UNIVERSIDAD NACIONAL JOSE FAUSTINO SANCHEZ CARRION

FACULTAD DE INGENIERÍA AGRARIA INDUSTRIAS

ALIMENTARIAS Y AMBIENTAL

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AMBIENTAL

ESPECTROFOTOMETRÍA- COLORIMETRÍA
CURSO: BIOQUÍMICA

CICLO: IV

SEMESTRE ACADÉMICO: 2019 – I

MESA: N° 3 / 2:30- 4:00 PM

FECHA DE ENTREGA: 06/06/2019

DOCENTE: Q.F. SOLANO TIMOTEO, María Luisa Socorro

INTEGRANTES:

 CAMPOS JOAQUIN, Carlos Alberto

 CARHUAS JAVIER, Neyver Ciro
 CASTILLO HUAMÁN, Yajaira Elda
 CHIPANA UGARTA, Othina Ximena Pía
 BARRERA ORIUNDO, Ricardo Junior
 FLORES SOTO, Lizet Fiorella
 PONCE BUSTAMANTE, Benhurth
 ROSALES MUÑOZ, Valentina Nayeli
HUACHO – PERÚ

2019
 I. TÍTULO: Espectrofotometría- Colorimetría
II. OBJETIVOS:
 Determinar fotométricamente la concentración de una sustancia problema.
 Alcanzar el punto máximo de la absorbancia, según su longitud de onda.
 Adquirir conocimiento sobre el uso del espectrómetro.
III. PARTE EPERIMENTAL
3.1. MATERIALES Y SUSTANCIAS
Gradilla
Tubos de ensayo
Pipetas
Vaso precipitado
Pizas
Espectrofotómetro

PANTALLA COMPARTIMIENTO
DE MUESTRAS

TECLAS DE
CONTACTO

TECLADO

RANURA PARA
TARJETAS

Fig. 01: Espectrofotómetro

MUESTRAS
Agua destilada
Permanganato de potasio al 0.4N

pág. 2
3.2. PROCEDIMIENTO
Este practica se ha realizado en dos fases en la primera el procedimiento consistió
en primera instancia en la obtención del punto máximo de la absorbancia esto lo
haremos de la siguiente manera:
1. Diluirá 1 ml permanganato de potasio (KMnO4) en 9ml de agua destilada
2. En el espectrofotómetro colocaremos en la celda cero el agua destilada y en la celda
número 01 se disolución del KMnO4
3. Antes de introducir las celdas al espectrofotómetro debemos limpiarlos con
papel higiénico para evitar una mala lectura por la grasa de las manos dejada
en las celdas
4. Esperamos que el espectrofotómetro la absorbancia de cada una de la
longitud de onda.

Como segunda estancia calcularemos la curva espectral este grafica lo

elaboraremos con los siguientes parámetros:

Longitud de onda vs absorbancia

En la segunda fase

1. colocaremos en 6 tubos de ensayo colocaremos las siguientes medidas

respectivamente:

TUBO TUBO TUBO TUBO TUBO TUBO

01 02 03 04 05 06
Sol.KMnO4
1 2 3 4 5 x
0.04%
Agua
9 8 7 6 5 ….
destilada (ml)

4Ttal 10ml 10ml 10ml 10ml 10ml 10ml

pág. 3
 X= añadir al azar una cierta cantidad de KMnO4, este vendría a ser el
tubo problema.

TUBO PROBLEMA

2. Luego cando ya tenemos en cada tubo de ensayo las sustancias agitaremos

cuidadosamente evitando la exposición con la luz.
3. Después llevaremos cada tubo al espectrofotómetro y mediremos su valor de
absorbancia de cada uno como en la fase uno.
4. Ya finiquitando la práctica haremos la respectiva gráfica en la cual
obtendremos la curva estándar la cual nos dará con los siguientes parámetros:

Absorbancia vs la concentración

pág. 4
 IV. CALCULOS
1. VALORES OBTENIDOS DE LA ESPECTROFOMETRIA

El círculo rojo nos indica cual es el máximo valor de

concentración que se obtiene de 520 de longitud de onda
con 0.455 de absorbancia.

2. VALORES OBTENIDOS DE LA ESPECTROFOTOMETRIA Y

COLORIMETRIA

La línea naranja nos

muestra como debe ser la
representación de la
gráfica.

pág. 5
 V. RESULTADOS

0.012
0

VI. DISCUSIÓN

CUADRO DE LA SOLUCIÓN DE CUADRO DE LA SOLUCIÓN DE

KMnO4 al 0.04 % KMnO4 al 0.04 %

LABORATORIO INVESTIGADO

CONCENTRACIÓN CONCENTRACIÓN
TUBO Abs TUBO Abs
[] []

