor de los distintos tratamientos sobre la

capacitación espermática, el ATP podría estar induciendo eventos tempranos de la

capacitación.

Al tratar los espermatozoides bovinos con procaína, los mismos adquirieron un cambio en

el patrón de motilidad, siendo este un batido asimétrico de la cola con motilidad progresiva.

Por otro lado, la cafeína, le confiere al espermatozoide la motilidad necesaria para

desprenderse de las células del cumulus que rodean al oocito y pasar por la zona pelúcida,

llegando al espacio perivitelino, pero no logra penetrar el oocito.

Los tratamientos con las diferentes drogas no tuvieron efecto en las tasas de clivaje

embrionario en comparación al control.

 85

7. Recomendaciones

Se propone combinar los tratamientos utilizados con heparina dado que algunos tratamientos

tuvieron efecto en la motilidad, por ende, inducir la capacitación y un efecto beneficioso en la

motilidad con dos agentes probablemente se vería un efecto potenciado.

Se plantea en un próximo paso, evaluar el desarrollo embrionario en cada tratamiento y al

obtener blastocistos evaluar la calidad de los mismos.

 86

Bibliografía

Ahuja Aguirre, C. et al. (2009) ‘Medio alternativo para la producción in vitro de embriones
bovinos.’, Zootecnia Tropical, pp. 277–284.

Aitken, R. et al. (1983) ‘Influence of caffeine on movement characteristics, fertilizing capacity

and ability to penetrate cervical mucus of human spermatozoa.’, Journal of Reporduction
and Fertility, 67, pp. 19–27.

Alm, H. et al. (2001) ‘Effect of sperm cryopreservation and treatment with calcium ionophore or
heparin on in vitro fertilization of horse oocytes.’, Theriogenology, 56, pp. 817–29.

Almog, T. and Naor, Z. (2008) ‘Mitogen activated protein kinases ( MAPKs ) as regulators of
spermatogenesis and spermatozoa functions.’, Molecular and Cellular Endocrinology, 282,
pp. 39–44. doi: 10.1016/j.mce.2007.11.011.

Alvau, A. et al. (2016) ‘The tyrosine kinase FER is responsible for the capacitation-associated
increase in tyrosine phosphorylation in murine sperm.’, Development (Cambridge,
England), 143(13), pp. 2325–33. doi: 10.1242/dev.136499.

Alwan, S. and Saleem, R. (2013) ‘Effect of heparin on the capacitation of frozen – Thawed bull
sperm used in the In-vitro fertilization of oocytes matured In-vitro’, International Journal
of Pharmacy & Life Sciences, 4(2), pp. 2368–370.

Aparicio, N. J. et al. (1980) ‘Effect of the phosphodiesterase inhibitor Pentoxyfylline on human

sperm motility.’, Andrologia, 12(1), pp. 49–54. Available at:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7377553.

Aponte Landinez, A. et al. (2010) ‘Evaluation of embryonic development of bovine oocytes in

vitro matured and fertilized obtained from crossbred females.’, Revista de la Facultad de
Agronomía de la Universidad del Zulia, 27, pp. 460–478.

Arenas, E. et al. (2010) ‘Bases fisiológicas de la capacitación y de la reacción acrosomal del

espermatozoide.’, Contactos, 78, pp. 5–11. Available at:
http://www.izt.uam.mx/newpage/contactos/anterior/n78ne/fisiologica.pdf.

Austin (1951) ‘Observations on the penetration of the sperm in the mammalian egg’, Australian
 87

journal of scientific research. Series B, Biological sciences., 4, pp. 581–96.

Ávila Portillo, L. M. et al. (2006) ‘Fundamentos de criopreservación.’, Revista Colombiana de

Obstetricia y Ginecología, 57, pp. 291–300.

Barakat, I. et al. (2015) ‘Effect of Various Concentrations of Caffeine, Pentoxifylline, and

Kallikrein on Hyperactivation of Frozen Bovine Semen.’, BioMed Research International,
2015, pp. 1–7. doi: 10.1155/2015/948575.

Bedford, J. M. (1970) ‘Sperm capacitation and fertilization in mammals.’, Biology of

Reproduction, 2, p. Suppl 2:128-58. Available at:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4939237.

Bedford, J. M. and Chang, M. C. (1962) ‘Removal of decapacitation factor from seminal plasma
by high-speed centrifugation.’, The American Journal of Physiology, 202, pp. 179–81.
Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13866460.

Bedu-Addo, K. et al. (2005) ‘Bicarbonate and bovine serum albumin reversibly “switch”
capacitation-induced events in human spermatozoa.’, Molecular Human Reproduction,
11(9), pp. 683–91. doi: 10.1093/molehr/gah226.

Bellido, P. (1997) ‘Mecanismo de fertilización.’, Ginecología y Obstetricia, 43, pp. 183–190.

Benavides Torres, R. (2008) Evaluación de tres protocolos de capacitación espermática bovina.

Universidad de la Salle.

Berg, U. and Reichenbach, H. D. (1988) Producción in vitro de Embriones, Producción in vitro

de Embriones. Available at: http://www.reprobiotec.com/libro_rojo/capitulo_11.pdf.

Bergeron, A. et al. (2016) ‘Characterization of cAMP-phosphodiesterase activity in bovine

seminal plasma.’, Andrology, 6, pp. 1123–30.

