UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN

FACULTAD DE AGRONOMIA

FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

SUPERVIVENCIA INTRACELULAR IN VITRO DE Salmonella sp EN LA LÍNEA

CELULAR HeLa.

PRODUCTO INTEGRADOR DE APRENDIZAJE

NOMBRE

ROMARIO GARCIA PONCE

MATERIA

ENFERMADADES INFECCIOSAS

ESCOBEDO, N.L. ABRIL DEL 2019

INTRODUCCIÓN

Salmonella sp., en el ámbito mundial, está asociada frecuentemente a las enfermedades

diarreicas, las cuales son una de las causas más importantes de morbilidad y mortalidad, sobre todo
en lactantes, niños y ancianos. Se ha estimado que, en Asia, África y Latinoamérica, de acuerdo a
factores socioeconómicos y nutricionales, la probabilidad de que un niño muera por enfermedad
diarreica antes de los 7 años pueda llegar al 50% (Parra, 2002). Las infecciones agudas del tracto
gastrointestinal están consideradas como una de las enfermedades de transmisión más comunes de
importancia tanto en salud pública como en salud animal debido al impacto económico que
ocasiona (OMS, 2019).
En México en los últimos años se notificaron en el 2000 cerca de 215,155 casos de
salmonelosis siendo los estados más afectados Tabasco, Coahuila, Chiapas y Quintana Roo
(Gutiérrez et al. 2000) Para dar tratamiento efectivo sobre la salmonelosis, es importante
enfocar investigaciones en conocer las vías de trasmisión y los factores de riesgo asociados
además de la fisiopatología de la enfermedad y de esta manera encontrar formas eficaces de
combatir a este agente patogénico.
Un método para conocer el mecanismo de infección es evaluar la forma en que la
bacteria logra evadir los mecanismos defensivos de la inmunidad innata y se internaliza en la
célula diana, para lo cual existen ensayos de infección que determinan la capacidad de
replicación que tiene la bacteria en diferentes tipos de células.
Por otro lado, el uso del cultivo celular se ha convertido en un pilar para estudios
básicos de biología y medicina ayudándonos a entender procesos de interacción de las células
con el ambiente, compuestos tóxicos, fármacos y agentes patógenos, siendo una de las líneas
celulares más utilizadas en la investigación biomédica, la células HeLa o células de cáncer
cervicouterino que desde su descubrimiento de acuerdo a Rebecca Skloot (2009) más de 60,000
investigaciones científicas han sido publicadas utilizando la línea celular, y el número de
investigaciones está incrementando firmemente. Todo esto se ha debido a las características
que posee como ser sorprendentemente resistente, inmortal y prolífica, por lo tanto, hacer un
ensayo de infección de Salmonella sp. en la línea celular HeLa nos permitirá conocer la
habilidad que tiene microorganismo para internarse y replicarse en estas células que tienen un
origen epitelial.

2
ÍNDICE

1. INTRODUCCION……………………………………………………………………2

2. INDICE………….………………………………………………………………...…3

3. MARCO TEORICO………..………………………………………...………….…...4

4. HIPÓTESIS………………………………………………………….…...……..……8

5. OBJETIVO ………………………………………………………..……….…..……8

6. MATERIALES Y MÉTODOS …………………………………….….…….………8

7. RESULTADOS ………………………………………………………….....………10

8. DISCUSIÓN …………………………………………………………….….………13

9. CONCLUSIÓN ………………………………………………………....………….14

10. LITERATURA CONSULTADA ……………………………………….…….……15

3
MARCO TEÓRICO

1. Salmonella sp.
Esta bacteria es un bacilo gramnegativo intracelular, anaerobio facultativo, con flagelos
peritricos, el cual constituye un grupo importante de patógenos para animales y humanos. Está
ubicado dentro del orden Enterobacteriales (Tabla 1) (Popoff & Minor. 1992).

