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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE GUERRERO


FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO

BACTERIOLOGIA MEDICA I

CUARTO SEMESTRE

RESPOSABLE:

DRA. NATIVIDAD CASTRO ALARCÓN


DRA. MARIA CRISTINA SANTIAGO DIONISIO
QBP. LEONEL LOAEZA LOZANO

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

Chilpancingo. Gro., Febrero de 2019

PRESENTACIÓN

Este manual fue elaborado para los estudiantes del cuarto semestre de la carrera
de Químico Biólogo Parasitólogo, con el objetivo de dar los elementos teórico-prácticos
necesarios para el aislamiento e identificación de bacterias patógenas buscadas
rutinariamente en diversas muestras biológicas, que permitan el diagnóstico clínico y de
laboratorio de las enfermedades infecciosas.
El manual incluye prácticas de laboratorio que permite conocer las características
morfológicas, medios de cultivo y pruebas bioquímicas que permiten la identificación de
las bacterias más comúnmente aisladas en el laboratorio clínico. En cada práctica se
describen la competencia que se persigue, los aspectos teóricos que se consideran
importantes e indispensables para el diagnóstico, el material necesario, el procedimiento y
la manera de reportar los resultados.
Las prácticas se han organizado de acuerdo al programa de la materia de
Bacteriología Médica I y su diseño en función de los recursos con que cuenta el
laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias Químico Biológicas de la
Universidad Autónoma de Guerrero, que son similares a los de los laboratorios que
existen en nuestro Estado.
Además cuenta con un anexo para la interpretación de pruebas bioquímicas
indispensables en la identificación, instrucciones para la preparación de reactivos,
colorantes, medios de cultivos y tinciones. Por ello considero que este manual es un
apoyo importante en las prácticas profesionales en el laboratorio clínico.

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

NORMAS DE BIOSEGURIDAD PARA EL LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA


MÉDICA.
INTRODUCCIÓN
El trabajo en el laboratorio de bacteriología médica debe ser considerado de alto
riesgo para todo el personal de laboratorio debido al manejo de muestras clínicas
potencialmente contaminadas con patógenos microbianos y de cultivos de
microorganismos obtenidos a partir de dichas muestras clínicas. La exposición del
personal de laboratorio a este riesgo debe ser controlada mediante un plan de
bioseguridad en el laboratorio clínico. Los riesgos biológicos infecciosos más comunes en
el laboratorio clínico incluyen cultivos de microorganismos (bacterias, micobacterias,
hongos, virus y parásitos) en altas concentraciones, muestras clínicas de origen humano
o animal conteniendo agentes infecciosos y otros riesgos como toxinas, alérgenos,
productos recombinantes, etc.
Es importante considerar que existen cuatro elementos necesarios para que se inicie
una infección; un hospedero susceptible, un agente infeccioso, la concentración de dicho
agente infeccioso (dosis infectante), y una ruta de transmisión. Esta última es la única que
puede ser controlada por medio de normas de bioseguridad y por lo tanto es
indispensable brindarle especial atención a las rutas más comunes de transmisión; oral,
respiratoria, percutánea y contacto directo con la piel y/o las mucosas.
Toda muestra clínica; fluidos corporales, tejidos y cultivos microbianos deben ser
considerados como infecciosos para el personal de laboratorio y deben ser manipulados
bajo determinadas medidas de contención, las cuales incluyen adecuadas prácticas
microbiológicas, la utilización de barreras físicas, un adecuado diseño de laboratorio y
cámaras de bioseguridad. El uso de vacunas seguras y eficaces puede proporcionar un
mecanismo adicional para la reducción de las infecciones ocupacionales.
El establecimiento de los programas de bioseguridad en el laboratorio de bacteriología
médica es responsabilidad de los administradores del mismo. Sin embargo, es importante
tener claro que no es posible crear un ambiente de laboratorio saludable y seguro sin que
cada una de las personas que laboran en él no asuma su cuota de responsabilidad hacia
la seguridad en el laboratorio.