Bergman, J. (1999) ‘ATP: The Perfect Energy Currency for the Cell .’, Creation Research
Society Quarterly, 36, pp. 36–41.

Bird, J. M., Carey, S. and Houghton, J. A. (1989) ‘Molitity and acrosomal changes in ionophore-
treated bovine spermatozoa and their relationship with in vitro penetration of zone-free
hamster oocytes.’, Theriogenology, 32(2), pp. 227–42. Available at:
 88

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16726670.

Blottner, S., Fasinski, M. and Pitra, C. (1989) ‘The detection of in vitro capacitation of bull
sperm by heparin treatment.’, Archiv Fur Experimentelle Veterinarmedizin, 4, pp. 623–35.

Bohnensack, R. and Halangk, W. (1986) ‘Control of respiration and of motility in ejaculated bull
spermatozoa.’, Biochimica et Biophysica Acta, 850(1), pp. 72–9. Available at:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3635412.

Breininger, E. et al. (2003) ‘Inductores de la capacitacion y viabilidad espermatica en semen

porcino criopreservado.’, in Asociacion Argentina de Produccion Animal. Mendoza,
Argentina: Congreso; 26° Congreso Argentino de Produccion Animal.

Breitbart, H., Darshan, R. and Rubinstein, S. (1984) ‘Evidence for the presence of ATP-
dependent calcium pump and ATPase activities in bull sperm head membranes.’,
Biochemical and Biophysical Research Communications, 2, pp. 479–84.

Bueno, J. and López, M. (2014) Las Múltiples Ventajas de la Fertilización in Vitro en

Ganadería., Perulactea. Available at: http://www.perulactea.com/2014/03/24/las-
multiples-ventajas-de-la-fertilizacion-in-vitro-en-ganaderia/.

Byrd, W. (1981) ‘In vitro capacitation and the chemically induced acrosome reaction in bovine
spermatozoa.’, Journal of Experimental Zoology, 215(1), pp. 35–46. doi:
10.1002/jez.1402150105.

Carr, D. W. and Acott, T. S. (1989) ‘Intracellular pH regulates bovine sperm motility and protein
phosphorylation.’, Biology of Reproduction, 41(5), pp. 907–20. Available at:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2624855.

Chang (1951) ‘Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes.’, Nature,
168, pp. 697–8.

Cherr, G. N. et al. (1986) ‘In vitro studies of the golden hamster sperm acrosome reaction:
completion on the zona pellucida and induction by homologous soluble zonae pellucidae.’,
Developmental Biology, 114(1), pp. 119–31. Available at:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3514315.
 89

Chung, Randall and Stanley (1979) ‘Procedures for obtaining high percentages of viable in vitro
capacitated hamster sperm.’, Gamete Research, 2(3), pp. 207–11. doi:
10.1002/mrd.1120020304.

Colás, C., Cebrián-Pérez, J. A. and Muiño-Blanco, T. (2010) ‘Caffeine induces ram sperm
hyperactivation independent of cAMP-dependent protein kinase.’, International Journal of
Andrology, 33(1), pp. e187-97. doi: 10.1111/j.1365-2605.2009.00991.x.

Contreras, E. (2009) Efecto De La Cafeína Sobre La Motilidad De Las Células Espermáticas En

La Especie Porcina, Universidad Autónoma De Nuevo León. Universidad Autónoma De
Nuevo León.

Contreras, F. J. et al. (2010) ‘Evaluación de la capacidad de desarrollo in vitro de ovocitos

bovinos provenientes de vacas con predominancia fenotípica bos taurus y bos indicus.’,
Revista Científica, 20, pp. 259–267.

Cross, N. et al. (1988) ‘Induction of Acrosome Reactions by the Human Zona Pellucida.’,
Biology of Reproduction, 38, pp. 235–244. doi: https://doi.org/10.1095/biolreprod38.1.235.

Cross, N. (1996) ‘Effect of cholesterol and other sterols on human sperm acrosomal
responsiveness.’, Molecular Reproduction and Development, 45(2), pp. 212–7. doi:
10.1002/(SICI)1098-2795(199610)45:2<212::AID-MRD14>3.0.CO;2-2.

Crozet, N. (1984) ‘Ultrastructural aspects of in vivo fertilization in the cow.’, Gamete Research,
10(3), pp. 241–51. doi: 10.1002/mrd.1120100304.

Crozet, N. (1988) ‘Ultrastructural aspects of in vitro fertilization in sheep.’, Journal of

Ultrastructure and Molecular Structure Research, 98(1), pp. 1–10. Available at:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3351351.

Crozet, N., Théron, M. C. and Chemineau, P. (1987) ‘Ultrastructure of in vivo fertilization in the
goat.’, Gamete Research, 18(2), pp. 191–9. doi: 10.1002/mrd.1120180209.

Dapino, D., Marini, P. and Cabada, M. (2006) ‘Effect of heparin on in vitro capacitation of boar
sperm.’, Biological Reasearch, 36, pp. 631–9.

Darszon, A. et al. (2007) ‘Ion channels in sperm motility and capacitation.’, Society of
 90

Reproduction and Fertility Supplement, 65, pp. 229–44. Available at:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17644965.