1 0.004 0.852 1 0.024 0

2 0.008 0.981 2 0.048 0

3 0.012 0.958 3 0.072 0.052

4 0.016 1.957 4 0.096 0.167

5 0.020 2.464 5 1.2 0.212

 Para Victor Raul, que utiliza el mismo

porcentaje de KMnO4 sus resultados son diferentes. Nos dice que la práctica dará un
resultado dependiendo del estado delos materiales y de que tanto de luz haya absorbido
su muestra, a esto llamamos errores sistemáticos; sus datos finales son en forma
creciente esto indica que no hubo alteración en sus soluciones y su grafica saldría lineal.
Por el contrario, nuestro resultado fue diferente debido a algunas alteraciones de nuestra
KMnO4

pág. 6
VII. CUESTIONARIO
1. Detalle Ud. algunos parámetros referentes al método empleado en el
desarrollo de la práctica.
 Longitud de onda (λ): distancia recorrida por un ciclo completo. De cresta a cresta
de la onda.
 Absorbancia: Se trata de la medida que refleja cómo se atenúa la radiación cuando
atraviesa un elemento.
 Tramitancia (T): fracción de radiación incidente transmitida por la disolución. Si
la potencia radiante que incide sobre la disolución es P0 Y P la potencia radiante
que sale.

𝑃
𝑇=
𝑃0

 Coeficiente de extinción (e): Es un parámetro que defina cuan fuertemente una

sustancia absorbe la luz a una longitud de onda por unidad de masa o por
concentración molar, respectivamente.
 Concentración de la muestra(c):
Parámetros de calidad. La calidad de una técnica espectrofotométrica expresada en
términos de incertidumbre, se basa esencialmente en tres parámetros: sensibilidad,
límite de detección y rango de linealidad.

a) Sensibilidad: Es la concentración requerida para dar un 1% de absorbancia (99% de

transmitancia o lo que es lo mismo 0,0044 unidades de absorbancia. A medida que esta
concentración es menor, la sensibilidad de la técnica es mayor porque es necesaria menos
concentración para producir para producir una señal en el detector.

b) Límite de detección: Es la mínima concentración que se puede medir con la técnica y

con un elevado nivel de certidumbre. Está relacionado con el ruido de fondo del aparato,
es decir, la señal que mide el aparato cuando se introduce un blanco. Una manera de
calcularlo es multiplicar por tres la señal correspondiente al ruido de fondo.

c) Rango de linealidad: Es el intervalo de concentraciones dentro del cual podemos medir

una muestra problema con un elevado nivel de certidumbre. Generalmente a partir del valor
máximo de este rango, la señal (absorbancia) deja de tener una relación lineal con la
concentración y la curva se hacer horizontal, tendiendo a un valor máximo de absorbancia.

pág. 7
Las muestras o patrones que están fuera de ese rango no se pueden medir con
seguridad con la técnica empleada.

2. Construya la curva espectral para la solución de Permanganato de Potasio.

(Papel milimetrado).

CURVA ESPECTRAL DEL KMnO4

500
450
400
350
300
Abs

250
200
150
100
50
0
0 100 200 300 400 500 600 700 800
λ (Longitud de onda)

λ Abs *10-3
400 45
420 2
440 37
460 60
480 142
500 287
520 455
540 448
560 278
580 121
600 37
620 40
640 27
660 13
680 19
700 34

pág. 8
pág. 9
3. Construya una curva estándar con los datos obtenidos en la
experiencia(B) y luego plotee el valor para la muestra problema cuya
concentración se desconoce (tubo 6).

TUBO [] Abs *10-3

1 0,004 852
2 0,008 981
3 0,012 1479
4 0,016 1957
5 0,020 2464
6 0,009 1226

CURVA ESTANDAR DEL KMnO4

3000

2500

2000

1500

1000

500

0
0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025

El valor obtenido mediante proporcionalidad es [ ] = 0.009 a 0.010

0.020………………………2464
X ………………………1226

𝑋 = 0.009

0.016………………………1957
X ………………………1226

𝑋 = 0.010

pág. 10
4. Que conclusiones ha obtenido en la práctica.
El espectrofotómetro obtuvo resultados con alta calidad la cual se ve reflejada
en la cantidad de prismas presentes en el equipo.
Se identificó la muestra con mayor longitud de onda
Reconocimos lo fácil que es variar una muestra en el espectrofotómetro ya sea por la
luz del ambiente, sudor o grasa de las manos o cantidad de solución agregada.
5. A que se llama longitud de onda
La longitud de onda de una onda describe cuán larga es la onda. La distancia existente
entre dos crestas o valles consecutivos es lo que llamamos longitud de onda. Las ondas
de agua en el océano, las ondas de aire, y las ondas de radiación electromagnética tienen
longitudes de ondas.
6. Si el rayo de luz utilizada tiene ؏, como es la Eº en la zona UV, y en la zona
infrarrojo en relación a la zona visible.
El coeficiente de extinción ɛ es específica de cada cromóforo. Como A es adimensional,
las dimensiones de ɛ dependen de c y l. La ley de Lambert-Beer se cumple para
soluciones diluidas; para valores de c altos, ɛ varía con la concentración debido a
fenómenos de dispersión de la luz, agregación molecular, cambios demedio, etc.