1. Clasificación de microorganismos por grupos de riesgo


El concepto de grupo de riesgo fue desarrollado como una manera de clasificar los
diferentes tipos de microorganismos (bacterias, virus, hongos, parásitos) dependiendo del
grado de virulencia para el ser humano, animales y plantas. Se han definido cuatro grupos
de riesgo de microorganismos, cuyas características se indican a continuación:

Grupo de riesgo Características de los microorganismos1

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

1 En este grupo se incluyen microorganismos


que durante mucho tiempo han sido
estudiados y/o cultivados bajo diversas
circunstancias y se ha demostrado, con base
al conocimiento científico actual, que no
representan ningún riesgo para la salud
humana y para su medio ambiente, aunque
algunos de estos microorganismos podrían
representar algún riesgo para niños o para
adultos inmunosupresor: Bacillus subtilis,
cepas no patógenas de Escherichia coli.
2 En este grupo se incluyen microorganismos
de moderado riesgo potencial para el personal
de laboratorio y que usualmente están
asociados con enfermedad en seres
humanos: Vibrio cholerae, Salmonella spp.,
Shigella spp., Staphylococcus spp.,
Haemophilus spp., cepas patógenas de
Escherichia coli.
3 En este grupo se incluyen microorganismos
altamente infecciosos y que pueden causar
graves enfermedades sistémicas en seres
humanos: Mycobacterium tuberculosis,
Coxiella burnetii, Brucella spp.
4 En este grupo se incluyen microorganismos
exóticos, altamente infecciosos, causantes de
enfermedades mortales en el ser humano
para los cuales no existe un tratamiento
efectivo: virus Ebola, virus Hanta.

2. PROCEDIMIENTOS OPERATIVOS A SEGUIR EN EL LABORATORIO DE


BACTERIOLOGÍA MÉDICA.

Todo el personal debe utilizar siempre Bata de manga larga hasta la altura de la rodilla y
cerrada, esta debe ser considerada como material contaminado, lavarse las manos
periódicamente; cada vez que entren en contacto con material infeccioso y siempre que
se haga abandono del área del laboratorio. Se debe evitar tocarse, frotarse o rascarse
mientras se permanezca en el laboratorio.
El material infeccioso, como muestras clínicas y cultivos microbianos, deben estar
adecuadamente rotulados, indicando en forma precisa el contenido del recipiente y deben
ser descontaminados antes de ser descartados. Todos los procedimientos deben ser
realizados muy cuidadosamente de manera que se reduzca al máximo la formación de
aerosoles. Los aerosoles pueden ser producto de la abertura de placas de Petri o
contenedores de material infeccioso, la inoculación de una muestra clínica o un cultivo,
manipulación de pipetas, centrifugaciones o la esterilización a la llama de las asas
bacteriológicas.
Está prohibido pipetear con la boca y comer, beber, maquillarse o fumar en el área de
laboratorio, así como almacenar o preparar alimentos para consumo humano. Igualmente,
todos los artículos personales deben permanecer fuera del área de laboratorio.

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

Los accidentes en el laboratorio deben ser abordados con calma y ser debidamente
reportados, en caso de ocurrir un derrame de material infeccioso, se debe despejar la
zona y usando guantes, se debe colocar un papel absorbente impregnado con un
desinfectante (alcohol 70º-yodado) sobre el material. Si cae material contaminado sobre
su piel, se debe proceder a desinfectar utilizando alcohol 70º-yodado, para luego lavar
abundantemente con agua y jabón y aplicar nuevamente la desinfección. Si se presenta
una contaminación de los ojos, proceda a enjuagar abundantemente con agua. En caso
de presentarse un incendio se debe utilizar un extintor para fuegos tipo ABC y si una
persona en el laboratorio se está incendiando, se le debe cubrir con una bata mojada para
apagar las llamas.

