Transfección de células

eucariotas

Dra. Anabel Alvarez Juliá

Biología celular - 2017
Transfección: Proceso por el cual un ácido
nucleico foráneo ingresa en una
célula eucariota
¿Para qué transfectar?
•Estudiar la regulación de la expression génica
(promotores y otros elementos regulatorios)
•Estudiar mecanismos involucrados en el
procesamiento del ARN, postraduccionales, etc.
•Estudiar la localización subcelular y/o el efecto
de la expression de una proteína sobre el
fenotipo celular
•Expresión de proteínas para su purificación
•Evaluar la interacción de proteínas
•Producir organismos transgénicos
•Terapia génica
 Tipos de transfección
Estable Transitoria
El ADN se incorpora dentro del El ADN introducido no se integra
genoma. al genoma. Existe solo por un
período limitado de tiempo.

Transmiten el ADN introducido a su No se transmite en la división celular.

progenie.
 ¿Cuál elijo?
Estable Transitoria
Es necesario seleccionar las células Se puede evaluar el efecto de la
que han incorporado el ADN. transfección a tiempos cortos
Se requiere de un método de
transfección de alta eficiencia.

Brooks, PNAS 2007

Producción de proteínas a gran Efectos rápidos de la expresión de

escala, estudios farmacológicos genes o sus productos o producción
largos, terapia génica… de proteína a pequeña escala
 ¿Cómo transfecto?
Métodos físicos
Electroporación
Biobalística
Microinyección

Métodos químicos
Liposomas
Fosfato de calcio
Polímeros catiónicos

Métodos biológicos
(transducción viral)
Adenovirus
Retrovirus
Lentivirus
Métodos físicos
Biobalística
Proyección de micropartículas de oro recubiertas con el
ácido nucleico a alta velocidad
Dispositivo: Gene gun
Células vegetales

Microinyección
Microinyección del ADN al núcleo
Dispositivo: microagujas/micromanipulados
Células individuales

Electroporación
El ADN pasa a través de poros temporarios en la
membrana celular
Dispositivo: electroporador. Da un pulso eléctrico que
eleva el potencial eléctrico de la membrana celular
Suspensión celular
 Métodos químicos
Moléculas catiónicas:
•Péptidos y sus derivados (por ejemplo, polilisina) Difieren en
•Polímeros sintéticos (polietilenimina o PEI) o naturales (colágeno) eficiencia y
•Lípidos catiónicos (liposomas) citotoxicidad

Mecanismo: forman complejos con el ADN, que se adhieren a la membrana

celular mediante interacciones electrostáticas y son incorporados
por endocitosis.

Fosfato de calcio: se utiliza una solución buffer para formar un coprecipitado

de ADN y fosfato de calcio sobre el cultivo celular. Este precipitado ingresa a la
célula por endocitosis
 Métodos biológicos
1. Producción de partículas pseudovirales en células empaquetadoras: virus
defectivos para la replicación cuyo genoma incluye al gen de interés
2. Infección de células de interés con partículas virales
Ventajas:
• Amplio rango de células de mamíferos con alta eficiencia de transfección
• Dependiendo el tipo de virus se puede:
 Restringir la infección a células en división o a células que no se dividen
únicamente
 Dirigir a un tipo celular específico (terapia génica)
 Integrar o no en el genoma

Ejemplo: lentivirus
 Eficiencia de la transfección
No todas las células
incorporan el ADN foráneo.

Eficiencia: porcentaje de
células que incorporaron el
ADN.
Método A Método B
• Tipo celular
• Viabilidad celular
• Confluencia
• Medio de cultivo
• Tipo de molécula
transfectada
• Método de transfección
• Calidad y cantidad de ADN
 ¿Cómo ingresa el ADN a la célula?
Vectores

Un vector es una molécula de ADN

que se utiliza como vehículo para
introducir material genético exógeno
a otra célula, donde puede replicar o
ser expresado.

Plásmidos

Los plásmidos son un tipo de vector. Son moléculas pequeñas de

ADN circular doble cadena. Se replican en forma independiente del
cromosoma bacteriano
 ¿Clonar o expresar?

