Specializarea : Sisteme avansate de procesare si controlul calității produselor

agro-alimentare

Tehnici avansate de analiză și expertizare a

produselor agro-alimentare în vederea creșterii
siguranței alimentare

Profesor coordonator,
Dr. Chim. Niculaua Marius
Student,
Chirilă Ioana
 Teste rapide pentru expertizare şi
control (colorimetrie,afinitate
alergeni/toxine, micro-fluidică, lab-on-a-
chip)
 INTRODUCERE

Consumul de alimente sigure și nutritive este o necesitate fundamentală și o condiție

prealabilă pentru menținerea sănătății fizice și mentale a ființelor umane.
Siguranța alimentară rămâne una dintre cele mai importante probleme la nivel mondial, parțial
datorită complexității din ce în ce mai mari a sistemelor alimentare care agravează provocările
în asigurarea siguranței alimentare. Chiar și pentru Statele Unite, care a stabilit unul dintre
cele mai bune sisteme de siguranță alimentară din lume, a fost estimat de către Centrele
pentru Controlul și Prevenirea Bolilor că aproximativ 48 de milioane de oameni suferă de boli
alimentare pe an, provocând 128.000 de spitalizări și
3000 decese.
Cu toate acestea, s-au făcut eforturi mari pentru a îmbunătăți abordarea sistematică a
siguranței alimentare. Monitorizarea produselor agroalimentare prin întregul lanț al sistemului
alimentar, inclusiv detectarea pericolelor alimentare potențiale, este considerată ca un aspect-
cheie al acestei abordări.

Produsul alimentar este constituit dintr-un complex de substanteorganice si

anorganice, care nu contine numai substante necesareorganismului uman (nutritive), ci si
substante indiferente, iar in unele cazurichiar substante antinutritionale.
Progresul in stiintele implicate in nutritia omului si progreselestiintifice si tehnice din
domeniul productiei bunurilor alimentare pun inprim plan exigentele 'pietei metabolice' a
organismului omenesc in raportcu piata economica. In fapt este vorba de un complex de
factori socioeconomicicare au favorizat acest proces, astfel incat proiectarea si realizarea
alimentelor sa se bazeze pe exigentele prioritare ale metabolismului corpuluiomenesc in
conditiile unei legaturi cat mai convenabile, de ordin subiectiv siobiectiv, intre om si aliment,
respectand totodata legile si mecanismeleeconomiei de piata.
Printre primele preocupari privind valoare nutritiva, identificate inliteratura de specialitate, se
semnaleaza preluarea si evaluarea, in cadrul Departamentului Agriculturii al SUA, a unor date
asupra valorii nutritive aproduselor alimentare de catre W.O. Atwater in anul 1890,
transformateintr-o publicatie aparuta sub titlul 'Compozitia chimica a materialeloralimentare
americane”, constituind cap de serie, perpetuata pana in1 Composittion of Food (by
Consummer and Foods Economics Institute), USDA, 1976-1981prezent. In ultimele 3-4
decenii ale secolului nostru au aparut publicatiiasemanatoare in Germania, CSI si alte tari,
inclusiv in Romania.
Pentru un produs alimentar, valoarea nutritiva, respectiv substantelenutritive pe care le
furnizeaza organismului uman, intr-o proportie mai maresi mai usor asimilabila, constituie
criteriu major in aprecierea calitatii.
Elementele structurale ale unei expertize merceologicein domeniul marfurilor
alimentare
Notiunea de "expertiza" deriva de la cuvantul latinesc "experior"(a incerca, a proba) si are
semnificatia activitatii de cercetare a uneiprobleme de catre un specialist intr-un anumit
domeniu, constatarile sauopiniile lui avand scopul de a elucida unele chestiuni in fata unor
instantejudiciare sau in fata partenerilor unui contract economic (pentru speteleextrajudiciare).
Expertiza reprezinta, deci, acel mijloc de proba prin care, in bazaunei cercetari metodice,
folosind procedee stiintifice, expertul aduce lacunostinta instantei care l-a imputernicit
concluzii motivate stiintific cuprivire la faptele pentru a caror elucidare sunt necesare
cunostinte specializate.
Metodologia moderna de expertizare a calitatiimarfurilor alimentare
In industria alimentara, cuantificarea caracteristicilor de calitate amarfurilor fabricate este
indispensabila in aplicarea unui program de controlal calitatii. Rezultatele evaluarii senzoriale
- ca procedura stiintifica deapreciere a proprietatilor organoleptice ale alimentului - sunt
corelate cudatele furnizate de catre laboratoare si obtinute in urma testelor de naturafizica,
chimica, fizico-chimica, microbiologica, microanalitica si histologica.

