Universidad Nacional de Colombia

Facultad de ciencias- Departamento de química

Laura Nataly Mesa Lozano
Daniel Felipe Leal Herrera
Fecha de realización de la práctica: 13 de Marzo del 2018

Estudio cinético de la Fosfatasa Alcalina

Objetivos

General: Aprender los procedimientos básicos en enzimología, el diseño experimental y el

análisis de datos para el estudio cinético de las enzimas.
Objetivos específicos:
● Obtención de un extracto crudo, de fosfatasa alcalina a partir del intestino delgado
de vaca.
● Determinación de la actividad enzimática, midiendo la cantidad de fósforo liberadi a
partir del β-glicerolfosfato de sodio empleado como sustrato
● Determinación del tiempo óptimo de reacción, o de incubación y medición de la
velocidad inicial
● Determinación del efecto de la temperatura, el pH, la concentración de la enzima y
de la concentración del sustrato en la velocidad de reacción.
● Determinación del efecto de un inhibidor en la velocidad de reacción
● Determinación de los principales parámetros cinéticos para la fosfatasa alcalina

Marco teórico
La ​fosfatasa alcalina (​EC ​3.1.3.1​, CAS n.º ​9001-78-9 ) (50.000 - 60.000 Da) es una ​enzima
hidrolasa​responsable de eliminar grupos de ​fosfatos de varios tipos de moléculas como
nucleótidos​, ​proteínas y ​alcaloides​. El proceso de eliminar el grupo fosfático se denomina
desfosforilación​. Como sugiere su nombre, las fosfatasas alcalinas son más efectivas en un
entorno ​alcalino​.
La fosfatasa alcalina recibe el nombre de ​orto-fosfórico-monoéster hidrolasa​. Estas enzimas
proceden de la ruptura normal de las células sanguíneas y de otros tejidos, muchas de ellas no
tienen un papel metabólico en el plasma excepto las enzimas relacionadas con la coagulación y
con el sistema del complemento. La ​fosfatasa es una ​enzima clasificada dentro de las
hidrolasas​. Las fosfatasas alcalinas son enzimas que se encuentran presentes en casi todos
los tejidos del organismo, siendo particularmente alta en huesos, ​hígado​, ​placenta​, ​intestinos y
riñón​. Tanto el aumento, así como su disminución en plasma tienen significado clínico. Las
causas de un aumento de ALP:
● Enfermedad ósea de Paget, obstrucciones hepáticas, ​hepatitis​, mononucleosis,
hepatoxicidad por medicamentos y osteomalacia.
REACCIÓN DE DESFOSFORILACIÓN del beta-glicerofosfato:
Procedimiento:

Determinación de fósforo por medio de la reacción de Fiske-Subbarow: (1)

Existe una necesidad de un método para el fósforo suficientemente sensible Los métodos
más sensibles para determinar el fósforo en biológicos los materiales se basan en el color
formado por la reducción de un complejo de fosfomolibdato. Probablemente el más utilizado
método es el de Fiske y Subbarow, en el que la reducción se lleva a cabo con sulfito y ácido
aminonaftosulfónico. (2) Ammon y Hinsberg fueron los primeros en informar el uso de
ascórbico ácido para la reducción de fosfomolibdato, pero es difícil de calcular a partir de
sus datos la absorbancia molar de comparación con otros informes. Lowry y asociados
modificados el método anterior mediante el uso de una solución más fuerte de ácido
ascórbico con un tiempo mucho más largo de calentamiento a 37 ° C e informó de una
absorbancia molar de 25,000 en comparación con 4000 para el método de Fiske y
Subbarow.
La reacción de Fiske-Subbarow es un método colorimétrico basado en la reacción del
fósforo con ácido molibdico para obtener ácido fosfomolibdico. Luego, este ácido reacciona
con un reductor en medio ácido (ácido ascórbico), formando una mezcla de óxidos de
molibdeno de color azul los cuales tienen un máxima absorbancia a 660 nm.