Los vectores de clonado son pequeñas moléculas de ADN,

con capacidad autoreplicativa. Se introducen dentro de la
célula hospedadora y en general, producen un gran numero
de copias.

Los vectores de expresión poseen toda la información necesaria

para expresar el gen.
 Entonces, para clonar necesito:

Origen de replicación (ori)

Sitios únicos de clivaje para

enzimas de restricción (MCS
–Multiple cloning site)

Marcadores que permitan su

reconocimiento (resistencias
a antibióticos)
 ¿Y si quiero expresar el gen?
Además del origen de replicación, marcador de selección y MCS,
necesito:
Promotor

Sitio de unión a ribosomas

Sitio de terminación de la transcripción

Plus: tags a proteínas fluorescentes o

detectables por anticuerpos

Marcador de selección para

eucariotas (transfección estable)
Ya tenemos el gen de interés en nuestro vector…
¿y ahora?
 Cultivo celular
Células, tejidos u órganos tomados directamente
Cultivo primario del organismo y cultivados en un medio artificial.

Cultivo celular que tiene capacidad de

Línea celular multiplicarse indefinidamente
Confluencia – pasajes celulares

Adheridas: Disgregación química,

mecánica o enzimática

Suspensión: Dilución
Establecimiento de una línea celular
 Medio de cultivo
Debe aportar todos los requerimientos para el crecimiento de las
células

Base: Glucosa (fuente de C), aminoácidos (fuente de N), cofactores enzimáticos,

vitaminas, sales

Suplementos

Buffer: Mantenimiento del pH, bicarbonato, HEPES

Suero: Estímulos proliferativos y adhesivos.
Ejemplos: Transferrina, albúmina, factores de crecimiento, etc.
Antibiótico: Prevención de contaminación.
Ejemplos: Penicilina, estreptomicina, gentamicina
 Condiciones físico-químicas
pH: 7.2 -7.5 Medio de
Osmolaridad: 280 -320mOsmol/kg cultivo

CO2: 5 -7 %
Temperatura: 37 °C
(mamíferos)

Esterilidad → Técnica asép ca

 Técnica aséptica
Cabinas de seguridad biológicas Mechero

Esterilizar la cabina con luz UV antes de usar

Guantes

Guardapolvo
Limpiar el área antes de empezar a trabajar
Corrientes de aire estéril. Esperar 5 minutos antes de comenzar a trabajar
Medios esterilizados (filtración), material autoclavado
 Reglas de trabajo en el laboratorio
Antes de entrar Saber qué hay que hacer = Leer la guía

-Cabello recogido
-Guardapolvo

Antes de Limpiar la mesada de trabajo con alcohol 70%

empezar Verificar el material de trabajo

Al finalizar Descartar el material,

Verificar mecheros,
Limpiar la mesada,
Dejar las pipetas en su máxima graduación
 TP de transfección

Desarrollo del TP
Materiales
Tubos eppendorfs estériles
Tips estériles N-cadherina-GFP 850 ng/µl
β3-integrina-GFP 490 ng/µl
Micropipetas
α Actinina-GFP 370 ng/µl
PTP1B-D181A-GFP 560ng/µl
Soluciones Paxilina-GFP 610 ng/µl
PEI 87k Tubulina-GFP 580 ng/µl
Opti-MEM
ADN plasmídico-GFP
PBS estéril
Medio de cultivo completo (DMEM con 5% Suero fetal bovino,
antibiótico)
1. Sembrar las células en una placa multipocillos a una densidad
celular adecuada 24 hs antes de la transfección

2. Preparar la mezcla de transfección usando los reactivos a

temperatura ambiente en tubos de 1,5 ml estériles de la
siguiente manera:
-1 µg de DNA/pocillo
-2 µl de PEI 87k /pocillo
-100 µl/pocillo de Opti-MEM
Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente

3. Lavar cada pocillo de células con PBS estéril 2 veces

4. Agregar 200 µl de Opti-MEM a cada uno
5. Agregar la mezcla de transfección a cada pocillo

6. Incubar 2 a 4 hs en estufa
Cambiar el medio de las células por medio fresco completo a 37
°C