Analizele chimice clasice, desideosebit de importante, prezinta o serie de neajunsuri, care, de

multeori, le fac inaplicabile pentru urmarirea desfasurarii unor procese tehnologice.
Dintre acestea mentionam timpul relative mare necesar efectuarii unei analize chimice,
dificultatile legate de izolarea componentilor de analizat, in special cand acestea se gasesc in
concentratii mici, utilizarea unor operatii adesea complicate, sensibilitatea relative.
Metodele fizico-chimice de analiza inlatura, in mare masura, dificultatile mentionate mai sus.
Totodata, aceste metode pot fi adaptate pentru masurarea continua a concentratiei
substantelor, fapt care permite folosirealor in schemele de automatizare a proceselor
tehnologice.
 TESTE RAPIDE PENTRU EXPERTIZĂ ȘI CONTROL

I. METODA COLORIMETRICA

Dintre toate metodele optice, colorimetria este cea mai raspandita in practica analitica.
Principiul metodei
Cu ajutorul unor reactii chimice se trece substanta care se analizeaza intr-un compus colorat.
Se compara intensitatea culorii obtinute cu aceea a unei solutii care contine acelasi compus
colorat de concentratie perfect cunoscuta.
Reactiile folosite in colorimetrie trebuie sa indeplineasca urmatoarele conditii:
1. Culoarea care apare in urma reactiei chimice trebuiesa fie specifica substantei care se
determina.
2. Culoarea solutiei nu trebuie sa varieze in timp si nici in sa depinda de variatii mici ale ph-
ului, ale temperaturii si concentratiei reactivilor folositi.
3. Reactia trebuiesa fie foarte sensibila, adica variatia culorii solutiei sa fie sesizata chiar in
cazul cantitatilor foarte mici din substanta care se analizeaza.
Metodele folosite in colorimetrie sunt urmatoarele:
- metode vizuale: variatia intensitatii culorii se aprecieaza vizual;
- metode fotocolorimetrice: variatia intensitatii culorii se masoara cu ajutorul celulelor
fotoelectice. Concentratia probei este indicate direct de acul unui instrument de masura.

Determinarea culorii
Apa pură este incoloră în strat subţire şi albastru-verzuie in strat gros. Culori diferite
ale apei naturale pot proveni din suspensii anorganice (praf, pământ, nisip), de la materia
organică dizolvată sau aflată fin dispersată sau de la ionii de fier şi de mangan.
Culoarea apelor uzate este direct influenţată de procesele din care au rezultat, ca urmare a
suspensiilor şi a substanţelor dizolvate. Substanţele în suspensie dau culoarea aparentă a apei,
iar cele dizolvate îi conferă culoarea reală.
Evaluarea culorii apei se face printr-o tehnică vizuală de comparare cu un standard; o unitate
de culoare este echivalentă cu 1 mg/L de platină sub formă de ion cloroplatinat, într-o soluţie
care mai conţine cobalt cu concentraţia jumătate din cea a ionului de platină. Această unitate
de evaluare a culorii se numeşte unitate Hazen. O altă metodă bazată pe etaloane de culoare
este metoda dicromat-cobalt care utilizează ca referinţă soluţii acide, cu diverse concentraţii
conţinând dicromat de potasiu, K2Cr2O7 şi sulfat de cobalt, CoSO4 .7H2O într-un raport
constant.
Filtrarea prealabilă a probei nu este recomandată în acest caz. Evaluarea exactă a culorii
(lungimea de undă sau frecvenţa) se poate face utilizând un spectrofotometru.
Această tehnică presupune parcurgerea unui domeniu de lungimi de undă cuprins între 400 şi
700 nm (domeniu vizibil) şi stabilirea unui număr de 10 până la 30 de puncte de referinţă
(funcţie de acurateţea măsurătorii).
O metodă mai simplă dar acceptată este aceea de măsurare a absorbanţei unei probe
filtrate (prin hârtie cu pori de 0,45 μm) atunci când este iradiată cu o radiaţie cu lungimea de
undă de 400 nm. Rezultatul poate fi echivalat cu unităţile Hazen (pe baza unei curbe de
calibrare).
1.1.Metoda calitativă de determinare a culorii
Se bazează pe compararea culorii apei de analizat cu culoarea apei bidistilate.
Experimental, într-un tub colorimetric se introduce proba de apă de analizat, iar în alt tub,
identic cu primul, se introduce apa bidistilată. Se compară culoarea probei de apă faţă de apa
bidistilată, privind pe verticală, pe un fond alb. Se notează culoarea observată a probei de apă
comparativ cu apa bidistilată (galben, galben-verzui etc.).
Metode cantitative de determinare a culorii
Principiul metodei: Se compară coloraţia probei de analizat cu cea corespunzătoare unei scări
colorimetrice din soluţie de platină-cobalt sau dicromat-cobalt. Analiza este efectuată conform
standardului SR EN ISO 7887:2002.
1.1.1. Metoda cu platino-cobalt
Reactivi:
 hexacloroplatinat de potasiu, K2[PtCl6];
 clorură cobaltoasă hexahidratată, CoCl2 . 6H2O;
 acid clorhidric concentrat,
Modul de lucru: Soluţie stoc echivalentă a 500 unităţi Hazen se prepară prin dizolvarea a
1,246 g hexacloroplatinat de potasiu şi 1 g de clorură cobaltoasă hexahidratată în 500 mL de
apă distilată, se adaugă 100 mL acid clorhidric concentrat şi se diluează la 1 L de soluţie.
Culoarea acestei soluţii corespunde la 500 grade de culoare. Soluţia se poate păstra, la rece şi
la întuneric, timp de 1 an. Se prepară apoi în tuburi de 50 mL mostre care acoperă un interval
de 5 până la 200 unităţi Hazen şi se utilizează ca etaloane de comparare.
Se iau 100 mL din apa de analizat şi se introduc într-un tub colorimetric, se compară culoarea
cu o scară de etalonare preparată după schema prezentată în Tabelul 1.