La determinación de fósforo

Resultados

Concentración 8,89E-04 1,78E-03 2,67E-03 3,56E-03 4,44E-03

Abs (660nm) 0,366 0,467 0,522 0,651 0,761

Tabla 1. Datos para la calibración

Gráfica 1. Calibración de la curva

Enzima (mL) 0,05 0,10 0,20 0,30 0,40

Abs (660nm) 0,280 0,229 0,668 0,458 0,471

 Concentración 1,47E-04 2,39E-04 3,68E-03 1,77E-03 1,89E-03
de P(mg/ml )

Velocidad (mM 1,47E-05 2,39E-05 3,68E-04 1,77E-04 1,89E-04

P/min)
Tabla 2. Efecto de la concentración de la enzima en la determinación de fósforo

Gráfica 2. velocidad de la reacción en función de la variación de la concentración de la

enzima.

Tiempo (min) 2 5 10 15 25

Abs (660nm) 0,637 0,693 0,775 0,523 0,745

Concentración 3,40E-03 3,92E-03 4,66E-03 2,36E-03 1,88E-03

de P (mg/mL)

Velocidad (mM 3,40E-04 3,92E-04 4,66E-04 2,36E-04 1,88E-04

P/min)
Tabla 3. Datos del progreso para la reacción de la fosfatasa alcalina para la determinación
del tiempo óptimo de incubación
Gráfica 3. Curva de progreso para la reacción de la fosfatasa alcalina para la determinación
del tiempo óptimo de incubación, manteniendo constante la concentración de sustrato y de
enzima

pH Buffer 8,30 8,80 9,60 10,0

Abs (660nm) 0,259 0,350 0,848 0,227

Concentración 1,69E-03 2,44E-03 5,33E-03 1,16E-03

de P(mg/ml )

Velocidad (mM 1,69E-04 2,44E-04 5,33E-04 1,16E-04

P/min)

Tabla 4. Datos del efecto del pH

Gráfica 4. Velocidad de la reacción en función de la variación del pH del buffer.

 Temperatura 0 18 37 60 92
(ºc)

Abs (660nm) 0,346 0,754 0,812 0,796 0,772

Concentración 7,50E-04 4,47E-03 5,00E-03 4,85E-03 4,63E-03

de P (mg/mL)

Velocidad (mM 7,50E-05 4,47E-04 5,00E-04 4,85E-04 4,63E-04

P/min)
Tabla 5. Efecto de la temperatura para la determinación de fósforo

Gráfica 5. Velocidad de la reacción en función de la temperatura

Concentración de 43,0 50,0 60,0 75,0 100,0 150,0 300,0

sustrato (mM)

Abs (660nm) 0,712 0,719 0,776 0,857 0,970 0,972 0,987

Concentración de 4,09E-0 4,15E-0 4,461E-03 5,41E-03 6,44E-03 6,46E-03 6,59E-03

P (mg/mL) 3 3

Velocidad (mM 4,09E-0 4,15E-0 4,461E-04 5,41E-04 6,44E-04 6,46E-04 6,59E-04

P/min) 4 4
Tabla 6. Efecto de la concentración de sustrato en la determinación de fósforo

Concentración 43,0 50,0 60,0 75,0 100,0 150,0 300,0

de sustrato
(mM)

Abs (660nm) 0,651 0,681 0,714 0,780 0,870 0,910 0,95

Concentración 3,53E-03 3,80E-03 4,10E-03 4,71E-03 5,53E-03 5,89E-03 6,26E-04

de P (mg/mL)
 Velocidad (mM 3,53E-04 3,80E-04 4,10E-04 4,71E-04 5,53E-04 5,89E-04 6,26E-04
P/min)
Tabla 7. Efecto de la concentración de sustrato en la determinación de fósforo con la
presencia de un inhibidor (EDTA)

Gráfica 6. Efecto de la concentración de sustrato en la velocidad de reacción, la tendencia

azul representa la reacción sin inhibidor y a su vez la tendencia naranja es con presencia de
EDTA.

1/[S] 0,0232 0,0200 0,0166 0,0133 0,0100 0,0060 0,0030

1/V (sin 2444,8 2253,8 2139,3 1869,3 1722,4 1536,5 1422,7

inhibidor)

1/ V (con 2830,0 2626,5 2434,1 2122,8 1807,6 1695,7 1596,91

inhibidor)
Tabla 8. Linealización de los datos para la determinación de la velocidad máxima (Vmax) y
la constante de Michaelis- Menten (Km)
Gráfica 7. Gráfica de Linerweaver-Bruck para la reacción sin inhibidor (azul) y con inhibidor
(naranja).