El espectro de absorción es una representación gráfica que indica la cantidad de luz

absorbida ɛ a diferentes valores de la longitud de onda (λ).

La región UV es una región de energía muy alta. Los compuestos con dobles enlaces
aislados, triples enlaces, enlaces peptídicos, sistemas aromáticos, grupos carbonilos y
otros heteroátomos tienen su máxima absorbancia en la región UV, por lo que esta es
muy importante para la determinación cualitativa y cuantitativa de compuestos
orgánicos.

En la región visible apreciamos el color visible de una solución y que corresponde a las
longitudes de onda de luz que transmite, no que absorbe. El color que absorbe es el
complementario del color que transmite. Por tanto, para realizar mediciones de absorción
es necesario utilizar la longitud de onda en la que absorbe luz la solución coloreada. Aquí
la energía es menor que en la región UV.

Y en la zona infrarroja la energía suele ser mucho menor que en la región UV y en la región
visible, pero la longitud de onda es mayor.

pág. 11
 7. Factores que alteran la actividad enzimática.
Efecto del pH
Las enzimas actúan dentro de límites estrechos de pH (pH óptimo de la reacción). Por
ejemplo, la pepsina (enzima estomacal) tiene un pH óptimo de 2, al graficar su actividad
enzimática para valores crecientes de pH, comenzando desde la zona ácida, se obtiene
una curva en forma de campana.
Temperatura
La velocidad de las reacciones enzimáticas aumenta, por lo general, con la temperatura,
dentro del intervalo en que la enzima es estable y activa.
Concentración de sustrato
Principalmente, la velocidad de la reacción o catálisis varía de acuerdo a la
concentración del sustrato.

VIII. CONCLUSIÓN
 El espectro de absorción del colorante asignado muestra una creciente al comenzar
porque la concentración es muy parecida a la del blanco, entonces comienza a
separarse poco a poco del rango inicial y alcanza su punto máximo de absorbancia,
para así, entonces, permitir asegurar que la concentración es la que juega el papel más
importante dentro de la solución, puesto que si tiene muy poca, va a ser una
absorbancia baja, porque “se absorben aquellas frecuencias que son capaces de
producir excitación electrónica”, pero luego desciende debido a que ya no existe un
equilibrio en la solución que le permita al colorante absorber la intensidad incidente
optimizando la transmitancia mucho más que la absorbancia.
 La absorbancia es la capacidad que tiene algunos compuestos para absorber la
radiación electromagnética, pudimos observar cómo, dependiendo de la concentración
y la longitud a la cual se le aplique un rayo, puede alcanzar un punto máximo de
absorción.
 Según esto la longitud y la absorbancia son proporcionales hasta alcanzar el punto
máximo y de allí empieza a descender.
 Según la concentración varia la absorbancia del compuesto. Variando la cantidad de
solvente (Siendo agua destilada) se puede disminuir la absorbancia.

IX. COMENTARIOS

pág. 12
 Los resultados pueden variar al tener al tener los reactivos químicos
guardados por mucho tiempo, dado que las partículas se pueden
solidificar y a la vez asentar en el fondo del recipiente, lo recomendable es tener
los reactivos recientemente preparados.
 Mesclar mucho una sustancia o como no mezclarla puede variar en los
resultados finales, la sustancia debe estar homogénea para un buen resultado en
la práctica.
 Al usar un reactivo hay que agitar el envase que lo contiene para que este
homogéneo y no solo usar la parte sobrenadante.
 Las celdas deben ser de cuarzo mas no de plástico para que pueda arrojar buenos
resultados.

pág. 13
X. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Llantoy, V. P. (2009). CURVA ESPECTRAL Y LEY DE BEER. Lima:
MAD.
Cano, J. P. (2011). Espectrofotomertría. Medellín: REVERTÉ S.A.

Murillo, Y. S., Giraldo, L., & Moreno, J. C. (2011). Determinación de la cinética de

adsorción de 2, 4-dinitrofenol en carbonizado de hueso bovino por espectrofotometría uv-
vis. Revista colombiana de química, 40(1).

Cáñez-Carrasco, M. G., & García-Alegría, A. M. (2015). VALIDACIÓN DE UN

MÉTODO ANALÍTICO PARA LA DETERMINACIÓN DE FÓSFORO POR
ESPECTROFOTOMETRÍA ULTRAVIOLETA-VISIBLE/VALIDATION OF AN
ANALYTICAL METHOD FOR UV-VISIBLE SPECTROPHOTOMETRIC
PHOSPHORUS DETERMINATION. Biotecnia, 17(1), 32-39.

Oliveros-Bastidas, A. D. J., Carrera, C. A., & Marín, D. (2009). Estudio por

espectrofotometría Uv-Vis de la reacción entre los iones cianuro y picrato. Un ejemplo
práctico de aplicaciones analíticas y estudios cinéticos. Revista Colombiana de
Química, 38(1), 61-82.

pág. 14