Tabel 1. Determinarea gradelor de culoare

Dacă apa are turbiditatea mai mare de 1 NTU (formazină) se recomandă filtrarea probei
înaintea determinărilor de culoare. Apele tulburi se lasă să sedimenteze sau se centrifughează
înaintea determinării. Din apa de analizat se iau 100 cm3, într-o eprubetă colorimetrică
identică cu cea folosită pentru scara etalon, şi se compară culoarea privind vertical. Coloraţia
apelor se exprimă în grade de culoare, prin grad de culoare înţelegându-se coloraţia produsă în
cazul unei soluţii care conţine 1 mg platină, sub formă de ion cloroplatinat (PtCl5) 2- , la litru.
Se consideră că o apă este corespunzătoare pentru consum dacă nu depăşeşte 20 grade de
culoare.
 1.2.Metoda cu dicromat-cobalt
Reactivi:
 dicromat de potasiu K2Cr2O7, (uscat în prealabil 24 de ore, la 105 ˚C şi apoi ţinut în
exicator);
 sulfat de cobalt (CoSO47H2O);
 H2SO4 concentrat.
Modul de lucru:
Soluția I: se dizolvă în câţiva mL de apă bidistilată a 0,0875 g dicromat de potasiu şi 2 g
sulfat de cobalt într-un balon cotat de 1 litru. Se adaugă 1 mL H2SO4 concentrat şi se
completează la semn cu apă bidistilată.
Soluția II: se introduc într-un balon cotat de 1 litru aproximativ 500 mL apă bidistilată şi 1 mL
acid sulfuric concentrat, apoi se completează până la semn cu apă bidistilată. Se iau 100 mL
apă de analizat şi se introduc într-un tub colorimetric. Se compară culoarea cu scara de
etalonare pregătită după indicaţiile din Tabelul 2.

Tabel 2. Scara de etalnoare

Dacă apa de analizat este tulbure, se lasă să se sedimenteze sau se centrifughează înainte de
determinare. Nu se filtrează prin hârtie de filtru, deoarece aceasta are un efect de decolorare
asupra probei.
Sistemele microfluidice pot fi utilizate pentru detectarea rapidă și sensibilă a agenților
patogeni, a toxinelor, a reziduurilor chimice și a metalelor grele în produsele alimentare,
deoarece sunt capabili să efectueze măsurători din cantități mici de fluide complexe cu
eficiență și viteză.
 2. DETERMINAREA AGENȚI PATOGENI ALIMENTARI

Au fost dezvoltate multe dispozitive microfluidice care se concentrează pe

determinarea agenților patogeni alimentari (microorganisme), alergeni, biotoxine, ioni de
metale grele și alte componente chimice care pot fi prezente în alimente (Busa et al., 2016;
Escarpa, 2014; Lopez și colab., 2016).
Boala alimentară provocată de agenții patogeni microbieni afectează sănătatea și siguranța
oamenilor și animalelor din întreaga lume și reprezintă preocuparea principală a celor care se
află în domeniul siguranței alimentare (Zhao, Lin, Wang, & Oh, 2014).