Reacción Vmax (mM P/min) Km (mM P)

Sin inhibidor 8,27E-04 43.69

Con inhibidor 7,85E-04 52.17

Tabla 9. Determinación de las constantes cinéticas
*Poner cálculos
Como m=Km/Vmáx y b= 1/Vmáx

Análisis

Con el fin de analizar el fosfato liberado por la hidrólisis del enlace tipo ester del
beta-glicerolfosfato se hizo uso del método de Fiske- Subbarow, se realizó la curva de
calibración cuyos datos de absorbancia fueron obtenidos midiendo a una longitud de onda
de 660 nm, se encuentran el la tabla 1 y en la gráfica 1.

Imagen 1. ​Azul obtenido gracias a la formación de óxidos de molibdeno para la cuantificación de fosfatos por
medio del método Fiske-Subbarow.
Respecto a las condiciones que requiere la velocidad de reacción para que se lleve cabo de
manera óptima, se tuvo en cuenta en qué casos específicos de cada variación de estudio la
determinación de la mayor cantidad de fósforo mediante el método de Fiske-Subbarow.
Para la primera parte se varió la concentración de enzima, como se evidencia en la Gráfica
2. se obtuvo un valor de 3,68E-04 (mM P/min) a una concentración de 0,200 mg/mL de la
enzima bajo condiciones experimentales de 10 minutos de reacción, solución de buffer de
borax cuyo n pH fue de 9,60 y 0,4 mL de sustrato 0,1 M. se asocia dicha cantidad a que es
la concentración a la cual se satura el sistema y por ende es la máxima capacidad de
enzima que lograr reaccionar con la cantidad específica del sustrato, este tipo de reacción
se da mediante la formación de un complejo Enzima-Sustrato el cual es una especie
intermediaria que permite la generación de un producto y la recuperación de la enzima.

El tiempo de reacción en las enzimas es de gran importancia, pues según este la

efectividad del proceso varía como se evidencia en la Gráfica 3. se logra pensar que a
medida que pasa el tiempo mayor cantidad de fósforo inorgánico se va a determinar pero lo
anterior es erróneo puesto que la enzima tienen un tiempo en el cual es efectiva bajo las
condiciones en la que se encuentre. El tiempo de reacción afecta la cantidad de fósforo
inorgánico producido debido a que la acumulación de productos de reacción retarda la
actividad de algunas enzimas y como lo podemos observar en la gráfica 3 a medida que
transcurre el tiempo la cantidad de fósforo producido disminuye, esto puede deberse a que
la combinación entre el producto y el sitio activo de la enzima lo cual o bien puede retardar
la combinación enzima sustrato ó como lo podemos observar en la gráfica 3 promover la
reacción inversa, esto lo decimos en base a que a los 10 minutos de reacción se obtiene
una concentración de 4.66 *10​-3 mg P/ mL y a los 15 minutos se obtiene una cantidad de
fósforo menor del producido a los 10 minutos, lo cual nos indica que la reacción fue
revertida.

Para la determinación del pH óptimo de la enzima se lograron obtener los datos ubicados en
la Tabla. 4, esta variación de acidez de los 4 buffer tuvo un comportamiento característico
como se ilustra en la gráfica 4. a pesar de que los pH estuvieron bastante cercanos la
diferencia de velocidades en la reacción fue bastante notable, este hecho se debe a que la
fosfatasa alcalina contiene aminoácidos ionizables que varían su carga ya sea positiva,
negativa o neutra, además que este efecto se relaciona directamente con la conformación
de la enzima de modo que según la variación de pH la enzima tendrá alguna geometría que
le permitan realizar el acoplamiento al sustrato de una mejor manera, asimismo tendrá
disposiciones que dificulte la actividad enzimática y por ende la enzima no actuará en algun
pH que no sea favorable, para este caso se determinó que el pH óptimo fue de de 9,60 en la
cual se obtuvo una concentración de fósforo inorgánico de 5,33E-03 y la mayor velocidad de
reacción también se obtuvo a este pH la cual fue de 5,33E-04 (mM P/min). (5)