Davis, B. K. (1980) ‘Interaction of lipids with the plasma membrane of sperm cells. I. The
antifertilization action of cholesterol.’, Archives of Andrology, 5(3), pp. 249–54. Available
at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7436624.

Demarco et al. (2003) ‘Involvement of a Na+/HCO-3 cotransporter in mouse sperm

capacitation.’, The Journal of Biological Chemimstry, 9, pp. 7001–9. doi:
10.1074/jbc.M206284200.

Eddy (2006) ‘Phisiology of Reproduction.’, in Neill D, J. (ed.) Physiology of Reproduction.

Elseiver I. U.S.A, pp. 3–53.

Escoffier, J. et al. (2012) ‘Flow cytometry analysis reveals a decrease in intracellular sodium
during sperm capacitation.’, Journal of Cell Science, 125(Pt 2), pp. 473–85. doi:
10.1242/jcs.093344.

Fernández, S. and Córdoba, M. (2014) ‘El espermatozoide criopreservado bovino es capaz de

modular su requerimiento energético dependiendo de los sustratos oxidativos disponibles
para la capacitación inducida in vitro con heparina .’, Investigación Veterinaria, 16(2), pp.
69–78.

Ferramosca, A. and Vincenzo, Z. (2014) ‘Bioenergetics of Mammalian Sperm Capacitation.’,

BioMed Research International, 25, pp. 1–8.

Ferré, L. and Cattaneo, L. (2013) ‘Biotecnologías reproductivas: producción in vitro de

embriones y semen sexado.(¿La pareja perfecta?).’, Revista Medica Veterinaria, 94, pp.
28–36.

Florman, H. M. and First, N. L. (1988) ‘Regulation of acrosomal exocytosis. II. The zona
pellucida-induced acrosome reaction of bovine spermatozoa is controlled by extrinsic
positive regulatory elements.’, Developmental Biology, 128(2), pp. 464–73. Available at:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3396769.

Fox, S. (2011) ‘The study of body function.’, in Human Physiology. McGraw-Hil. Human
Physiology.
 91

Fraser, L. R. (1982) ‘Ca2+ Is Required for Mouse Sperm Capacitation and In Vitro
Fertilization.’, Journal of Andrology, pp. 412–19.

Fraser, L. R., Abeydeera, L. R. and Niwa, K. (1995) ‘Ca2+Regulating mechanisms that modulate
bull sperm capacitation and acrosomal exocytosis as determined by chlortetracycline
analysis.’, Molecular Reproduction and Development, 40(2), pp. 233–41. doi:
10.1002/mrd.1080400213.

van Furth, A. M. et al. (1997) ‘Effect of lisofylline and pentoxifylline on the bacterial-stimulated
production of TNF-alpha, IL-1 beta IL-10 by human leucocytes.’, Immunology, 91(2), pp.
193–6. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9227316.

Gadea, J. (2001) ‘La evaluación de la capacidad fecundante de los espermatozoides porcinos

mediante la fecundación in vitro.’, Investigación Agraria. Producción y Sanidad Animales
(revisión), pp. 63–77.

Gadella, B. M. et al. (2008) ‘Sperm head membrane reorganisation during capacitation.’, The
International Journal of Developmental Biology, 52, pp. 473–80.

Galantino Homer, H. L., Visconti, P. E. and Kopf, G. S. (1997) ‘Regulation of protein tyrosine
phosphorylation during bovine sperm capacitation by a cyclic adenosine 3’5’-
monophosphate-dependent pathway.’, Biology of Reproduction, 56(3), pp. 707–19.
Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9047017.

Garbers, D. L. et al. (1971) ‘Stimulation and maintenance of ejaculated bovine spermatozoan

respiration and motility by caffeine.’, Biology of Reproduction, 5(3), pp. 336–9. Available
at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/5163525.

Gardón, J., Matás, C. and Gadea, J. (2001) ‘EFECTO DEL PROTOCOLO DE PREPARACIÓN
DE LOS ESPERMATOZOIDES BOVINOS SOBRE EL PATRÓN DE REACCIÓN
ACROSÓMICA.’, Anales de Veterinaria Murcia, 17, pp. 19–26.

Garner y Hafez (1996) ‘Reproducción e Inseminación Artificial en Animales.’, in Interamericana,

E. (ed.) Reproducción e Inseminación Artificial en Animales. 7th edn, pp. 158–79.

Garty, N. B. and Salomon, Y. (1987) ‘Stimulation of partially purified adenylate cyclase from
bull sperm by bicarbonate.’, FEBS letters, 218(1), pp. 148–52. Available at:
 92

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3036587.

Gavella, M., Lipovac, V. and Marotti, T. (1991) ‘Effect of pentoxifylline on superoxide anion
production by human sperm.’, International Journal of Andrology, 14(5), pp. 320–7.
Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1665480.

Gervasi, M. et al. (2011) ‘Anandamide Capacitates Bull Spermatozoa through CB1 and TRPV1
Activation.’, Published Online, 6, pp. 1–10.

Ghasemzadeh, A. et al. (2016) ‘Study of pentoxifylline effects on motility and viability of

spermatozoa from infertile asthenozoospermic males.’, Nigerian medical journal : Journal
of the Nigeria Medical Association, 57(6), pp. 324–328. doi: 10.4103/0300-1652.193857.