Pentru majoritatea focarelor de boală alimentară (CDC, 2016) sunt responsabile principalele
bacterii patogene principale alimentar Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Escherichia
coli (E. coli), Campylobacter spp., Clostridium perfringens și Staphylococcus aureus.
În prezent, ELISA și PCR sunt cele două metode cele mai utilizate în mod obișnuit de
către industriile clinice și alimentare care detectează agenții patogeni alimentari (Legea, Ab
Mutalib, Chan și Lee, 2015, Zhao și colab., 2014).
Aceste metode necesită, de obicei, cultivarea bacteriilor în laboratoare înalt
specializate și procedurile de testare dure și laborioase, rezultând proceduri consumatoare de
timp și costisitoare. O livrare întârziată a probelor de alimente la laborator poate duce la
pierderea viabilității microorganismelor, ducând la negative false și rapoarte întârziate.
Utilizarea instrumentelor puternice de metode microfluidice pentru detectarea
agenților patogeni alimentari poate depăși aceste dezavantaje.
În general, detectarea agenților patogeni în probele de alimente sau biologice necesită
prepararea probelor înainte de încărcare pe dispozitivele microfluidice pentru analiză. Clime
et al. (2015) a introdus pentru prima dată un cip microfluidic pentru prepararea probelor,
filtrarea și extracția agenților patogeni.
Cipul microfluidic a utilizat focalizarea hidrodinamică și inerțiaefecte migraționale
laterale pentru eliminarea fără membrană a resturilor din probele biologice.
Sun și colab. (2015) a dezvoltat un sistem cu 8 camere de laborator pe cip pentru detectarea
rapidă și cantitativă a Salmonella Spp. în probele de alimente.
Această platformă a fost capabilă să efectueze prepararea probelor pe cip, utilizând bile
magnetice urmate de amplificarea izotermică mediată de buclă (LAMP) pentru detectarea
bacteriilor.
Sistemul a fost capabil să analizeze opt probe de carne de porc îmbogățită cu apă peptonată
tamponată cu salmonella spumată (BPW) în decurs de 40 de minute, cu o limită de detectare
(LOD) de 50 celule pe test.
Tehnologia de separare imunomagnetică (IMS) a fost dezvoltată într-un nanosensor
microfluidic pentru detecția patogena a Salmonella (Kim, Moon, Moh, & Lim, 2015) prin
utilizarea de perle magnetice și puncte cuantice (QDs) ca etichetă fluorescentă.
Ei au demonstrat că filtrarea microfluidică și cipul de extracție ar putea elimina peste 50% din
reziduuri în probele de carne de vită măcinate (pre-filtrate), păstrând în același timp până la
70% din organismele patogene inițiale la ieșirea dispozitivului. După cum sa văzut că
pregătirea probelor pentru matricea complexă de alimente necesită integrarea unor unități mai
funcționale în cipul microfluidic.
Dispozitivele microfluidice centrifuge sunt una dintre cele mai puternice platforme din
domeniul microfluidicii (Kwok et al., 2016;Strohmeier și colab., 2015).
O serie de operațiuni cu unități microfluidice pot fi efectuate pe aceste dispozitive, incluzând
supapa lichidă, pomparea, amestecarea, separarea și altele (Gorkin et al., 2010).
Aparatele microfluidice centrifuge au fost raportate ca fiind utilizate pentru detectarea
patogenului alimentar în multe studii (Sayad et al., 2016; Strohmeier et al., 2014).
 3. DETERMINAREA PESTICIDELOR DIN PRODUSELE ALIMENARE

Termenul de “pesticide” este adesea utilizat ca sinonim cu produsele pentru protecţia

plantelor (plant protection products-PPP), care sunt utilizate, în principal, în agricultura.

Evoluţia tehnicilor de analiză permite detectarea din ce în ce mai uşoară a moleculelor

aflate în cantităţi infinitezimale. Peste 800 de substanţe active sunt formulate în mii de
pesticide, aceste substanţe formând peste 100 de clase chimice dintre care cele mai importante
ar fi: benzoilureati, carbamaţi, compuşi organofosforici (OP), organocloruraţi (OC), piretroizi
(PYR), sulfonilureaţi, triazine, ditiocarbamaţi , azoli, fenoxi acizi.

Proprietăţile lor fizice şi chimice diferă foarte mult , fapt pentru care determinarea
reziduurilor acestor pesticide devine destul de dificilă din orice matrice şi cauzează probleme
în dezvoltarea unei metode ˝universale˝ de determinare analitică a reziduurilor, ceea ce ar fi
cel mai dorit lucru.

A) EXTRACŢIA PESTICIDELOR DIN PROBELE DE ANALIZAT

S-a estimat că etapa de pregătire a probelor consumă ,în cele mai multe determinări,
aproximativ 60 – 70% din timpul total necesar pentru analiză. În analize de rutină , aceasta
etapă trebuie să fie în măsură să producă rezultate analitice precise , să fie eficientă din punct
de vedere economic şi în plus, să fie sigură şi uşor de realizat şi să se aplice pentru o mare
varietate de pesticide: organoclorurate, organofosforice, piretroizi, ş.a.