Tabla 1: Clasificación taxonómica del género salmonella (Brenner et al, 2000).

Dominio: Bacteria
Filo: Proteobacteria
Clase: Gammaproteobacteria
Orden: Enterobacteriales
Familia: Enterobacteriaceae
Género: Salmonella

El género abarca 2 especies diferentes Salmonella enterica y Salmonella bongori. Esta

última es una especie considerada como no patógena para el hombre, aislándose
fundamentalmente de animales de sangre fría, especialmente reptiles, aunque algunos casos de
enfermedad humana han sido reportados. Salmonella enterica incluye numerosas cepas
patógenas, tanto para el hombre como para diferentes especies de reptiles aves y mamíferos.
S. enterica subespecie enterica puede clasificarse en 1547 serovariedades o serotipos
diferentes. Las serovariedades se distinguen por la reacción con antisueros específicos frente
a dos antígenos de la superficie bacteriana altamente variables: el antígeno O que refleja la
variación en las porciones externas del Lipopolisacárido de la superficie bacteriana y el
antígeno H el cual refleja la variabilidad en la flagelina, proteína constituyente del flagelo
bacteriano, con 46 y 115 formas antigénicas diferentes respectivamente La mayoría de las
cepas de Salmonella poseen dos genes que codifican para dos tipos distintos de flagelina,
variantes del antígeno H denominadas H1 y H2 (Parra M., 2002). De esa manera, cada uno de
los serotipos (serovares o serovariedades) es una combinación única de los antígenos O, H1 y
H2 La mayoría de las serovariedades han conservado el nombre que se le daba cuando era
considerada una especie. Por ejemplo, el antiguo nombre S. enteritidis, ahora se denomina
Salmonella enterica serovar Enteritidis, o para simplificar, S. Enteritidis (Hensel M., 2000).

4
1.1 Salmonella como agente de enfermedad trasmitida por alimentos

La salmonelosis es una de las infecciones trasmitidas por alimentos más frecuentes,

habiéndose reportado una incidencia de 1,3 billones de casos de salmonelosis humana por año
en todo el mundo, con tres millones de muertes (Betancor, L. 2010). Las infecciones por
Salmonella enterica pueden conducir a patologías intestinales crónicas como la enfermedad
de Crohn y la colitis ulcerativa crónica, además de otras patologías como la artritis reactiva
(Keller, 1997). A pesar de que la mayoría de los serotipos de S. enterica pueden causar
enfermedad en el hombre, la salmonelosis es generalmente causada por unos pocos serotipos
que predominan ampliamente. Se estima que más del 70% de las infecciones humanas están
causadas por 12 serovariedades prevalentes. La historia epidemiológica de las infecciones por
Salmonella muestra que diferentes serovariedades prevalecen en diferentes momentos del
tiempo. El serovar aislado con mayor frecuencia de infecciones humanas en todo el mundo fue
durante muchos años Salmonella Typhimurium aunque desde los años 90 el serovar Enteritidis
ha superado en número a Typhimurium en muchas regiones (Fierer, & Guiney, 2001).

1.2 Patogenia
Una vez que Salmonella ha alcanzado el intestino, es capaz de persistir en la mucosa,
evadiendo los mecanismos bactericidas de las enzimas digestivas, las sales biliares, la
inmunoglobulina A secretoria, péptidos antimicrobianos y otros mecanismos defensivos de la
inmunidad innata (Fierer, J., 2008).
La forma en que Salmonella interacciona con las células epiteliales y es capaz de atravesar
el epitelio hasta la submucosa ha sido ampliamente estudiada en modelos animales e
infecciones de cultivos celulares in vitro. Para lograr causar enfermedad, Salmonella puede
utilizar distintas vías para colonizar la mucosa intestinal: Por un lado, es capaz de inducir su
propia internalización por parte del enterocito (endocitosis mediada por la bacteria), luego de
adherirse a la superficie apical de la célula a través de varias adhesinas fimbriales y de
modificar el borde en cepillo del epitelio intestinal induciendo modificaciones en el
citoesqueleto celular que culminan en el englobamiento de los microorganismos en una
vacuola intracelular (Haraga A. et al, 2008). Por otra parte, Salmonella atraviesa
preferencialmente la mucosa utilizando la vía dependiente de células M. Estas células,
muestrean la cara externa de la mucosa intestinal en busca de antígenos, internalizándolos por