Go and Wolf (1985) ‘Albumin-mediated changes in sperm sterol content during capacitation.’,
Biology of Reproduction, 32, pp. 145–53.

Hafez (2002) ‘Reproducción e Inseminación Artificial en Animales.’, in Reproducción e

Inseminación Artificial en Animales. Lippincott. México, pp. 3–11. Available at:
https://es.scribd.com/doc/150197543/HAFEZ-REPRODUCCION-E-INSEMINACION-
ARTIFICIAL-pdf.

Handrow, R. R. et al. (1984) ‘Specific binding of the glycosaminoglycan 3H-heparin to bull,

monkey, and rabbit spermatozoa in vitro.’, Journal of Andrology, 5(2), pp. 51–63.
Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6715257.

Harrison, R. A. (2004) ‘Rapid PKA-catalysed phosphorylation of boar sperm proteins induced by

the capacitating agent bicarbonate.’, Molecular Reproduction and Development, 3, pp.
337–52.

Henkel, R. R. and Schill, W.-B. (2003) ‘Sperm preparation for ART.’, Reproductive biology and
endocrinology : RB&E, 1, p. 108. doi: 10.1186/1477-7827-1-108.

Hernández, H. (2001) ‘Fertilización in vitro.’, in Reproducción Bovina. Venezuela, pp. 413–26.

Ho, H. C., Granish, K. A. and Suarez, S. (2002) ‘Hyperactivated motility of bull sperm is
triggered at the axoneme by Ca2+ and not cAMP.’, Developmental Biology, 250(1), pp.
208–17. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12297107.
 93

Ho, H. and Suarez, S. (2001) ‘Hyperactivation of mammalian spermatozoa: function and

regulation.’, Reproduction, 122(4), pp. 519–26. doi: 10.1530/reprod/122.4.519.

Hyttel, P., Xu, K. P. and Greve, T. (1988) ‘Ultrastructural abnormalities of in vitro fertilization of
in vitro matured bovine oocytes.’, Anatomy and Embryology, 178(1), pp. 47–52. Available
at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3377201.

Imoedemhe, D. A. et al. (1992) ‘The effect of caffeine on the ability of spermatozoa to fertilize
mature human oocytes.’, Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 9(2), pp. 155–60.
Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1627932.

Janice, B., Blodeau, J. F. and Cormier, N. (2000) ‘Semen cryopreservation in domestic animals: a
damaging and capacitating phenomenon.’, Journal of Andrology, 21, pp. 1–7.

Jin, M. et al. (2011) ‘Most fertilizing mouse spermatozoa begin their acrosome reaction before
contact with the zona pellucida during in vitro fertilization.’, Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America, 108(12), pp. 4892–6. doi:
10.1073/pnas.1018202108.

Kamp, G., Büsselmann, G. and Lauterwein, J. (1996) ‘Spermatozoa: models for studying
regulatory aspects of energy metabolism.’, Experientia, 52(5), pp. 487–94. Available at:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8641386.

King, W. A. et al. (1988) ‘Nucleolus organizer regions and nucleoli in preattachment bovine
embryos.’, Journal of Reproduction and Fertility, 82(1), pp. 87–95. Available at:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3339599.

Kopecny, V. et al. (1989) ‘Nucleologenesis and the onset of transcription in the eight-cell bovine
embryo: fine-structural autoradiographic study.’, Molecular Reproduction and
Development, 1(2), pp. 79–90. doi: 10.1002/mrd.1080010202.

Kopt, G. S. (1990) ‘The zona pellucida–induced acrosome reaction: a model for sperm signal
traduction.’, in Cummings, J. & Roldan, E. R. (eds) (ed.) Fertilization in mammals. Serono
Sym, pp. 253–266.

Krzyzosiak, J., Molan, P. and Vishwanath, R. (1999) ‘Measurements of bovine sperm velocities
under true anaerobic and aerobic conditions.’, Animal Reproduction Science, 55(3–4), pp.
 94

163–73. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10379669.

De la vega, A., Wilde, O. and Cruz, L. (1997) ‘Efectos de la pentoxifilina y la cafeína sobre la
motilidad de espermatozoides bovinos criopreservados.’, Avances en Ciencias Veterinarias.
Available at:
http://www.avancesveterinaria.uchile.cl/index.php/ACV/article/view/4795/4681.

Lamirande, E. and Gagnon, C. (1993) ‘Human sperm hyperactivation and capacitation as parts of
an oxidative process.’, Free Radical Biology& Medicine, 14, pp. 157–66.

Lane, M. et al. (1999) ‘Heparin and high-density lipoprotein mediate bovine sperm capacitation
by different mechanisms.’, Biology of Reproduction, 1, pp. 169–75.

Langlais, J. and Roberts, K. D. (1985) ‘A molecular membrane model of sperm capacitation and
the acrosome reaction of mammalian spermatozoa.’, Gamete Research, 12(2), pp. 183–224.
doi: 10.1002/mrd.1120120209.

Laurincík, J. et al. (1998) ‘A detailed analysis of pronucleus development in bovine zygotes in

vitro: cell-cycle chronology and ultrastructure.’, Molecular Reproduction and
Development, 50(2), pp. 192–9. doi: 10.1002/(SICI)1098-2795(199806)50:2<192::AID-
MRD10>3.0.CO;2-9.