Con respecto al estudio del efecto de la temperatura se realizó la reacción de

desfosforilación a pH 9.6 durante 10 minutos con β-glicerolfosfato 0.1M como sustrato
variando la temperatura de trabajo, como se puede evidenciar en la tabla 5 y en la gráfica 5.
Estos datos evidencian que efectivamente la velocidad de reacción aumenta a medida que
se aumenta la temperatura como es usual en las reacciones químicas, pero como se
evidencia en la gráfica 5 a medida que se aumenta la temperatura disminuye la velocidad
de reacción, esto es debido a que como sabemos la fosfatasa alcalina es una glicoproteína
y como cualquier proteína puede perder su estructura nativa por acción de la temperatura lo
cual a su vez afecta la actividad enzimática de ésta.

Gracias a los datos obtenidos podemos comparar las velocidades de reacción a 0, 18, 37,
60 y 92°C, dónde podemos observar que la temperatura óptima de trabajo de la fosfatasa
alcalina es de 37°C, a esta temperatura la velocidad de reacción aumenta sin alterar la
enzima, a mayores temperatura ésta se ve afectada. Este hecho es de gran importancia en
la industria de alimentos, para análisis de calidad de la leche después del proceso de
pasteurización se analiza la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina, sí se realizó un
proceso de pasteurización efectivo la fosfatasa no tendrá actividad, esto debido a que a la
temperatura de pasteurización esta enzima pierde su actividad, la temperatura de
pasteurización en el proceso VAT es de 63°C durante 30 minutos, lo cual ronda la
temperatura de estudio de 60°C dónde podemos observar la disminución de la velocidad de
reacción.

Otro aspecto estudiado fue la concentración del sustrato dónde como podemos observar
mediante la tabla 6 que a mayor concentración de sustrato aumenta la velocidad de
reacción pero desde ciertas concentraciones de sustrato la velocidad de la reacción tiende a
ser constante ya que la enzima puede reaccionar con cierta concentración de sustrato hasta
que se satura, por lo cual tiende a una velocidad de reacción constante la cual es la
velocidad máxima de la reacción como se puede observar en la gráfica 6 con tendencia
azul.
De igual forma se estudió el efecto de un inhibidor en la reacción enzimática, el inhibidor
utilizado fue EDTA, el cual quela el zinc que compone la fosfatasa alcalina y retrasa su
actividad de forma acompetitiva con el sustrato, es decir, ​donde la unión del inhibidor con la
enzima reduce su actividad pero no afecta la unión con el sustrato. Como resultado, el
grado de inhibición depende solamente de la concentración de inhibidor. Los resultados de
este experimento se encuentran en la tabla 7 y están representados en la gráfica 6 en la
tendencia naranja, dónde podemos observar que disminuye la velocidad de reacción lo cual
se traduce a la disminución de la actividad enzimática por acción del inhibidor.

Finalmente fueron estudiados los parámetros cinéticos de la enzima sin y con la presencia
del inhibidor, por medio de la linealización de los datos con el fin de hallar la velocidad
máxima y la constante de Michaelis-Menten (tabla 8), en la gráfica 7 podemos observar esta
linealización de la reacción sin inhibidor (azul) y con inhibidor (naranja) obteniendo los
resultados de la tabla 9, en la cual se puede evidenciar que ​para la reacción sin inhibidor se
obtuvo una Vmáx de 8.27E-04 mM P/min mientras que con inhibidor nunca se logrará llegar
a esta velocidad sino hasta 7.85E-04 mM P/min
El dato de Km se puede comparar con las Km reportadas en la literatura para la fosfatasa
alcalina de mucosa bovina intestinal como se puede observar en la tabla 10.

Km (mM P)

Km experimental para β-glicerolfosfato sin 43.69

inhibidor

Km reportada para fosfoenolpiruvato 19.0

Tabla 10. ​Comparación entre el Km hallada experimentalmente y Km reportada en literatura

(5).
Aquí podemos ver que claramente las Km no son parecidas porque son sustratos diferentes
pero hay que tener en cuenta que tienen el mismo orden de magnitud, como sabemos Km
nos habla de la afinidad que tiene la enzima con el sustrato, entre menor sea el valor de la
constante de Michaelis-Menten mayor será la afinidad de la enzima por el sustrato y por lo
tanto será más específica. Tenemos que Km para la reacción sin inhibidor es de 43.69 mMP
mientras que en presencia de inhibidor se obtuvo un Km de 52.17 mMP, como
anteriormente lo dijimos a mayor Km menor es la especificidad lo cual en este caso es
generado por la acción del inhibidor.