5
pinocitosis y transportándolos hacia los órganos linfoides (placas de Peyer) en la submucosa
(Zhang, S. et al 2003).

2. Cultivo celular

Se entiende por cultivo celular al conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de

las células 'in vitro', manteniendo al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y
genéticas. El cultivo celular primario es el tipo de cultivo más utilizado este se puede obtener
a partir de explantes primarios o de suspensiones de células disgregadas. La disgregación
celular se realiza por métodos enzimáticos o mecánicos. En estos cultivos se pierden las
interacciones célula-célula y las interacciones de la célula con la matriz extracelular. Sin
embargo, las células son capaces de proliferar y la población celular crece notablemente.
Cuando las células ocupan toda la superficie disponible se dice que han alcanzado la
confluencia. En esta etapa, las células establecen contactos entre ellas que inhiben su
proliferación y el crecimiento se detiene. Por eso, al cabo de un tiempo hay que trasplantar las
células a un nuevo soporte a esta operación se denomina subcultivo o pase (Freshney R. 2005).
Existen dos tipos de cultivo celular primario:

• Cultivos en monocapa: las células crecen adheridas sobre un soporte sólido (plástico o
vidrio). El anclaje al sustrato es un prerrequisito para la proliferación celular. Es el método
utilizado para la mayoría de las células excepto para las hematopoyéticas (Rodríguez M. 2010).

• Cultivos en suspensión: las células se encuentran dispersas en el medio de cultivo. Su

crecimiento no depende del anclaje. Este tipo de cultivo se restringe a las células
hematopoyéticas, células madre, líneas celulares transformadas y células tumorales . Alcanzan
la confluencia cuando el número de células es grande y los nutrientes son insuficientes
(Rodríguez M. 2010).

2.1 Subcultivos y líneas celulares

Las células del cultivo primario en monocapa se dispersan por métodos enzimáticos y se
pasan a un nuevo frasco de cultivo. En el caso de células en suspensión, sencillamente se
diluyen en medio fresco. Los sucesivos cultivos así formados se denominan una línea celular.

6
La formación de una línea celular a partir de un cultivo primario implica que (Freshney R.
2005).

 Aumenta el número de células obtenidas

 Acaban predominando uno o dos tipos celulares: los que tienen mayor tasa de
crecimiento
 La población celular se hace uniforme y homogénea
 Sus características se conservan durante las sucesivas generaciones y, si se conservan
en nitrógeno líquido, de forma indefinida
Normalmente, las líneas celulares tienen una vida finita que, según el tipo de célula, se
puede prolongar entre 20 y 100 generaciones. Superado ese límite, las células entran en una
etapa que se denomina senescencia en la que pierden su capacidad de proliferar y mueren. Sin
embargo, algunas células evitan la senescencia y dan lugar a líneas celulares continuas, que
crecen indefinidamente. Estas células pueden surgir de forma espontánea o inducida y son el
resultado de un cambio genotípico denominado transformación (Romero L. et al. 2005.

3. Células HeLa

La línea celular HeLa fue obtenida en 1953 por el doctor George Gey del cáncer
cervicouterino de Henrietta Lacks, una mujer afroamericana que murió a causa de este
padecimiento (Masters J.R., 2002). Estas células han sido distribuidas alrededor del mundo y
son utilizadas tanto en investigación contra el cáncer como en investigación biomédica no
relacionada con cáncer, siendo la línea celular de cáncer más utilizada a nivel mundial (Masters
J.R., 2002). Los numerosos estudios que se han hecho con las células HeLa hacen que estas
células estén muy bien caracterizadas haciéndolas un prototipo ideal para utilizar como modelo
del cáncer cervicouterino.