Laurincik, J., Hyttel, P. and Kopecny, V. (1995) ‘DNA synthesis and pronucleus development in
pig zygotes obtained in vivo: an autoradiographic and ultrastructural study.’, Molecular
Reproduction and Development, 40(3), pp. 325–32. doi: 10.1002/mrd.1080400308.

Lee, C. N. and Ax, R. L. (1984) ‘Concentrations and composition of glycosaminoglycans in the

female bovine reproductive tract.’, Journal of Dairy Science, 67(9), pp. 2006–9. doi:
10.3168/jds.S0022-0302(84)81536-2.

Lee, M. A. and Storey, B. T. (1986) ‘Bicarbonate is essential for fertilization of mouse eggs:
mouse sperm require it to undergo the acrosome reaction.’, Biology of Reproduction, 34(2),
pp. 349–56. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3082381.

Lewis, S. E., Moohan, J. M. and Thompson, W. (1993) ‘Effects of pentoxifylline on human

sperm motility in normospermic individuals using computer-assisted analysis.’, Fertility
and Sterility, 59(2), pp. 418–23. Available at:
 95

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8425640.

Lindemann, C. B., Goltz, J. S. and Kanous, K. S. (1987) ‘Regulation of activation state and
flagellar wave form in epididymal rat sperm: evidence for the involvement of both Ca2+
and cAMP.’, Cell Motility and the Cytoskeleton, 8(4), pp. 324–32. doi:
10.1002/cm.970080405.

Lonergan, P. et al. (2003) ‘Oocyte and embryo quality: effect of origin, culture conditions and
gene expression patterns.’, Reproduction in Domestic Animals = Zuchthygiene, 4, pp. 259–
67.

López, F. and Alvariño, J. (2000) ‘Effects of added caffeine on results following artificial
insemination with fresh and refrigerated rabbit semen.’, Animal Reproduction Science, 58,
pp. 147–54.

De los Reyes, M. . (1992) Estudio de la cinética de la liberació de acrosina en espermatozoides

de toro durante la capacitación, reacción acrsómica y penetración de la zona pelúcida.
Universidad de Chile.

Lu, K., Cran, D. and Seidel, G. (1999) ‘In vitro fertilization with flow-cytometrically-sorted
bovine sperm.’, Theriogenology, 8, pp. 1393–405.

Mahmoud, A. and Parrish, J. J. (1996) ‘Oviduct fluid and heparin induce similar surface changes
in bovine sperm during capacitation: a flow cytometric study using lectins.’, Molecular
Reproduction and Development, 4, pp. 554–60.

Marquez, B. and Suarez, S. (2004) ‘Different Signaling Pathways in Bovine Sperm Regulate
Capacitationand Hyperactivation.’, Biology of Reproduction, 70(6), pp. 1626–1633. doi:
10.1095/biolreprod.103.026476.

McPartlin, L. et al. (2009) ‘Hyperactivation of stallion sperm is required for successful in vitro
fertilization of equine oocytes.’, Biology of Reproduction, 81, pp. 199–206.

Miller, D. J., Winer, M. A. and Ax, R. L. (1990) ‘Heparin-binding proteins from seminal plasma
bind to bovine spermatozoa and modulate capacitation by heparin.’, Biology of
Reproduction, 42(5–6), pp. 899–915. Available at:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2383614.
 96

Momozawa, K. and Fuduka, Y. (2003) ‘Caffeine in fertilizationmedium is not essential for

bovine IVF by fully capacitated spermatozoa.’, The Journal of Reproduction and
development, 49, pp. 507–12.

Moreno, R. D. and Alvarado, C. P. (2006) ‘The mammalian acrosome as a secretory lysosome:

new and old evidence.’, Molecular Reproduction and Development, 73(11), pp. 1430–4.
doi: 10.1002/mrd.20581.

Mucci, N. (2006) ‘Producción in vitro de embriones bovinos : suplementación de los medios de

cultivo con suero.’, Archivos de Medicina Veterinaria, 38, pp. 97–104.

Mújica, A. et al. (1991) ‘Glucose regulation of guinea-pig sperm motility.’, Journal of

reproduction and fertility, 92(1), pp. 75–87. Available at:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1647458.

Mújica, A. et al. (1994) ‘Mechanism for Procaine-Mediated Hy perac tivated Motility in Guinea
Pig Spermatozoa.’, Molecular Reproduction and Development, 38, pp. 285–292.

Munuce, J. (2008) ‘El laboratorio andrológico en la evaluación del factor masculino.’,

Reproducción, 23, pp. 120–28.

Mutto, A. Á. (2014) ‘Manual de Producción in vitro de Embriones’. Balcarce, p. 32.

Naresh, S. and Atreja, S. (2015) ‘Cryobiology The protein tyrosine phosphorylation during in
vitro capacitation and cryopreservation of mammalian spermatozoa’, Cryobiology. Elsevier
Inc., 70(3), pp. 211–16. doi: 10.1016/j.cryobiol.2015.03.008.

Navarrete, F. A. et al. (2015) ‘Biphasic role of calcium in mouse sperm capacitation signaling
pathways.’, Journal of cellular physiology, 230(8), pp. 1758–69. doi: 10.1002/jcp.24873.