3. MANEJO DE LOS DESECHOS INFECCIOSOS.


Los residuos generados en los laboratorios microbiológicos y clínicos presentan
riesgos y dificultades especiales en su manejo debido, fundamentalmente, al carácter
infeccioso de algunos de sus constituyentes. La heterogeneidad de su composición
contribuye a acrecentar los riesgos, especialmente en el caso de desechos del laboratorio
bacteriológico, donde existen cultivos con bacterias patógenas, objetos punzocortantes
como agujas de jeringas, trozos de vidrio o plástico, sangre humana y sus derivados,
residuos de muestras para cultivo y otros.
Los desechos deben ser manejados en una forma racional, dependiendo del nivel de
bioseguridad del laboratorio, el tipo de material que constituye el desecho, el tipo de
tratamiento aplicado al desecho y la forma en que los desechos tratados son eliminados
de la institución. Por convenio se utiliza el color amarillo para designar el desecho
infeccioso del nivel de bioseguridad 2, mientras que el color rojo se usa para designar el
desecho infeccioso del nivel de bioseguridad 3.
Se debe contar con contenedores o recipientes de tamaño, forma y material
adecuados, con el fin de asegurar un fácil manejo y limpieza. Se considera óptimo el uso
de recipientes de metal, plástico o cartón, de estructura rígida y con tapa. En esos
recipientes se colocan bolsas plásticas capaces de soportar el proceso de autoclaves. Los
desechos deben ser tratados tan pronto como sea posible y si es necesario almacenarlos
se debe disponer de un área de almacenamiento para desechos infecciosos de acceso
restringido.
La esterilización de los desechos infecciosos mediante el uso de vapor saturado
(autoclaves) es el método más comúnmente utilizado. La velocidad de destrucción
depende del tipo de estructura a destruir (célula vegetativa o espora), del tiempo, la
temperatura y de la presencia de humedad. Las condiciones más recomendadas se
obtienen con un tratamiento de los desechos a 121°C (15-18 libras de presión) por un
período de 15 a 20 minutos, dependiendo del volumen de los desechos infecciosos a
esterilizar.
En el caso de desechos líquidos que han sido tratados se descartan directamente en
los sistemas de desagüe a un tanque de depuración para seguir a los sistemas sanitarios
convencionales. Los desechos sólidos procedentes de incineradores y autoclaves se
deben descartar en basureros de metal o plástico rígido, provisto de tapa para su
posterior transporte a rellenos sanitarios.

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

ÍNDICE
Número Título Págs.
1 Morfología colonial, tinción de Gram y uso del microscopio………… 10
2 Estafilococos (Staphylococcus)………………………………………… 14
3 Estreptococos (Streptococcus)………………………………………… 19
4 Morfología colonial de Enterobacterias………………………………… 26
5 Identificación Bioquímica de Enterobacterias. ………………………… 29
6 Identificación de Enterobacterias mediante sistemas miniaturizados
API 20E. …………………………………………………………………… 31
7 Bacilos Gram negativos no fermentadores…………………………….. 34
8 Bacilos Gram negativos oxidasa positivos y fermentadores de
lactosa……………………………………………………………………… 37
9 Género: Haemophilus spp……………………………………………….. 40
10 Bacilos Gram positivos (Bacillus subtilis y listeria spp)………………... 43
11 Corinebacterias o exudado faríngeo…………………………………… 49
12 Bacilos Gram positivos poco frecuente (microaerofílicas)……………. 51
13 Género: Neisserias saprofitas…………………………………………… 56
14 Bacterias Anaerobias……………………………………………………… 59
15 Tinción de Ziehl Neelsen ………………………………………………… 62
Anexo1 Instrucciones para preparar reactivos y colorantes…………………… 64
Anexo2 Nefelómetro de McFarland……………………………………………… 66
Anexo 3 Tinciones…………………………………………………………………… 67
Anexo 4 Preparación de medios de cultivo……………………………………….. 68
Anexo 5 Interpretación de Pruebas Bioquímicas………………………………… 81
Referencias Bibliográficas……………………………………………… 92

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

COMPETENCIAS

Aplica los fundamentos teórico-prácticos de la bacteriología en el cultivo, aislamiento e


identificación de los principales agentes patógenos, mediante el uso de técnicas
convencionales para contribuir al diagnóstico, con actitud propositiva y siguiendo las
normas de bioética, bioseguridad y de control de calidad pertinentes.

