Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
Facultad de Ciencias
Escuela de Química
Laboratorio de Instrumental Analítico
Profesor: Estudiante:
18363473
Objetivos
General:
• Determinar el contenido de ácido ascórbico en un jarabe de vitamina C usando la técnica
de cromatografía de líquidos de alta eficiencia (HPLC).
Específicos:
• Adiestramiento en el manejo de equipos de cromatografía líquida de alta eficiencia.
• Aplicar el tratamiento adecuado de los solventes y muestra: filtración y desgasificación de
los mismos.
• Ajustar los parámetros instrumentales, que permitan obtener una buena separación de
los picos en la muestra de vitamina C.
• Analizar cuantitativamente el contenido de ácido ascórbico mediante el uso de curva de
calibración externa (CCE).
• Determinar la precisión del análisis.
METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
Equipo
El equipo de cromatografía que se encuentra en el laboratorio de Instrumental analítico
tiene las siguientes características:
Cromatógrafo de líquidos de alta eficiencia, marca Jasco Modelo L6-2080-02 Terniary
gradient, Bomba Jasco PU-2080 plus HPLC, Desgasificador Populaire.
Detector: UV/Vis – 2075 plus (Fotomultiplicador)
Jeringa: Tipo Hamilton, apreciación: 2 μL
Columna de acero Inoxidable (fase estacionaria: C18); Longitud: 250 mm; Diámetro
interno: 4.6 mm; y Tamaño de partícula del soporte: 5 μm.
Tabla # 1:
Patrón Alícuota (mL) Enrase(±0,04) Concentración
(mL) final (ppm)
1 (1,76±0,008) 25,00 (15,1±0,2)
2 (2,34±0,010) 25,00 (20,0±0,3)
3 (3,00±0,012) 25,00 (25,7±0,4)
4 (4,00±0,015) 25,00 (34,2±0,5)
2. Preparación de la muestra:
Inyector: Bucle de 10 µL
λ: 265 nm
Los primeros dos picos corresponden a λ=254nm y los siguientes dos a λ=265nm.
Se selecciono como longitud de onda de trabajo λ=265nm, ya que fue la longitud de onda
donde se obtuvo mejor resolución en los picos y mayores alturas y áreas.
En la cromatografía en fase inversa, como es éste caso, la fase estacionaria es no
polar, con frecuencia se trata de un hidrocarburo, y la fase móvil es relativamente polar. En
cromatografía en fase normal, el componente menos polar se eluye primero, debido a que
relativamente es el mas soluble en la fase móvil y un aumento de la polaridad de la fase
móvil provoca una disminución del tiempo de elución. Por contraste, en los métodos en
fase inversa, los componentes más polares aparecen primero, y un aumento de la
polaridad de la fase móvil aumenta el tiempo de elución.
Los rellenos de fase unida químicamente se clasifican como de fase inversa cuando
el recubrimiento enlazado tiene un carácter no polar, y de fase normal cuando el
recubrimiento contiene grupos funcionales polares. Por lo general, el grupo R del siloxano
en estos recubrimientos es una cadena C8 (n-octilo) o una cadena C18 (n-octadecilo)- en
este caso el recubrimiento es de C18-. En esta fase, los grupos de hidrocarburo de cadena
larga se alinean el uno junto al otro y en perpendicular a la superficie de la partícula, dando
una estructura semejante a una brocha o a un cepillo. Hasta el momento no está
completamente esclarecido el mecanismo por el cual estas superficies retienen a los
solutos.
Algunos científicos ven en el recubrimiento en forma de brocha una superficie
modificada en la que tiene lugar una adsorción física. Las moléculas de la fase móvil
compiten entonces con las del analito por una posición en la superficie orgánica.
Se escogió como fase móvil una solución de KH2PO4 al 0,5% p/v la cual es polar.
(*)Los picos 1 al 4 corresponden al patrón 1(se descarto el pico 1 por tener menor área en comparación con
los demás); los picos 5 al 7 corresponden al patrón 2, los picos 8 al 10 corresponden al patrón 3 y los picos
11 al 15 corresponden al patrón 4( se descartaron los picos 11 y 12 por estar solapados).
Tabla II. Medición de la curva de calibración para la determinación de ácido ascórbico por
el método de CCE.
P2 (20,0±0,3) 74306,03333
P3 (25,7±0,4) 294895,2
P4 (34,2±0,5) 294895,2
Tabla III. Pesos de alícuotas de jarabe empleados para la preparación de las soluciones
madres y diluidas de la muestra real de ácido ascórbico.
0,3871(m1) 100,00
0,3553 (m2) 100,00
0,3549 (m3) 100,00
Gráfico 5. Cromatograma de la muestra m1 diluida 0,40 en 25ml para la
determinación de ácido ascórbico.
Nota: se utilizaron las muestras sin diluir para determinar la concentración de acido
ascórbico, ya que las muestras diluidas arrojaron muchos picos irregulares por la baja
concentración y rápida degradación de dicho acido.
CV 12,5%
LC (95%) (32 ± 7)
La concentración de acido ascórbico reportada en el frasco de jarabe era: 100 mg de AA
por cada 5ml de jarabe, es decir, aproximadamente 20mg/ml y la concentración obtenida
fue 0,032mg/ml de AA. Dando un rendimiento de 0,16%.
Con una solución de (214±2) mg/L de ácido ascórbico y teniendo en cuenta que el
analito es una vitamina sensible a la degradación por cambios de temperatura y radiación,
se preparó el mismo día patrones frescos, los cuales se sometieron al análisis en las
mismas condiciones de operación (siempre el mismo operador, condiciones del equipo y
en pequeños intervalos de tiempo). Las réplicas de muestra ya disuelta y la solución
madre (214 ppm) se almacenaron en balones aforados protegidos de la luz y refrigerados
en baño de hielo para procurar la mínima degradación y pérdida del analito. A pesar de
ello en algunos cromatogramas se observa la aparición de un hombro en el pico del ácido
ascórbico, lo cual implica una degradación del ácido a productos intermediarios.