Conclusiones
 1. Por medio del método Fiske-Subbarow se logró la cuantificación de fósforo producto
de la desfosforilación del β-glicerolfosfato por acción de la fosfatasa alcalina de
mucosa de intestino bovino.
2. Se logró determinar que el tiempo óptimo de reacción es de 10 minutos.
3. Se observó que a medida que aumenta la temperatura aumenta la velocidad de
reacción pero como la fosfatasa alcalina en una enzima la temperatura puede alterar
su estructura desnaturalizándola y por lo tanto afectar su actividad, se encontró que
la temperatura óptima de reacción es de 37°C.
4. Se encontró que el pH óptimo de reacción es de 9.60.
5. Se observó que la concentración de la enzima aumenta la velocidad de reacción,
pero se genera una autoinhibición que disminuye la velocidad de reacción a medida
que se aumenta la concentración de la fosfatasa alcalina
6. Se observó que a mayor concentración de sustrato aumenta la velocidad de
reacción hasta el punto en que la enzima se satura y se llega a una velocidad
máxima.
7. Se encontraron valores de velocidad máxima de 8.27E-04 y 7.85E-04 para la
reacción sin y con inhibidor respectivamente.
8. A su vez se encontraron valores de Km de 43.69 y 52.17 para la reacción sin y con
inhibidor respectivamente, por lo que concluimos que la acción de un inhibidor
disminuye la afinidad de la enzima por el sustrato.
Bibliografía
1. Chen, P., Toribara, T. and Warner, H. (1956). Microdetermination of Phosphorus.
Analytical Chemistry​, 28(11), pp.1756-1758.
2. Fiske, C. H., Subbarow, Y., J Biol. Chem. 66, 375 (1925)
3. Lineweaver, H. and Burk, D. (1934). The Determination of Enzyme Dissociation Constants.
Journal of the American Chemical Society​, 56(3), pp.658-666.
4. Brenda-enzymes.org. (2018). ​BRENDA - Information on EC 3.1.3.1 - alkaline phosphatase​.
[online] Available at: https://www.brenda-enzymes.org/enzyme.php?ecno=3.1.3.1 [Accessed
19 Mar. 2018].
5. Sigmaaldrich.com. (2018). [online] Available at:
https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Datasheet/10/p0114dat
.pdf [Accessed 19 Mar. 2018].
6. Es.wikipedia.org. (2018). ​Cromatografía de inmunoafinidad​. [online] Available at:
https://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa_de_inmunoafinidad [Accessed 19 Mar.
2018].
7. FOSFATASA ALCALINA » Enfermedades, F. (2018). ​FOSFATASA ALCALINA »
Enfermedades, Función y Valores​. [online] Fosfatasa alcalina. Available at:
https://www.fosfatasaalcalina.org/ [Accessed 19 Mar. 2018].
8. Scribd. (2018). ​Fundamentos de Genética Aplicada​. [online] Available at:
https://es.scribd.com/doc/25597995/Fundamentos-de-Genetica-Aplicada [Accessed 19 Mar.
2018].

Cuestionario
 1. ¿Cuales son las criticas que se hacen al método de lineweaver-Bruck propuesto en
1934?
Como requiere de dobles inversos, pequeños errores experimentales pueden conducir a
grandes errores.
A altas concentraciones los puntos se aglutinan al principio de la gráfica

2. ¿En qué consiste el método propuesto por Eisenthal y Cornish-Bowden?

es una representación lineal directa en la cual transforman la ecuación de Michaelis-Mendel
en una ecuacion canonica de la recta en la cual Vmax y Km pasan a ser variables y la
concentración de sustrato y la velocidad pasan a ser constantes

3​. ¿Mediante qué código se identifica la fosfatasa alcalina y que indica cada número de su
identificación?

3.1.3.1 - alkaline phosphatase

Los cuatro dígitos correspondientes al nombre
Parte del Clase Sub- clase Sub,sub- clase # de lista
nombre

Número 3 1 3 1

Significado Es una enzima Hidroliza enlace Tipo de sustrato Número de

Hidrolasa tipo éster serie

4. ¿qué parámetros pueden afectar la efectividad de una columna de inmunoafinidad?