Conocimientos Habilidades Actitudes y valores


Analiza la importancia de las
bacterias patógenas dentro Aplica la taxonomía
de las enfermedades bacteriana y diversas
infecciosas y reconoce el técnicas de aislamiento e
papel del microbiólogo en el identificación bacterias de Compromiso.
laboratorio de microbiología interés clínico, siguiendo
médica, así como su medidas de seguridad y
organización y medidas de control de calidad.
seguridad.
Identifica las características
morfológicas, bioquímicas y Utiliza las diferentes técnicas
patogénicas de las bacterias de laboratorio para el
aisladas frecuentemente en aislamiento e identificación
de las principales bacterias Compromiso.
el laboratorio de
microbiología, haciendo uso de interés médico, siguiendo
de técnicas convencionales normas de bioseguridad en el
de identificación. laboratorio de microbiología.

Conoce los grupos


bacterianos de crecimiento Diferencia técnicas
fastidioso que causan convencionales y
enfermedades infecciosas, y moleculares para el Compromiso.
los métodos apropiados para aislamiento e identificación
su aislamiento e de bacterias fastidiosas de
identificación, para contribuir interés médico.
al diagnóstico.
Conoce los mecanismos de Aplica procedimientos para
resistencia de las bacterias a determinar la susceptibilidad
los antibióticos, así como las a antimicrobianos e interpreta
pruebas utilizadas para de resultados que orientan al Compromiso.
determinación de la tratamiento, cumpliendo con
susceptibilidad a antibióticos controles de calidad.
para contribuir al tratamiento
de enfermedades infecciosas

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

INSTRUCCIONES PARA LA ELIMINACIÓN APROPIADA DE LOS RPBI

 Los residuos peligrosos biológicos infecciosos en lo sucesivo (RPBI), son aquellos que
se generan durante las actividades asistenciales a la salud de humanos o animales en
los centros de salud, laboratorios clínicos o de investigación, bioterios, centros de
enseñanza e investigación, principalmente; que por el contenido de sus componentes
puedan representar un riesgo para la salud y el ambiente.

 Los desechos deben ser identificados inmediatamente, después del procedimiento que
los generó, en el sitio donde se originaron y por el personal que lo generó. Para su
correcta identificación y posterior envasado, la separación de los residuos se debe
realizar de acuerdo a su estado físico (líquido y sólido), y su tipo como se indica a
continuación:

ESTADO
TIPO DE RESIDUO ENVASADO COLOR
FÍSICO
Sangre Líquido Recipientes Herméticos Rojo
Cultivos y Cepas de Agentes
Sólido Bolsa de Plástico Rojo
Infecciosos
Residuos No Anatómicos Sólido Bolsa de Plástico Rojo
Patológico Sólido Bolsa de Plástico Amarillo
Patológico Líquido Recipientes Herméticos Amarillo
Objetos Punzocortantes Sólido Recipientes Rígidos Rojo

 Los RPBI deben estar marcados con el símbolo universal de residuo peligroso-
biológico-infeccioso. Los recipientes deben permitir verificar el volumen máximo de su
capacidad. Todo aquel material que se considere RPBI deberá estar de acuerdo a su
tipo en una bolsa o recipiente de color específico, según lo indica la norma.

 RESIDUOS SÓLIDOS EN BOLSA ROJA: Los no anatómicos como gasas torundas o


campos saturados, empapadas o goteando líquidos corporales y secreciones de
pacientes con tuberculosis o fiebres hemorrágicas. Así como Utensilios desechables
utilizados para contener, transferir, inocular y mezclar cultivos de agentes biológico
infecciosos y muestras biológicas para análisis (Hisopos, jeringas, cajas Petri, medios
de cultivo, etc)

 RESIDUOS PUNZOCORTANTES RECIPIENTE RÍGIDO: Agujas, Cubreobjetos y


portaobjetos, Hojas de bisturí, Lancetas y Pipetas Pasteur.

 RESIDUOS LIQUIDOS CONTENEDOR HERMÉTICO ROJO: La sangre y sus


componentes en su forma líquida, así como sus derivados

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

 Con los cambios en la norma no se consideran RPBI los siguientes: Torundas y gasas
con sangre seca o manchadas de sangre, Material de vidrio utilizado en laboratorio
(matraces, pipetas, cajas de Petri), Muestras de orina y excremento para análisis de
laboratorio, Tejidos, partes del cuerpo en formol.