Neill, J. M. and Olds-Clarke, P. (1987) ‘A computer-assisted assay for mouse sperm

hyperactivation demonstrates that bicarbonate but not bovine serum albumin is required.’,
Gamete Research, 18(2), pp. 121–40. doi: 10.1002/mrd.1120180204.

Niwa, K. and Ohgoda, O. (1988) ‘Synergistic effect of caffeine and heparin on in-vitro
fertilization of cattle oocytes matured in culture.’, Theriogenology, 30(4), pp. 733–41.
Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16726515.
 97

Noguchi, T. et al. (2008) ‘Regulation of hyperactivation of hamster spermatozoa by

progesterone’, Reproductive Medicine and Biology, 7(2), pp. 63–74.

Numabe, T. et al. (2001) ‘Pentoxifylline improves in vitro fertilization and subsequent

development of bovine oocytes.’, Theriogenology, 56(2), pp. 225–33. Available at:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11480615.

O’Rand, M. G. and Fisher, S. J. (1987) ‘Localization of zona pellucida binding sites on rabbit
spermatozoa and induction of the acrosome reaction by solubilized zonae.’, Developmental
Biology, 119, pp. 551–9.

Olivera, M. et al. (2006) ‘El espermatozoide , desde la eyaculación hasta la fertilización.’,

Revista Colombiana de Ciencias Pecuarias, 19(4), pp. 426–436.

Ortgies, F. et al. (2012) ‘Effect of procaine, pentoxifylline and trolox on capacitation and
hyperactivation of stallion spermatozoa.’, Andrologia, 44 Suppl 1, pp. 130–8. doi:
10.1111/j.1439-0272.2010.01150.x.

Osycka Salut, C. (2010) ‘“Regulación de la interacción espermatozoide-ovidcuto por el sistema

endocannabinoide y el sistema nitérgico en bovinos”.’

Osycka Salut, C. et al. (2014) ‘Cyclic AMP efflux, via MRPs and A1 adenosine receptors, is
critical for bovine sperm capacitation.’, Molecular Human Reproduction, 20(1), pp. 89–99.
doi: 10.1093/molehr/gat053.

Palma, G. (2008) ‘Biotecnología de la Reproducción.’, in Biotecnología de la Reproducción.

Segunda Ed. Mar de Plata, Argentina.

Park, C., Ohgoda, O. and Niwa, K. (1989) ‘Penetration of bovine follicular oocytes by frozen-
thawed spermatozoa in the presence of caffeine and heparin.’, Journal of reproduction and
fertility, 2, pp. 577–82.

Parrish, J. J. (2014) ‘Bovine In vitro fertilization: In vitro oocyte maturation and sperm
capacitation with heparin.’, Theriogenology, 23(1), pp. 1–12. doi: 10.1038/jid.2014.371.

Parrish, J. J., Susko Parrish, J. L. and First, N. L. (1989) ‘Capacitation of bovine sperm by
heparin: inhibitory effect of glucose and role of intracellular pH.’, Biology of Reproduction,
 98

41(4), pp. 683–99. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2620077.

Peeker, R., Abramsson, L. and Marklund, S. L. (1997) ‘Superoxide dismutase isoenzymes in

human seminal plasma and spermatozoa.’, Molecular Human Reproduction, 3(12), pp.
1061–6. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9464851.

Ravnik, S., Albers, J. and Muller, C. (1993) ‘A novel view of albumin-supported sperm
capacitation: role of lipid transfer protein-I.’, Fertility and Sterility, 59, pp. 629–38.

Reyes, A., Goicoechea, B. and Rosado, A. (1978) ‘Calcium ion requirement for rabbit
spermatozoal capacitation and enhancement of fertilizing ability by ionophore A23187 and
cyclic adenosine 3’:5’-monophosphate.’, Fertility and Sterility, 29(4), pp. 451–5. Available
at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/206471.

Reyes, M. (1992) ‘Capacitación espermática y reacción acrosómica in vitro en bovinos.’,

Monografías de Medicina Veterinaria, December. Available at:
http://www.monografiasveterinaria.uchile.cl/index.php/MMV/article/view/4994/4879.

Ribeiro Peresa, A. et al. (2014) ‘Cryopreservation of bovine spermatozoa from the epididymal
tail using conventional and automated methods.’, Archivos de Medicina Veterinaria, 46,
pp. 31–38.

Rodriguez, P. et al. (2005) ‘Nitric oxide-induced capacitation of cryopreserved bull spermatozoa

and assessment of participating regulatory pathways.’, Animal Reproduction Science, 85,
pp. 231–42. doi: 10.1016/j.anireprosci.2004.05.018.

Rodríguez Almeida, F. et al. (2008) ‘Capacitación espermática inducida por la conservación de

semen de carnero diluido, refrigerado o congelado.’, Agrociencia, 41, p. 399–406.

Roldan, E. and Harrison, R. (1990) ‘Molecular mechanism leading to exocytosis during the
sperm acrosome reaction.’, in Cummins, J. & Roldan, E. R. (ed.) Fertilization in mammals.
Serono Sym, pp. 179–195.