7
HIPÓTESIS

Las células HeLa permiten la replicación intracelular de la bacteria Salmonella sp.

OBJETIVO

Evaluar la capacidad replicativa intracelular de Salmonella sp. en células HeLa.

MATERIALES Y MÉTODOS

1. Cultivo bacteriano

La muestra de Salmonella sp. fue proporcionada por el laboratorio de Bacteriología y

Micológica Veterinaria de la FMVZ. Esta se descongeló y activo en Caldo Soya Tripticasa
(BD and Co., EUA), a partir de este, se realizaron diluciones seriadas para contabilizar las
Unidades Formadoras de Colonia (UFC), colocando 480 μl de Buffer Fosfato Salino (PBS) y
20 μl de la suspensión de bacterias en un tubo; se realizaron 10 diluciones, posteriormente se
sembró por vertido en placa 20 μl de las últimas 6 diluciones en Agar Nutritivo (BD and Co.,
EUA), incubándose a 37 º C durante 24 horas.
Pasado este tiempo, se calcularon las UFC/ml de las diluciones. En base a estos resultados
se realizó el cálculo para determinar la concentración bacteriana en nuestra suspensión.

(𝑁𝑜. 𝑑𝑒 𝐶𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠)(𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛)

𝑈𝐹𝐶/𝑚𝑙 =
𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

2. Cultivo celular

La fase del cultivo celular se llevó a cabo en el laboratorio de inmunología de la facultad

de la FMVZ. La línea celular utilizada fue de cáncer cervicouterino (HeLa), las cuales son
células de tipo epitelial cultivadas en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEMF-12; Life
Technologies, Invitrogen, Burlington, Ontario, Canadá) suplementada con 10% de suero fetal
bovino (FBS; Gibcon, Grand Island, NY), con antibiótico adicionado (penicilina,
estreptomicina). Las células se mantuvieron en cajas de cultivo de 25 cm² a 37 °C en una
atmósfera con 4 % CO₂. Posteriormente, cuando el cultivo alcanzó una confluencia del 80%

8
se disgregaron las células de la caja de cultivo de forma mecánica con un gendarme, se retiró
el medio, se hicieron dos lavados con PBS y se agregaron nuevamente medio DMEMF.

2.1 Conteo celular

Para el conteo celular se disgregaron las células de la caja de cultivo de forma mecánica
con un gendarme, el medio se colocó, en un tubo cónico Falcon de 15 ml (Corning Co., EUA),
el cual se centrifugó a 1700 rpm por 10 minutos. Se tomó 50 μl de la suspensión de células y
se montó en la cámara de Neubauer (Improved Brightline, Optik Labor, Alemania),
posteriormente se tomó 50 μl de azul de tripán para la detección de células, se realizó el conteo
de las células por cuadrante con un contador manual, los resultados obtenidos se procesaron
en hemocytometro.org se realizaron los cálculos correspondientes.

3. Análisis de supervivencia intracelular.

Para el ensayo bactericida se colocaron 100 µl de suspensión de células en 7 pocillos de