 Para lograr la desinfección se colocan las bolsas rojas resistentes al calor húmedo y
bien cerradas, en el autoclave a 121° centígrados con 15 libras de presión durante 30
minutos, en este caso las cajas de Petri desechables y otros dispositivos de plástico
utilizados en el laboratorio quedan “irreconocibles” (Perdida de las características
físicas y biológico-infecciosas del objeto para no ser reutilizado). Una vez estériles e
irreconocibles se podrán disponer como basura común.

 El autoclave utilizada para el tratamiento de los RPBI no puede ser utilizada para
esterilizar otros instrumentos médicos, por lo que se recomienda ubicar un sitio
especial para instalar el autoclave sólo para el tratamiento de estos residuos, una
sugerencia es colocarlo dentro del mismo almacén temporal exclusivo para RPBI.

 Los RPBI que hayan sido tratados podrán disponerse en los camiones recolectores de
basura común, mientras que los RPBI sin tratamiento deberán enviarse a empresas
recolectoras autorizadas.

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

PRACTICA No. 1
MORFOLOGIA COLONIAL, TINCIÓN DE GRAM Y USO DEL MICROSCOPIO

HABILIDADES:
- El estudiante diferencia las características morfológicas macroscópicas y
microscópicas de las bacterias mediante tinción de Gram y el manejo del microscopio,
tomando como referencia NOM-017-STPS-2008. Equipo de protección personal-
Selección, uso y manejo en los centros de trabajo; Manual-Microscopio óptico
OLYMPUS y NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental-Salud Ambiental-
Residuos peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación y especificaciones de
manejo.

INTRODUCCIÓN
Tinción empleada en microbiología para la visualización de bacterias en muestras
clínicas. También se emplea como primer paso la diferenciación bacteriana a través de la
visualización morfológica de una colonial, el examen con microscopio óptico de
preparación con tinción de Gram de manera rutinaria para determinar la forma de las
bacterias, las formas comunes como los cocos (esféricas), bacilos (alargadas) y formas
de espiral
Las bacterias pueden diferenciarse con esta tinción en dos grupos. Los
microorganismos Gram positivos se tiñen de color violeta o morado mientras que
aproximadamente un tercio de los cocos, la mitad de los bacilos y todos los organismos
espira lados se tiñen de rojo y se dice que son Gram negativos.
Las aplicaciones más comunes de la coloración de Gram son las siguientes:
La presencia de cocos Gram positivos agrupados sugiere estafilococos; en cadenas
sugiere estreptococos; en forma de lanceta a los diplococos
La presencia de diplococos Gram negativos son características de especies de
Neisseria
Los bacilos Gram positivos grandes sugieren especies de Bacillus o Clostridium, los
bacilos Gram positivos pequeños sugieren especies de Listeria o una de las corineiformes
(difteroides)
Los bacilos Gram negativos son las bacterias más comunes halladas en los
laboratorios clínicos e incluyen a Enterobacteriaceae, bacilos no fermentados y especies
de Haemophilus.
El valor diagnóstico de esta tinción es variable; normalmente permite una buena
orientación al microbiólogo para seleccionar las técnicas de cultivo más adecuadas y
también tiene valor en orientar hacia un diagnóstico etiológico, en especial para instaurar
un tratamiento inicial.

MATERIAL
Equipo y materiales: Microscopio y material propio del laboratorio de microbiología.
Reactivos: Colorantes para tinción de Gram

10
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

Biológicos: Cultivo bacteriano de 24 horas en caja de Petri con división de tres con
colonias asiladas de: Staphylococcus spp, Enterobacterias (diferentes por equipo una por
equipo), Bacillus subtilis y Neisseria spp.