Cele mai multe metode de pregătire a probelor pentru determinarea gaz cromatografică
(GC) şi lichid cromatografică (LC) includ următorii paşi:

1. Proba este omogenizată sau amestecată pentru a obţine o matrice uniformă;

2. Aceasta va fi urmată de extracţia cu solvenţi a reziduurilor de pesticide;

3. O etapa de purificare este necesară uneori pentru a elimina interferenţele componentelor

matricei;

4. Fracţionarea analiţilor extraşi;

5. Concentrarea eluentului şi reconstituirea într-un solvent care este compatibil condiţiilor GC

sau LC. În cele din urmă, soluţia care conţine pesticide poate fi introdusă în GC sau LC.

Primul pas în procesul de pregătire a probelor pentru analiză este obţinerea unei probe
omogene şi a unui amestec omogen. Conform reglementărilor în vigoare legumele şi fructele
proaspete trebuie să fie mărunţite cel puţin 5 minute într-un mixer vertical. Numeroase studii
demonstrează ca omogenitatea probei şi cantitatea probei supusă analizei (10-25g) are
influenţă asupra reproductibilităţii rezultatelor. Extracţia cu un blender sau un omogenizator
încă este cea mai utilizată metodă pentru separarea pesticidelor neionice din matricea
plantelor. Cu toate că există numeroase metode de analiză şi detecţie a reziduurilor de
pesticide, metodele de extracţie utilizate sunt aceleaşi ca în primele zile ale introducerii
(naşterii) analizelor de pesticide, aducându-lise diverse modificări şi îmbunătăţiri. Numeroşi
solvenţi organici sau amestecuri de solvenţi sunt utilizaţi pentru a extrage o mare varietate de
pesticide cu proprietăţi fizico-chimice diferite.

Predominant în analizele multireziduale cei mai utilizaţi solvenţi de extracţie sunt

acetonitrilul, acetona şi acetatul de etil, fiind utilizaţi atât la începuturile analizelor de
reziduuri de pesticide cît şi în publicaţii recente pentru extracţia atît a pesticidelor nepolare cît
şi a celor polare dintr-o mare diversitate de matrici agricole.

Din fericire noile tehnologii dezvoltate reduc aceste deficienţe ale metodelor de extracţie,
parametrul de care se ţine cont în elaborarea acestora şi care este esenţial este selectivitatea.
Dacă iniţial majoritatea pesticidelor erau analizate prin tehnica GC, în ultimii ani tehnica LC
câştigă tot mai mult teren, iar detectorii clasici, selectivi sunt înlocuiţi cu un detector
universal, spectrometrul de masă, care prezintă calităţi selective şi de confirmare.

B) METODE DE ANALIZĂ A REZIDUURILOR DE PESTICIDE DIN PLANTE ŞI

PRODUSE VEGETALE

În funcţie de scopul determinării, conţinutul de pesticide poate fi o analiză ţintită sau

neţintită.

Un exemplu de analiza ţintită este inspecţia 36 LMA-urilor în legume , fructe şi alimente ;

analiţii relevanţi sunt fixaţi a fi determinaţi în funcţie de definirile date de reglementările
LMA (limita maximă admisă). Aceste definiri ale pesticidelor trebuie să includă şi metaboliţii
relevanţi sau produşii de degradare ai pesticidelor, ceea ce în regulamentele UE pentru fructe
şi legume dar şi pentru alimente nu sunt realizate în toate cazurile.

Înainte de 1970 determinarea câtorva pesticide din diferite clase chimice se făcea prin
tehnica gazcromatografică cuplată cu detectori selectivi ECD (detector cu captura de
electroni), NPD ( detector pentru azot si fosfor) şi FPD ( detector flamfotometric). Începând
cu acest an este introdusă tehnica GC-MS care este şi astăzi cea mai utilizată metodă în
analiza pesticidelor, fiind preferată deoarece prin intermediul acesteia se poate face simultan
atât determinarea reziduurilor cât şi confirmarea rezultatelor obţinute cu un singur instrument
şi într-o singură injectare. In cromatografia de gaze numită şi gazcromatografie eluentul ( un
gaz inert din punct de vedere chimic, ex. azot, heliu, hidrogen, ş.a.) trece prin dispozitivul de
introducere a probei (unde proba este volatilizată), o preia şi o introduce în coloana
cromatografică, care este sediul procesului de separare.