una misma hilera de una placa de 96 pozos y se incubaron a 37 °C en una atmósfera con 4 %
CO₂ por 24 horas, para así permitir la adherencia de las células. Posteriormente se desechó el
medio, y se realizaron 3 lavaron con PBS, se reincorporó 100 µl de medio DMEM.
Para la preparación de las bacterias se descongeló una alícuota de bacterias y se centrifugó
a 4000 rpm por 5 minutos, posteriormente se decantó el sobrenadante y se le añadió 5 ml de
medio DMEM, de donde se tomaron 9 µl y se depositaron en cada uno de los pocillos. La placa
se observó en el microscopio de fase de contraste (Zeiss, Alemania), y se incubó por cuatro
horas bajo las condiciones ya mencionadas, para observar la capacidad replicativa intracelular
de salmonella sp. en las células HeLa.
Después de las cuatro, los cultivos se lavaron con PBS, y se lisaron las células con 50 µl
de una solución de Tween 20 (Sigma) y se realizaron diluciones seriadas del lisado hasta 10 5,
las cuales se sembraron por vertido en placa, agregando 20 µl en cajas de agar nutritivo, las
cuales se incubaron a 37°C por 24 horas y se realizó el conteo de UFC.

9
RESULTADOS

1. Cultivo Bacteriano

Para determinar la cantidad de bacterias se realizaron diluciones hasta 10 10 sembrando las

últimas seis diluciones (Figura 1) obteniendo los resultados descritos en la Tabla 2, en base a
esto, se tomaron los resultados de las diluciones y se tomó un promedio de estas tres siembras
para obtener un total de 55; 000, 000 UFC/ ml.

Figura 1: Siembra en placa de agar nutritivo de salmonella,

dilución 105 a 1010.

Tabla 2: UFC por mililitro de salmonella en las diluciones.

Dilución No. UFC UFC/ml

10-5 Incontable ---
10-6 17 42,500,000
10-7 3 75,000,000
10-8 0 0
10-9 0 0
10-10 0 0

2. Cultivo celular

El cultivo celular se realizó en cajas de cultivo (Figura 2) realizando diversos pases

cuando se alcanzaba un 80% de confluencia (Figura 3).

10
Figura 2: Cultivo de células HeLa, en cajas de Figura 3: Observación del cultivo de células HeLa en
25 cm2 con medio DMEM. medio DMEM, en 40x por microscopia de contraste de
fases.

3. Conteo celular

Para el conteo celular en cámara de Neubauer las células se tiñeron con azul de tripán
(Figura 3) y se contaron cada uno de los cuadrantes (Figura 4) exteriores de las dos cámaras
de recuento obteniendo 102 células vivas en total, por lo que se registró que existían 167,500
células/ml, equivalente a 1;842, 500 células en total en los 11 ml de suspensión de células ,
posteriormente se tomó 1.1 ml de esta suspensión y se colocó en un tubo Eppendorf, se le
agregó 1.842 ml de medio DMEM y así se obtuvo una concentración de 100 células por
microlitro.

Figura 3: Observación de las células Figura 4: Observación de un cuadrante en 40x del

HeLa con azul de tripán en 40x. conteo de células HeLa en la cámara de Neubauer.

11
 1. Análisis de supervivencia intracelular.

Para el ensayo de supervivencia intracelular se colocaron 10,000 células en cada pocillo

(Figura 6) 24 horas después de la incubación se observó el crecimiento bacteriano de la figura 5.

Figura 5: Observación en 40x del conteo de células

HeLa por cámara de Neubauer.

Figura 6: Ensayo de supervivencia intracelular.

La cantidad de acuerdo a los cálculos de UFC realizados fue de 12.5 UFC/µl. Calculando
el índice de supervivencia teniendo que en cada pozo existía un total de 1000UFC/µ al inicio del
ensayo, a las 4 hrs se lavó y lisó el contenido de cada pozo para poder hacer diluciones y posterior
siembra. Se obtuvo que solo sobrevivió el 1.25 % del total de las UFC que fueron sembradas
10000/ µl 100%
12.5/ µl 1.25%

12
DISCUSIÓN

Se determino la capacidad de supervivencia intracelular de la bacteria Salmonella sp.