MATERIAL TRAIDO POR EL ALUMNO O POR EQUIPO:


- Asa y portasa - Alcohol
- Portaobjetos - Cuadros de algodón
- Lápiz con punta de diamante - Cerillos
- Pinzas de disección - Esponjas
- Maskintape - Marcador
- Lupa de mano - una regla con escala milimétrica

PROCEDIMIENTO
1. En un portaobjetos, hacer cuatro frotes de los diferentes grupos bacterianos
proporcionados.
2. Teñir con Gram

RESULTADOS
1. Describir la morfología Microscópica de cada cepa.
- Enterobacterias
- Staphylococcus
- Bacillus
- Neisseria
HAGA LA DISCUSIÓN E INTERPRETACION DE RESULTADOS Y ENSEGUIDA LA
CONCLUSIÓN.

MORFOLOGÍA COLONIAL
(CARACTERÍSTICA MACROSCOPICAS DE LA COLONIA EN PLACA DE AGAR)

1. TAMAÑO. (mm)

2. FORMA.

3. ELEVACIÓN

4. MARGEN O BORDE

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

5. COLOR. Blanco, amarillo, naranja, rosa, gris, cremosa, rojo ladrillo, beige, otros.
6. SUPERFICIE. Lisa, rugosa o granular
7. ASPECTO. Húmedo o seco
8. LUZ REFLEJADA. Brillante o mate (que no brilla)
9. LUZ TRANSMITIDA. Translúcida (transparente) u opaca
10. CONSISTENCIA.
- SUAVE. Viscosa, mucosa, butirosa (mantequillosa) o membranosa
- DURA. Seca, quebradiza o friable (que se rompe con facilidad)
Esta última característica, se determina tocando la colonia con el asa de siembra o aguja de
inocular por lo tanto debe ser la última en describirse.

TECNICA DE GRAM.
1. Hacer un frotis de una de las cepas proporcionadas, secar al aire y fijarla al calor.
2. Colocar el frotis sobre un puente para tinción.
3. Cubrir el frotis con CRISTAL VIOLETA DURANTE 1 MINUTO.
4. Escurrir el colorante y lavar la preparación con un chorro suave de agua corriente.
(Utilice las pinzas para sostener el portaobjetos).
5. Cubrir la preparación con LUGOL DURANTE 1 MINUTO.
6. Escurrir y lavar con un chorro suave de agua corriente.
7. Sostener el portaobjetos con las pinzas y bañar la superficie con unas gotas de
DECOLORANTE (ALCOHOL-ACETONA) hasta no arrastrar más colorante violeta.
Esto requiere habitualmente entre uno 5 A 15 O MAS SEGUNDOS
8. Lavar con un chorro suave de agua y colocar nuevamente el portaobjetos en el puente
para tinción.
9. Cubrir la preparación con SAFRANINA DURANTE 1 MINUTO
10. Lavar la preparación con agua corriente, escurrir y dejar secar al aire, colocando el
frotis en posición vertical.
11. Examinar la preparación al microscopio con el objetivo 100 X, utilizando aceite de
inmersión.

LITERATURA CITADA
- Manual de prácticas de laboratorio de Microbiología General (2004). Escuela Nacional de
Ciencias Biológicas, IPN, México, DF.
- Pelczar, M.J.Jr., R.D. Reid y E.C.S. Chan., Microbiología, (2004) 4a. de. MacGraw-Hill-Book,
Company, Nueva York.
- Jawetz, Melnick y Edelberg. (2001). Microbiología Médica. El Manual moderno, México, DF.
- Ramos, D., Gamazo., López. Manual de Prácticas de Microbiología. (1999). Ed. Masson.
Barcelona.
- Ramírez G. RM., Luna M.B., Velázquez M.O., Vierna G.L, et al. (2000). Laboratorio de
Microbiología Experimental. Fac. de Química, UNAM. México, D.F.

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

Método
a) Extensión: En un porta bien limpio (con alcohol y flameado) se coloca una gota de agua destilada a
la que. con el asa de siembra, previamente esterilizada a la llama, se lleva una pequeña cantidad de
suspensión de bacterias o, en su caso, de una colonia. Con el asa se extiende la gota y las bacterias
sobre el porta, se deja secar completamente al aire y se fija la extensión por el calor, calentando
suavemente a la llama del mechero hasta que se seque.