Datorită interacţiunilor dintre componenţii probei, cu faza staţionară şi/sau faza mobilă,
aceştia rămân în urma eluentului, migrând prin coloană cu viteze diferite ,datorită diferenţelor
dintre coeficienţii de repartiţie ai celor 2 faze. Astfel se produce o diferenţă a vitezelor de
migrare a componenţilor , suficient de mare pentru ca la ieşire, aceştia să fie separaţi, apoi
duşi de către eluent la detector.
 Figura 2. Gazcromatograf cuplat cu spectrometru de masa de tip TOF

Cromatograful de gaze poate fi cuplat cu detector cu ionizare in flacara (FID), detector cu

captură de electroni (GC-ECD), cuplat cu spectrometru de masă GC-MS (triplu cuadrupol,
TOF – “time of flight”- timp de zbor sau trapă ionică), cuplat cu spectrometru de masă de
înaltă rezoluţie (HRGC-HRMS). Spre deosebire de cromatografia de gaze în care faza mobilă
(gazul) joacă rol doar de “cărăuş” în transportul componenţilor prin coloană , în cazul
Cromatografiei de lichide, faza mobilă (un lichid) participă la procesul de separare, prin
interaţiuni mult mai complexe (adsorbţie , repartiţie, schimb ionic, excluziune sterică). Pe de
altă parte, faza mobilă lichidă participă nemijlocit la selectivitatea procesului de separare . În
determinarea reziduurilor de pesticide cromatograful de lichide sau lichid cromatograful ( LC)
poate fi cuplat cu detectori UV-VIS ( HPLC UV-VIS) sau cuplat cu spectrometru de masă(cu
triplu cuadrupolQQQ, trapa ionică sau TOF –timp de zbor).

Principiul spectrometriei de masă constă bombardarea substanţei investigate cu un fascicul de

electroni, urmată de accelerarea ionilor pozitivi şi de separarea lor în funcţie de masă, mai
corect în funcţie de raportulmasă/sarcină.
 4. DETERMINAREA ALEGENILOR DIN PRODUSELE ALIMENARE

O alergie alimentară este un răspuns anormal imun mediată anumite alimente.

Alimentele alergice au devenit o problemă critică a siguranței alimentelor și a sănătății

publice datorită pericolelor reacțiilor alergice și a reglementărilor legale impuse industriei
alimentare.

Opt tipuri de alimente sunt responsabile pentru majoritatea reacțiilor alergice: arahide, nuci de
copac, lapte, ouă, grâu, soia, pește și crustacee (FARE, 2016).

Monitorizarea alergenilor alimentari este extrem de importantă atât pentru industria

alimentară, cât și pentru persoanele sensibile. Nu există nici un tratament pentru alergii
alimentare și singura modalitate prin care persoanele sensibile să se protejeze împotriva unei
reacții alergice este evitarea strictă a alimentelor care conțin componenta / elementele care
încalcă legislația. Creșterea reglementărilor privind alergenii și conștientizarea evidențiază
necesitatea unor teste precise, la fața locului, sensibile și rapide pentru detectarea potențialilor
alergeni din produsele alimentare.

Cipul microfluidic electrochimic este un instrument puternic pentru analiza alimentelor

care beneficiază de avantajele metodelor electrochimice, inclusiv sensibilitatea ridicată,
simplitatea funcționării și controlul temporal și spațial (Hao & Wang, 2016; Martin, Vazquez
și Escarpa, 2016).

Jiang și colab. (2016) a proiectat un cip microfluidic electrochimic de la celulă la celulă

pentru detectarea alergenelor alimentare prin măsurarea modificărilor morfologice ale
celulelor alergene produse de alimente, așa cum se arată în figura 3.

Macrofagele ANA-1 și celulele mastocitare RBL2H3 au fost însămânțate la o densitate de

106 celule / ml și au fost cultivate în canale paralele, urmată de injectarea de soluție de
alergen pentru a stimula celulele macrofage și celulele mastocitare cu 0,1 ng / ml albumin din
ser dinitrofenilat de bovină (DNP BSA).

Detectarea metabolitului a fost efectuată pe o stație de lucru electrochimică prin

monitorizarea în timp real și analiza modificărilor semnalului de impedanță în cipul
microfluidic.

Chipsul microfluidic electrochimic a monitorizat cu acuratețe răspunsurile alergice în timp

real în celulă și a oferit o platformă generală pentru detectarea alergenelor alimentare.
 Figura 3. Cip microfluidic electrochimic

Lab-on-a-chip a fost recent sugerată ca un mediu perfect pentru diagnosticarea

portabilă și în timp real.

Desigur, nu există niciun motiv pentru care nu putem folosi laboratorul pe cip pentru a
detecta agenții patogeni alimentari. Lab-on-a-chip este un dispozitiv care integrează mai
multe funcții de laborator pe o singură platformă mică, de obicei numai în milimetri sau
centimetri.

