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INTRODUCCIÓN
Dada la importancia que tienen las Proteínas y los Aminoácidos, en el desarrollo de todos
los seres vivos y en el sostenimiento de la vida, se hace imprescindible para el área de la
bioquímica no solo su estudio por medio de textos, sino también por medio de la asistencia
al laboratorio de bioquímica en donde podemos traducir el conocimiento escrito en
practicas reales que nos enseñen la aplicación practica de tales conocimientos y nos
permitan familiarizarnos con sus características más notables.
OBJETIVOS
Entre los objetivos más sobresalientes de esta tercera practica resaltamos los siguientes:
Comprender los conceptos básicos de Proteína y Aminoácido.
Conocer la importancia que tienen para los seres vivos.
Distinguir las tres principales reacciones químicas de los aminoácidos, a saber, las
debidas al grupo carboxilo, al grupo Amino y las del grupo R.
Conocer y aprender el uso de los diferentes tipos de reactivos y los métodos usados
con ellos para determinar el tipo de Aminoácido o Proteína presente en una
sustancia.
.
Referente teórico de proteínas y aminoácidos.
Las proteínas son uno de los principales componentes de todas nuestras células. Los
aminoácidos (compuestos orgánicos) son los ladrillos de construcción de las proteínas. Los
aminoácidos se agrupan de acuerdo con su comportamiento químico. La síntesis de las
proteínas ocurre mediante la unión entre sí de las cadenas de aminoácidos. Los distintos
aminoácidos imparten diferentes comportamientos químicos en la estructura de
las proteínas. Debido a la presencia de diferentes aminoácidos en las uniones peptídicas
las proteínas reaccionan con una variedad de compuestos formando productos coloreados.
Los aminoácidos tiene tres tipos de reacciones químicas importantes: (1) reacciones debido
a la presencia del grupo carboxilo (COO- ), (2) reacciones debidas al grupo amino (NH), y
(3) reacciones debido al grupo R.
Las reacciones debidas al grupo carboxilo y al grupo amino son generales y se dan para
todos los aminoácidos. Las reacciones del radical R son reacciones específicas; por
ejemplo, cisteína da una reacción para azufre, triptófano da ciertas reacciones de color
debido a que su molécula contiene el grupo indol, tirosina da otras reacciones de color
debido a su grupo fenólico, etc.
Existen reacciones de coloración que son específicas para aminoácidos de esas proteínas y
son importantes tanto para la detección como para el dopaje de aminoácidos y proteínas.
Existen también reacciones generales porque sirven para caracterizar grupos comunes a
todas las proteínas como grupos amino o uniones
PROCEDIMIENTO Y MATERIALES
Tabla 2 Materiales y Materiales y reactivos.
Reactivos Materiales Cantidad
Reactivo ninhidrina Tubos de ensayo (140 mm*14mm) 15
NaOH Gradilla 2
Sulfato cúprico (CuSO) Pinza para tubos 2
Ácido acético(CH3COOH) Pipetas Pauster con bulbo 4
Cloruro de sodio (NaCl) Beaker o vaso precipitados de 500 mL 5
albúmina Estufa 1
Ácido nítrico (HNO3) Cámara de flujo laminas 1
Hidróxido de sodio (NaOH) Pipetas vidrio 0.5 ml, 1 ml, 5 ml 10 ml. 4
Acetato de Plomo Pera de goma para pipetas 4
α Naftol Vidrios reloj grandes
Hipoclorito de sodio Probeta 100 ml
Reactivo de Hopkins- Cole Balón aforado de 25 ml
Ácido sulfúrico (H2SO) Agitador de vidrio
Reactivo de Millón Balanza analítica
Aminoácidos: Glicina, tirosina, Espectrofotómetro
triptófano, fenilalanina y arginina
Fenol Micropipeta 10 μL
Albumina de huevo Micropipeta 20- 200 μL
Agua destilada Micropipeta 20- 200 μL
Ácido fosfórico Micropipeta 200-1000 μL
Etanol 1 caja con puntas de 200 μL (amarillas)
para micropipeta
1 caja con puntas de 200 μL (amarillas)
para micropipeta
1 caja con puntas de 1000 μL (azules)
para micropipeta.
Agitador vórtex múltiple para tubos
REACCIÓN DE BIURET
Entre las reacciones coloreadas específicas de las proteínas, que sirven por tanto para su
identificación, destaca la reacción del Biuret. Esta reacción la producen los péptidos y las
proteínas, pero no los aminoácidos ya que se debe a la presencia del enlace peptídico CO-
NH que se destruye al liberarse los aminoácidos. El reactivo de Biuret lleva sulfato de
Cobre (II) y sosa. El Cu, en un medio fuertemente alcalino, se une con los enlaces
peptídicos formando un complejo de color violeta (Biuret) cuya intensidad de color
depende de la concentración de proteínas.
Tabla 3 Procedimiento a realizar para la reacción de Biuret.
Tubo Cantidad Reactivo Procedimiento Cada tubo
CuSO4 al 1% Preparar los tubos de
con 3 mL de
ensayo.
solución de + 4 a 5 gotas de solución
1
Albúmina de de CuSO4 al 1%
hidróxido
huevo 1%
sódico Añadir de 4 a 5 gotas de +
solución de CuSO4al 1%
con 3 mL de 2 ml hidróxido sódico
CuSO4 al 1%
solución de
aminoácidos +
2 Añadir 2 ml de solución de
Tirosina,
hidróxido hidróxido sódico al 20%.