en células de cáncer cervicouterino (HeLa). Los mecanismos de invasión de células animales
por Salmonella sp y el envolvimiento de bacterias involucra mecanismos endocíticos, por lo
cual la entrada de salmonela sp. en las células animales es similar a la fagocitosis con respecto
a las respuestas morfológicas de las células animales (Kihlstriim y Latkovic, 1978). Sin
embargo, se cree que la salmonella en las células HeLa, presenta un tipo de unión estable a la
superficie de la célula antes y durante la entrada (Kihlstrom & Latkovic, 1978), según Haraga
A. et al. (2008) Salmonella interacciona con las células epiteliales debido a que esta es capaz
de inducir su propia internalización, luego de adherirse a la superficie apical de la célula a
través de varias adhesinas fimbriales que culminan en el englobamiento de los
microorganismos en una vacuola intracelular.
En el ensayo realizado se colocaron 100,000 bacterias en 10,000 células,
posteriormente se incubo a condiciones ideales para el proceso de infección de la salmonella,
se realizaron dos lavados con PBS para eliminar a las bacterias que no estuvieran internalizadas
en las células, y se procedió a romper las células para liberar las bacterias, realizando una
siembra por vertido en placa, realizando los cálculos y obteniendo un porcentaje de
supervivencia intracelular de 1.25%.
De acuerdo a los resultados expuestos por Kihlstrom, (1977) dos serovariedades (MS y
MR10) de Salmonella tiphimurium tiene la habilidad de internalizarse en las células HeLa a
los 30 min post inoculación, con resultados 45% y 98% del total de bacterias inoculadas
respectivamente, en este estudio las bacterias estaban marcadas fluorescentemente para poder
ser visualizadas dentro de las células. Otro estudio realizado en cuanto a la interacción de la
bacteria y la línea celular fue el realizado por Giannella, et al, (1973) donde utilizando 12
distintos aislamientos de las cuales 8 lograron invadir rápidamente la línea celular, la invasión
fue evidente a las 3 horas después de la infección bacteria y sin embargo solo células
diseminadas fueron invadidas, y estas contenían solo algunas bacterias, comparadas con las 7
horas, mostrando que un 20%-50% de las células Hela ya estaba invadidas y el numero
intracelular había incrementado. De igual forma Jones et al., (2009) evaluó el índice de
adhesión irreversible que es el paso previo a la internalización de la bacteria y sus resultados
fueron los siguientes después de 5 min de contacto, algunas bacterias se adhirieron

13
irreversiblemente a la superficie de las células HeLa y ya no pudieron ser removidas con
lavados de Solucion Hank, cuyo número de bacterias incremento firmemente durante los
primero 30 min.
De acuerdo a los estudios previos, podemos determinar que salmonella sp. tiene la
capacidad de infectar intracelularmente a las células epiteliales de HeLa. En nuestros
resultados se mostró que menos del 5% de las bacterias fueron capaces de internalizarse en la
célula, esto puede ser causado debido a contaminación del medio o del cultivo, a la mala
ejecución de la técnica o que el medio de cultivo estuviese suplementado con antibiótico
causando efecto inhibitorio sobre la bacteria, es necesario revisar los materiales utilizados y el
método para garantizar una mayor robustez ya que no se encontró evidencia de resistencia por
parte de las células frente a Salmonella sp, e incluso existen informes en los que Salmonella
sp. es capas de invadir múltiples líneas celulares y se considera que puede estimular más de
un camino de transducción de señales para promover su entrada a las células del hospedero.

CONCLUSIÓN

Se logro evaluar la capacidad de replicación intracelular de la bacteria Salmonella sp.

en células de cáncer cervicouterino (HeLa) obteniendo un porcentaje del 1.25, siendo
relativamente bajo para lo analizado en la literatura, ya que Salmonella sp. tiene distintos
factores de virulencia que le permiten el ingreso al interior de las células epiteliales, mostrando
en estudios previos de un 40 a 50 % de supervivencia intracelular, sin embargo nuestros
resultado pueden estar relacionados con la mala ejecución de la metodología implementada.

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LITERATURA CONSULTADA

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