Las columnas de inmunoafinidad contienen anticuerpos monoclonales capaces de “atrapar” y
purificar micotoxinas en sustratos difíciles como el café, especias, algodón y cerveza.

Los ​anticuerpos son proteínas que se unen firmemente a sus antígenos. Los vertebrados la
producen como un medio de defensa contra las infecciones. Cada animal puede fabricar miles
de millones de moléculas de anticuerpos diferentes. Cada anticuerpo reconoce su antígeno con
gran especificidad. Justamente esta propiedad es fundamental en la utilización de esta técnica.
El procedimiento puede separarse en los siguientes pasos:
1º: Hay una columna con anticuerpos anti-A.
2º: Se adicionan las moléculas ​antígeno​-A, y las no deseadas.
3º: Eluyen las moléculas no deseadas quedando las antígeno-A en los anticuerpos, más un
poco de moléculas no deseadas.
4º: Se lava la columna y quedan solo los anticuerpos más su molécula antígeno-A.
5º: Finalmente eluye la molécula antígeno-A(que en este caso se quería separar).
La alta especifidad lograda con estos anticuerpos permite obtener extractos limpios para su
posterior detección por métodos cromatográficos (TLC, HPLC) o fluorometría. Teniendo en cuenta
que los anticuerpos son proteínas esta cromatografía puede ser afectada por la T, pH,
concentración del anticuerpo y la concentración del antígeno.

5. ¿por que no es aconsejable el análisis en orina de la fosfatasa alcalina y de otras

enzimas para la diagnosis genitourinaria?

6. en enfermedades pancreáticas y óseas ¿como se afectan los niveles de fosfatasa

alcalina?
Algunas veces, los valores aumentan por razones que no tienen que ver con enfermedades, pueden indicarnos
problemas intestinales, una de las principales causas que podemos percibir son dolores abdominales, vómitos,
mareos, y diferentes enfermedades que dañan directamente el hígado.
● Enfermedades hepáticas: hepatitis, hígado graso, cirrosis, colangitis
● Leucemia
● Hipotiroidismo
● Tumores: ováricos, testicular, pulmonar, laríngeo

Los principales síntomas de unos niveles bajos son el cansancio, fatiga, taquicardia, problemas de
estreñimiento y de respiración. Las causas de la disminución de valores pueden ser:

● Anemia
● Leucemia
● Deformaciones en los huesos
● Falta de Zinc

7. ¿como se puede purificar la fosfatasa alcalina de la leche?

Teniendo en cuenta que l​os anticuerpos son glucoproteínas del tipo gamma globulina
(como la fosfatasa alcalina). Pueden encontrarse de forma soluble en la sangre o en
otros fluidos corporales de los vertebrados, disponiendo de una forma idéntica que
actúa como receptor de los linfocitos B y son empleados por el sistema inmunitario para
identificar y neutralizar elementos extraños tales como bacterias, virus o parásitos.
Se puede purificar por medio de la utilización de una columna de inmuno afinidad, de forma
que en la columna se encuentre el antígeno de la fosfatasa alcalina, como por ejemplo el
beta-glicerolfosfato, de esta manera el anticuerpo (la fosfatasa alcalina) se une
selectivamente a éste quedando retenida en la columna y así siendo separada de las
demás sustancias, porteriormente se eluye la fosfatasa alcalina retenida
8. ¿que son anticuerpos policlonales y cómo se producen anticuerpos contra fosfatasa
alcalina de leche? ¿que utilidad tienen?

Anticuerpo policlonal: Son anticuerpos derivados de diferentes tipos de linfocitos. Los

anticuerpos policlonales son una mezcla de inmunoglobulinas secretados en contra de un
antígeno concreto.

9. ​¿con que objetivo se emplea fosfatasa alcalina en métodos de ingeniería genética?

las fosfatasas son ​enzimas que elimina grupos fosfato del extremo 5', y origina por lo tantomoléculas con grupos
– OH en todos los extremos (en los 5' y en los 3'). De este modo seevita que moléculas fragmentadas puedan unirse de
nuevo, ya que la ligasa no reconoce losextremos 5' OH