Un cip lab-on-a-chip presupune în mod normal manipularea unor volume foarte mici
de lichid, acest lucru introduce domeniul microfluidicii care se ocupă de comportamentul,
controlul precis și manipularea fluidelor care sunt constrânse la o scară mică, sub-milimetrică.

Tehnologia Lab-on-a-chip utilizează o rețea de canale și fântâni care sunt gravate pe

plăci de sticlă, siliciu sau polimer pentru a construi mini-laboratoare (Figura 4).

Forțele de presiune sau electrokinetice deplasează volume mici într-o manieră bine
controlată prin canale. Lab-on-a-chip permite manipularea probelor, amestecarea, diluarea,
electroforeza, colorarea și detectarea pe un singur sistem integrat.

Principalele avantaje ale tehnologiei lab-on-a-chip sunt: ușurința în utilizare, viteza de

analiză, consumul redus de probe și reactivi și reproductibilitatea ridicată datorată
standardizării și automatizării. In rezumat, biosenzorul de laborator pe un cip este un mediu
perfect pentru a face posibil biosensibilitatea portabilă și în timp real a agenților patogeni
alimentari.
 Figura 4 Tehnologia Lab-on-a-chip

Cerințele biosenzorului Lab-on-a-Chip pentru utilizarea pe teren

Lab-on-a-chip a fost investigat în primul rând pentru a înlocui nevoia de diagnosticare

medicală de rutină și de înaltă performanță. Pentru a utiliza cipul "lab-on-a-chip" pentru
aplicații pe câmp, dispozitivul trebuie să fie complet portabil și capabil să detecteze aproape
în timp real. În acest scop, trebuie să se demonstreze următoarele:

1. Manipularea automată a lichidelor (amestecare, transport și separare, dacă este

necesar)

Aceasta este una dintre cele mai studiate domenii în domeniul cercetării în laborator.
Canalele de joncțiune Y sau T au fost utilizate pentru realizarea amestecului de lichide,
cuplate cu mai multe modele diferite de modele de mixere pasive / puls / serpentine
(Figura 2).

În trecut, s-au sugerat și testat mecanisme mai active de amestecare

microfluidică, în special utilizând microvalve și micropompe fabricate pe cip.

Deși acestea păreau promițătoare și au oferit performanțe îmbunătățite decât

mixerele microfluidice pasive / puls / serpentine, acestea sunt mai puțin frecvente în
detectarea patogenă din cauza complicațiilor în fabricarea și funcționarea dispozitivelor care
sunt inadecvate pentru matricele de mostre complicate, cum ar fi alimentele.

Transportul lichid se face prin aplicarea fie a tensiunii (fluxul electroosmotic), fie
a presiunii externe (pomparea seringii; Figura 4)
Figura 5.

2. Pre-tratare a eșantioanelor minime

Când se utilizează un lab-on-a-chip într-un laborator de diagnosticare,

tratamentul prealabil al eșantionului nu este la fel de mare, deoarece echipamentul necesar
este ușor disponibil în acele medii. În situațiile de teren, însă, tratamentul prealabil ar putea
deveni foarte dificil.

Probele de hrană, cum ar fi fructele și legumele, trebuie să fie măcinate și filtrate

/ centrifugate pentru a elimina resturile mari (celule vegetale și fragmente de țesuturi). Probele
de hrană sunt uneori pur și simplu spălate cu tampon deoarece cele mai multe contaminări
patogene se găsesc pe suprafața alimentelor.

Pentru o performanță mai bună, sunt necesare mai multe etape de pre-tratare a
eșantioanelor riguroase: centrifugarea de mai multe ori, resuspendarea peletelor cu un mixer
vortex și / sau un sonicator, liza celulară / extracția acidului nucleic (pentru PCR).

Aceste proceduri complicate ar trebui să fie reduse la unul sau doi pași simpli,
folosind echipamente mici și simple, cum ar fi o mini-centrifugă (alimentată cu baterii) sau o
seringă cu filtru, astfel încât senzorul să poată fi utilizat de către non-experți cu timp minim de
procesare.

Au fost numeroase încercări de a încorpora aceste procese de pre-tratare a

probelor în laborator pe un cip. Centrifugarea și filtrarea membranelor sunt probabil cele mai
cercetate, care sunt foarte important în tratarea probelor de alimente. Un exemplu popular de
centrifugare de tip lab-on-a-chip este lab-on-a-CD.

Microcanalele sunt fabricate direct pe suprafața unui CD (disc compact), de la

centrul său până la exterior, iar lichidul de probă / reactiv este încărcat în godeurile de
admisie.

Acest CD este apoi încărcat în CD player și rotit, creând o forță centrifugă care
face ca lichidul să curgă prin microcanal (Figura 6). Un alt exemplu este microfabricarea
structurii poroase în microcanale, adică fabricarea pe cip a filtrului cu membrană.