Ruknudin, A. and Silver, I. A. (1990) ‘Ca2+ uptake during capacitation of mouse spermatozoa
and the effect of an anion transport inhibitor on Ca2+ uptake.’, Molecular Reproduction
and Development, 26(1), pp. 63–8. doi: 10.1002/mrd.1080260110.
 99

Salgado, R. D., Rugeles, C. C. and Alvarez, J. (2005) ‘Efecto de la heparina y de la concentración

espermática sobre el porcentaje de fertilización de oocitos bovinos in vitro.’, Revista
Colombiana de Ciencias Pecuarias, 18, pp. 122–6.

Salicioni, A. et al. (2007) ‘Signalling pathways involved in sperm capacitation.’, Society of

Reproduction and Fertility Supplement, 65, pp. 245–59.

Saling, P. M. and Bedford, J. M. (1981) ‘Absence of species specificity for mammalian sperm
capacitation in vivo.’, Journal of Reproduction and Fertility, 63(1), pp. 119–23. Available
at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7277310.

Scott, G. (2003) ‘Biología del Desarrollo.’, in Biología del Desarrollo. Ed. Médica.
Massachusetts, p. 881.

Shi kai, J. and Wan xi, Y. (2016) ‘Factors and pathways involved in capacitation : how are they
regulated ?’, Oncotarget, 8(2), pp. 3600–627.

Shih, Y. fu et al. (2016) ‘Effects of Synthetic Serum Supplementation in Sperm Preparation

Media on Sperm Capacitation and Function Test Results.’, Oxidative Medicine and
Cellular Longevity. Hindawi Publishing Corporation, 2016, pp. 1–8. doi:
10.1155/2016/1027158.

Silva, K. M. G. et al. (2009) ‘Efeito da adição de trolox e pentoxifilina na motilidade, integridade

do acrossoma e do DNA de espermatozoides equinos após descongelação.’, Arquivo
Brasileiro de Medicina Veterinaria e Zootecnia, 61(1), pp. 42–49. doi: 10.1590/S0102-
09352009000100007.

Silva Machorro, M. G. (2012) ‘Manejo anestésico en reproducción asistida.’, Anestesiología en

Ginecoobstetricia, 35, pp. 87–92.

Sluder, G. (2016) ‘Using sea urchin gametes and zygotes to investigate centrosome duplication.’,
Cilia, 5, pp. 1–5.

Špaleková, E. et al. (2011) ‘Effect of caffeine on parameters of ram sperm motility’, Slovak
Journal of Animal Science, 44(2), pp. 78–83. Available at:
http://www.vuzv.sk/slju/11_2/SJAS-2-2011-78-83.pdf.
 100

La Spina, F. A. et al. (2016) ‘Mouse sperm begin to undergo acrosomal exocytosis in the upper
isthmus of the oviduct.’, Developmental Biology, 411(2), pp. 172–82. doi:
10.1016/j.ydbio.2016.02.006.

Stauss, C. R., Votta, T. J. and Suarez, S. (1995) ‘Sperm motility hyperactivation facilitates
penetration of the hamster zona pellucida.’, Biology of Reproduction, 53(6), pp. 1280–5.
Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8562682.

Stefanovich, V. (1973) ‘Effect of 3,7-dimethyl-1-(5-oxo-hexyl)xanthine and 1-hexyl-3,7-

dimethyl xanthine on cyclic AMP phosphodiesterase of the human umbilical cord vessels.’,
Research Communications in Chemical Pathology and Pharmacology, 5(3), pp. 655–62.
Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4349608.

Storey, B. T. et al. (1984) ‘Binding of mouse spermatozoa to the zonae pellucidae of mouse eggs
in cumulus: evidence that the acrosomes remain substantially intact.’, Biology of
Reproduction, 31(5), pp. 1119–28.

Suarez, S. et al. (1991) ‘Evidence for the function of hyperactivated motility in sperm.’, Biology
of Reproduction, 44(2), pp. 375–81. Available at:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2009336.

Suarez, S. (2008) ‘Control of hyperactivation in sperm.’, Human Reproduction Update, 14(6),

pp. 647–57. doi: 10.1093/humupd/dmn029.

Suarez, S., Varosi, S. and Dai, X. (1993) ‘Intracellular calcium increases with hyperactivation in
intact, moving hamster sperm and oscillates with the flagellar beat cycle.’, Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America, 90(10), pp. 4660–4.
Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8506314.

Suzuki (1990) ‘Morphological aspects of sperm maturation.’, in Bavister, C. y R. (ed.)

Fertilization in mammals. Serono Sym. Norwell, U.S.A, pp. 65–75.

Szollosi, D. and Hunter, R. H. (1973) ‘Ultrastructural aspects of fertilization in the domestic pig:
sperm penetration and pronucleus formation.’, Journal of Anatomy, 116(2), pp. 181–206.
Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4783415.

Thibier, M. (2001) ‘Identified and unidentified challenges for reproductive biotechnologies

 101

regarding infectious diseases in animal and public health.’, Theriogenology, 9, pp. 1465–
81.

Torres Fuentes, J. L. (2015) ‘Participación de los canales formados por pannexinas en la

fisiología del espermatozoide de ratón.’, pp. 1–200.

Tulsiani, D. (2012) ‘Mechanisms of Mammalian Sperm-Egg Interaction Leading to

Fertilization.’, Gynecology & Obstetrics, 2(5), pp. 2–5. doi: 10.4172/2161-0932.1000e107.