DESCRIBIR LA MORFOLOGIA DE 4 COLONIAS, SELECCIONADAS DE CADA


CULTIVO BACTERIANO
CARACTERISTICAS COLONIA 1 COLONIA 2 COLONIA 3 COLONIA 4
MICROORGANISMO
MEDIO DE CULTIVO
TAMAÑO (mm)
FORMA
ELEVACION
MARGE O BORDE
COLOR
SUPERFICIE
ASPECTO
LUZ REFLEJADA
LUZ TRANSMITIDA
CONSISTENCIA

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

PRACTICA No. 2
ESTAFILOCOCOS (Staphylococcus)
HABILIDADES
Reconoce las características morfológicas, fisiológicas y metabólicas de las
principales especies de Staphylococcus comúnmente aisladas en el laboratorio de
microbiología, tomando como referencia NOM-017-STPS-2008. Equipo de protección
personal-Selección, uso y manejo en los centros de trabajo; Manual-Microscopio óptico
OLYMPUS y NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental-Salud Ambiental-
Residuos peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación y especificaciones de manejo.

INTRODUCCIÓN
Los estafilococos son cocos Gram positivos, no móviles, que no forman esporas,
catalasa positiva. Estos microorganismos se acomodan como células simples, en pares,
en tétradas y en cadenas cortas, pero aparecen en forma predominante en grupos como
racimos. La mayoría de las especies son anaerobios facultativos, generalmente no
presentan cápsula, crecen fácilmente en altas concentraciones de sal y muchas cepas
son hemolíticas.
Los estafilococos se encuentran generalmente en la piel y las mucosas del hombre
y otros animales. El género Staphylococcus actualmente se ubica dentro de la familia
Staphylococcaceae. El género Staphylococcus está compuesto por 35 especies, muchas
de las cuales se pueden encontrar en muestras clínicas humanas. Algunos de los
estafilococos patógenos tanto para los seres humanos como para animales producen la
enzima llamada coagulasa, cuya detección se usa en el laboratorio para identificar a estos
microorganismos. La especie patógena más importante es S. aureus, responsable de casi
todos los casos de enfermedad en los seres humanos, S. epidermidis causa
generalmente lesiones cutáneas y S. saprophyticus, especie que puede producir
infecciones en vías urinarias.
S. aureus produce una gran variedad de procesos infecciosos que van desde
infecciones cutáneas relativamente benignas hasta enfermedades sistémicas
potencialmente fatales. Las infecciones cutáneas incluyen foliculitis simple y el impétigo,
así como forúnculos y carbuncos. Entre las infecciones más graves tenemos la
septicemia, endocarditis, meningitis, sepsis puerperal, neumonía, osteomielitis,
infecciones en vías urinarias entre otras. S. aureus posee varios factores de virulencia que
contribuyen a su capacidad de producir enfermedad, entre los que se incluyen:
polisacáridos capsulares, peptidoglucano y ácidos teicoicos de la pared celular, la proteína
A, varias enzimas (catalasa, hiluronidasa, lipasas, firinolisinas, coagulasa, nucleasas),
hemolisinas y toxinas que pueden actuar como superantígenos.
Anteriormente los estafilococos coagulasa negativos (ECN) se consideraban
contaminantes de poca importancia clínica, sin embargo en las últimas dos décadas estos
microorganismos se han reconocido como agentes importantes de enfermedades
humanas, principalmente como patógenos nosocomiales.
Para la recuperación de estafilococos, las muestras clínicas se deben inocular en
agar sangre de carnero y otros medios bacteriológicos selectivos como el agar sal y
manitol y el medio estafilococo 110. Las colonias de estafilococos en agar sangre tienen
de 1 a 2 mm de diámetro, presentan un aspecto mate y son marcadamente convexas con
bordes enteros. Algunas cepas producen pigmento y son amarillas, rosadas anaranjadas
o pardas, en tanto que otras son de color blanco sucio o blanco hueso. Algunos S. aureus
y algunas especies coagulasa negativas pueden tener una zona evidente o difusa de -
hemólisis alrededor de las colonias.
Los estafilococos se diferencian estreptococos por la prueba de catalasa. Se
dispone de varios métodos para la diferenciación de especies de Micrococcus y