Figura 6. Lab-on-cip CD

3. Rapid

Un ELISA tipic durează câteva ore într-un laborator.

Un tipic PCR (care include liza celulară și extracția genelor) durează, de asemenea,
aproximativ câteva ore într-un laborator. O cultură celulară normală și numărarea coloniilor
durează de obicei mai mult de 24 de ore. Aceste momente nu iau în considerare timpul de
livrare a probelor.

Detectarea în timp real, în mod strict vorbind, indică faptul că detectarea ar trebui
făcută simultan cu prelevarea de probe, dar ar fi sigur să se definească mai puțin de 10 minute
de detectare ca și detectarea în timp real.

Cu toate acestea, în anumite aplicații, a fost definită detectarea în timp real a testelor
care pot fi terminate într-o singură zi, de exemplu 4-8 ore și care sunt anunțate în astfel de
condiții. Nu vom folosi această definiție (4-8 ore în timp real) în această revizuire, deoarece
4-8 ore pot fi greu acceptate ca detectări în timp real de către publicul larg.
 4. Sistem complet integrat

Întregul sistem ar trebui să fie încorporat într-un singur dispozitiv, pentru ușurința utilizării și
livrarea echipamentelor. Multe alte sisteme de biosenzori necesită echipament separat pentru
pre-tratament și / sau detectare.

Aproape toate sistemele comerciale biosenzor (inclusiv lab-pe-o-chips-uri) necesită un

computer extern. Un adevărat sistem complet integrat nu ar trebui să necesite niciun
echipament suplimentar.

La minim, ar trebui să aibă propria interfață de utilizator (doar câteva butoane fără tastatură)
și un panou LCD cu afișare integrată pentru funcționarea sistemului și afișarea rezultatelor
testelor.Dacă este posibil, sistemul ar trebui, de preferință, să aibă o unitate de stocare a
datelor și / sau un sistem de transmitere a datelor.

5. Pe baterii

Adaptoarele de curent alternativ nu sunt întotdeauna disponibile în situații de teren. Prin

urmare, sistemul ar trebui să funcționeze pe deplin cu energia acumulatorului. Consumul
redus de energie este necesar, ceea ce poate împiedica utilizarea fluxului electroosmotic
(EOF, foarte obișnuit în laboratorul pe un cip, dar necesită o tensiune și o putere relativ
ridicată).

Cipurile de laborator pe bază de baterii pot să nu fie foarte dificil de dezvoltat, deși astfel de
demonstrații sunt relativ rare.

6. Nu este necesar un frigider

Reactivii necesari pentru completarea testelor, cum ar fi anticorpii, acizii nucleici sau
enzimele necesită de obicei refrigerare.

În situații de teren, totuși, acești reactivi trebuie să fie împachetați într-o cutie de gheață sau
liofilizați (sub formă de liofilizator) ca pulbere pentru o eventuală păstrare la temperatura
camerei.Acest studiu de stocare pe termen lung al reactivilor este relativ rar în studiile
biosenzor și la laborator.

7. Limită foarte mică de detectare (adică sensibilitate ridicată)

Limitele de detecție (limitele de detecție) pentru testele ELISA comune pot fi la fel de mici ca
zeci de picograme de proteine per ml de probă. Limitele de detecție pentru PCR obișnuit pot fi
teoretic la nivelul unei singure celule pe 10-100 μL de probă, echivalent cu 10-100 celule
(reprezentate în mod normal de unități care formează colonii, CFU) per ml de probă.

Se așteaptă ca aceleași niveluri ale limitelor de detecție să fie valabile pentru cipurile de
laborator, dar limitele reale au fost câteva sau câteva zeci de proteine nanogram pe ml de
probă sau câteva sute sau milioane de celule per ml de probă (102 -106 CFU / ml).
 Bibliografie

1. Department of Agricultural and Biosystems Engineering, the University of Arizona,

Tucson,
AZ 85721, USA;
2. Department of Chemical Engineering, Hongik University, Seoul 121-791, Korea;
3. Nagy, I. (2003) Biofizică, Editura EUROBIT, Timişoara;
4. H. Naşcu, Metode şi Tehnici de Analiză Instrumentală, Ed. U.T.PRES, Cluj-Napoca,
2003.
5. M. Medeleanu şi M. Milea, Îndrumător de Lucrări: Metode Spectroscopice în Chimia
Organică, Universitatea Politehnica Timişoara, 1998.
6. http://lori.academicdirect.org/books/pdf/2009_cai.pdf
7. http://www.scritub.com/stiinta/chimie/METODE-FIZICO-CHIMICE1532241.php