Uto, N. et al. (1988) ‘Zona induced acrosome reaction of hamster spermatozoa.’, The Journal of
Experimental Zoology, 248(1), pp. 113–20. doi: 10.1002/jez.1402480115.

Varner, D., Bowen, J. and Johnson, L. (1993) ‘Effect of heparin on capacitation/acrosome

reaction of equine sperm.’, Archives of Andrology, 31, pp. 199–207.

Vera, O. (2008) ‘Fisiología de los espermatozoides bovinos.’, Desarrollo sostenible de la

ganaderia doble proposito, pp. 495–504. Available at:
http://www.avpa.ula.ve/libro_desarrollosost/pdf/capitulo_40.pdf.

Visconti, P. E. et al. (1995) ‘Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the

capacitation state and protein tyrosine phosphorylation.’, Development (Cambridge,
England), 121(4), pp. 1129–37. Available at:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7743926.

Visconti, P. E. et al. (2011) ‘Ion channels , phosphorylation and mammalian sperm capacitation.’,
Asian Journal of Andrology, 13(March), pp. 395–405. doi: 10.1038/aja.2010.69.

Vredenburgh Wilberg, W. L. and Parrish, J. J. (1995) ‘Intracellular pH of bovine sperm increases

during capacitation.’, Molecular Reproduction and Development, 40(4), pp. 490–502. doi:
10.1002/mrd.1080400413.

Waremkraut, M. (2017) Uso del ionósfro de calcio A23187 en espermatozoides criopreservados

para aumentar la producción in vitro de embriones bovinos.

Wilde, O., De la vega, A. and Parra, R. (1990) ‘Respuesta de semen descongelado en diluyentes
descafeinados.’, Revista Agron N.O, 15, pp. 65–83.

Yanagimachi, R. (1994) ‘Mammalian fertilization.’, in E. Knobil and J. Neill (ed.) Physiology of

 102

Reproduction. Raven Pres. New York, pp. 189–317.

Yanagimachi, R. (2012) ‘Fertilization studies and assisted fertilization in mammals: their

development and future.’, The Journal of Reproduction and development, 58, pp. 25–32.

Yanagimachi, R. and Chang, M. C. (1963) ‘Fertilization of Hamster Eggs in vitro.’, Nature,

200(4903), pp. 281–282. doi: 10.1038/200281b0.

Yang, X., Jiang, S. and Foote, R. (1993) ‘Bovine oocyte development following different oocyte
maturation and sperm capacitation procedures.’, Molecular Reproduction and
Development, 1, pp. 94–100.

Yovich, J. L. (1993) ‘Pentoxifylline: actions and applications in assisted reproduction.’, Human

Reproduction (Oxford, England), 8(11), pp. 1786–91. Available at:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8288739.

Zamora Matlalcuatzi, J. (2013) ‘Espermatogénesis.’, in Biología del Desarrollo. Tlaxcala,

México.

Zeng, Y., Oberdorf, J. A. and Florman, H. M. (1996) ‘pH regulation in mouse sperm:
identification of Na(+)-, Cl(-)-, and HCO3(-)-dependent and arylaminobenzoate-dependent
regulatory mechanisms and characterization of their roles in sperm capacitation.’,
Developmental Biology, 173(2), pp. 510–20. Available at:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8606009.

Zhao, L. et al. (2007) ‘Complexin I is required for mammalian sperm acrosomal exocytosis.’,
Developmental biology, 309(2), pp. 236–44. doi: 10.1016/j.ydbio.2007.07.009.
 103

Anexos

Anexo 1.
Medios utilizados y sus componentes
MEDIOS COMPONENTES

TCM-199 (Tissue Culture Medium-199-

Medio de mesada TCM- 199 Hank's Hank´s), 3 mg/ml BSA, 10 μg/ml
Working Medium WM
Gentamicina, 50 μl/ml Suero Fetal Bovino
SFB
TCM-199 (Tissue Culture Medium-199-
Medio de Maduración TCM 199 Earle's Earl´s), 1,1 mg/ml Na-piruvato, 100 μg/ml
Gentamicina, 1 mg/ml Glutamina, 10 % SFB,
100 UI rhFSH (Puregón, Organon, Ca, USA)

Agua de transferencia embrionaria, 6,3 mg/ml

NaCl, 536 μg/ml KCl, 40 μg/ml KH2PO4, 2,1
mg/ml NaHCO3, 65 μg/ml Penicilina, 55
Medio de Fecundación IVF-SOF μg/ml Na-piruvato, 8 mg/ml BSA (libre de
ácidos grasos), 90 μg/ml Fructosa, 252 μg/ml
CaCl2.(2H2O), 0,23 Na-lactato (60 % syrup),
10 μl/ml aminoácidos MEM.

Agua de transferencia embrionaria, 5,8 mg/ml

NaCl, 2,19 mg/ml NaHCO3, 2,39 mg/ml
HEPES, 40 μg/ml Na2HPO4, 4 μl/ml Na-
Medio H-TALP
lactato (60 % syrup), 310 μg/ml
MgCl2.(6H2O), 384 μg/ml CaCl2.(2H2O),
0.11 μg/ml Na-piruvato, 1 μl/ml Gentamicina.