Triptófano o
sódico
Fenilalanina.
CuSO4 al 1% Agitar para que se mezcle.
con 3 mL de +
3
Leche 1%
hidróxido Observar y tomar apuntes
sódico de los cambios.
CuSO4 al 1%
con 3 mL de con 3 mL de solución
+ respectiva
4 Aceite de
cocina hidróxido +
sódico
Agitar y observar color
CuSO4 al 1% violeta, azul o
amarillo.
con 3 mL de +
5
Glucosa
hidróxido
sódico
REACCIÓN DE AMINOÁCIDOS AZUFRADOS
Se pone de manifiesto por la formación de un precipitado negruzco de sulfuro de plomo. Se
basa esta reacción en la separación mediante un álcali, del azufre de los aminoácidos, el
cual al reaccionar con una solución de acetato de plomo, forma el sulfuro de plomo.
Tabla 4 Reacción De Aminoácidos Azufrados, Grupos SH.
Tubo Cantidad Reactivo Procedimiento Cada tubo
hidróxido sódico Preparar los tubos de ensayo. 2 ml
con 3 mL de hidróxido
solución de + sódico
1
Albúmina de acetato de plomo Añadir 2 ml de solución de
huevo 1% +
hidróxido sódico al 20%.
solución de
acetato de
con 3 mL de hidróxido sódico
solución de Añadir 10 gotas de solución plomo al 5%
aminoácidos + de acetato de plomo al 5%
2 +
Tirosina, acetato de plomo
Triptófano o
Fenilalanina. Calentar el tubo hasta
hidróxido sódico ebullición.
+
con 3 mL de
3
Leche 1% acetato de plomo Observar y tomar apuntes de
los cambios.
con 3 mL de
hidróxido sódico
solución
con 3 mL de + respectiva
4 Aceite de El precipitado de color
cocina acetato de plomo negruzco indica que se ha +
formado sulfuro de Calentar el
Plomo, utilizándose el azufre tubo hasta
hidróxido sódico
de los aminoácidos ebullición.
con 3 mL de +
5
Glucosa acetato de plomo
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS: MÉTODO DE
BRADFORD.
Existen varios métodos para determinar la concentración de proteínas de una muestra, tales
como la determinación de la absorbancia a 280 nm, o mediante la formación de derivados
coloreados de las proteínas, base de los métodos de BIURET o de LOWRY. En estos casos
se forma un complejo coloreado de cobre con el enlace peptídico; en el método de Lowry,
además del complejo anterior también se forma un derivado de las tirosinas que contribuye
a la absorbancia total.
1- Reactivo de Bradford
Azul de coomasie G-250 5 mg
Etanol 2.5 ml
Ácido fosfórico 5 ml
Agua Hasta 50 ml
Mezclar en el orden indicado, disolver con agitación y a continuación filtrar
2-Patrón de albúmina. Disolver 10 mg de albúmina bovina en 10 ml de agua destilada, con
lo que tenemos una disolución madre con una concentración de 1 mg/ml.
1-Preparar la curva patrón de albúmina bovina en un rango desde 0 hasta 60 µg; de tal
manera que el volumen final en cada tubo sea de 300 µl.
Mezclar para ello el volumen adecuado de la disolución madre de albúmina bovina de un 1
mg/ml y el correspondiente volumen necesario de agua, de acuerdo con la siguiente tabla.
METODO
1- Preparar la curva patrón de albúmina bovina en un rango desde 0 hasta 60 µg; de tal
manera que el volumen final en cada tubo sea de 300 µl. Mezclar para ello el
volumen adecuado de la disolución madre de albúmina bovina de un 1 mg/ml y el
correspondiente volumen necesario de agua, de acuerdo con la siguiente tabla.
2-
Tabla 5 Preparar la curva patrón de albúmina bovina en un rango desde 0 hasta.
µg (prot) 0 10 20 30 40 50 60
µl (alb) 0 10 20 30 40 50 60
µl (agua) 300 290 280 270 260 250 240
µl total 300 300 300 300 300 300 300
RESULTADOS
1- Elaboración de la recta patrón. Para ello representar en el papel milimetrado adjunto
la absorbancia de cada uno de los tubos que contenían albúmina bovina frente a la
cantidad de proteínas correspondiente. Si se dispone de una calculadora con
capacidad para hacer rectas de regresión, compruebe el coeficiente de correlación de
la recta obtenida. En cualquier caso determine la pendiente de la recta.
2- Para las tres diluciones del problema, interpolar la absorbancia obtenidas sobre la
recta representada para saber la cantidad de proteínas presentes en cada una de ellas.
Alternativamente, haga el cálculo mediante la pendiente de la recta.
incompatible
pequeño volumen condetergentes y
absorción de
absorción 0.1-100 de muestra,
280 nm tirosina y agentes
UV ug/ml rápido,
triptófano desnaturalizantes,
económico
alta variabilidad
Este trabajo practico nos ha permitido entender mejor la importancia de los aminoácidos y
las proteínas en los procesos celulares más importantes, incluido la replicación y
duplicación del ADN y su relación con las funciones de ARN. Además, pudimos ver en el
laboratorio los procesos obtenidos en las reacciones químicas usando reactivos para
determinar la composición proteica y aminoácida en las sustancias estudiadas