14
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

estafilococos, los dos géneros catalasa positiva. La prueba más sencilla es la sensibilidad
a la bacitracina (0.04 unidades), los estafilococos son resistentes y crecen hasta el borde
del disco, en tanto los micrococos y las especies relacionadas son susceptibles y
producen halos de 10 mm o mayores.
La característica aislada más confiable para identificar S. aureus es la prueba de
coagulasa, se pueden hacer pruebas confirmatorias adicionales como la
desoxirribonucleasa, endonucleasas termoestable y fermentación de manitol. La
identificación bioquímica de los estafilococos coagulasa negativos emplea una gran
batería pruebas fisiológicas y bioquímicas. Actualmente se dispone de varios sistemas
comerciales para la identificación de ECN.

MATERIAL:
- Cultivo bacteriano de 24 horas con crecimiento masivo de diferentes especies de
Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis y Staphylococcus saprophyticus

Medios de cultivos en placas:


Agar Sal y manitol
Agar Sangre
Pruebas de cultivo: Caldo base rojo de fenol con maltosa más campana, Caldo base
rojo de fenol con sacarosa más campana, Caldo base rojo de fenol con manosa más
campana, Caldo base rojo de fenol con trehalosa más campana y caldo urea

Reactivos:
- Colorantes para tinción de Gram
- Solución salina estéril
- Peróxido de hidrogeno 3%,
- Plasma humano o de conejo,
- Discos de novobiocina,
Equipo y Materiales varios:
- Hisopos estériles
- Microscopios
- Incubadora a 37º C
- Mecheros
- Aceite de inmersión
- Papel seda para lentes
-
MATERIAL TRAIDO POR EL ALUMNO O POR EQUIPO:
- Asa y portasa - Alcohol
- Portaobjetos - Cuadros de algodón
- Lápiz con punta de diamante - Cerillos
- Pinzas de disección - Esponjas
- Maskintape
- Marcador

.
PROCEDIMIENTO
1. Sembrar las cepas proporcionadas por estría cruzada en una placa de gelosa sangre
y en sal y manitol.
2. Inocular cada una de las cepas en el caldo rojo de fenol más maltosa, sacarosa,
manosa, trehalosa y manitol, así como en caldo urea.
3. Realizar la prueba de novobiocina (apéndices).

15
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

4. Realizar la prueba de la coagulasa (apéndices).


5. Incubar los cultivos a 35º C durante 24- 48 horas.
6. Hacer un frotis de cada microorganismo, teñir con Gram y observar al microscopio.
7. Realizar la prueba de la catalasa (apéndices)
8. Revisar las pruebas metabólicas, prueba de coagulasa y susceptibilidad a la
novobiocina.

RESULTADOS
1. Describir la morfología colonial de cada cepa, en cada uno de los medios de
cultivo.
Staphylococcu Staphylococcus Staphylococcus
Medio s aureus epidermidis saprophyticus

Agar Sangre
Agar Sal y Manitol

2. Hacer la interpretación de cada una de las pruebas bioquímicas (ver


apéndices).
Staphylococcu Staphylococcus Staphylococcus
Pruebas bioquímicas s aureus epidermidis saprophyticus

Catalasa
Coagulasa
Ureasa
Novobiocina
Ácido producido en
anaerobiosis de:
Glucosa
Maltosa
Sacarosa
Manosa
Trehalosa
Manitol

3. Describir la morfología microscópica de cada una de las cepas utilizadas.


4. Comparar los resultados con la tabla de identificación.

HAGA LA DISCUSIÓN E INTERPRETACION DE RESULTADOS Y ENSEGUIDA LA


CONCLUSIÓN.

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

COAGULASA
La coagulasa es una enzima proteica de composición química desconocida, que
tiene actividad similar a la protrombina, capaz de transformar el fibrinógeno en fibrina, lo
que da como resultado la formación de un coágulo visible en los sistemas apropiados. Se
piensa que in vivo la coagulasa produce una barrera de fibrina en la localización de la
infección estafilocócica. En el laboratorio, la prueba de coagulasa se utiliza para identificar
Staphylococcus aureus y diferenciarlo de otras especies de estafilococos.
La coagulasa se presenta en dos formas, libre y unida; y cada una posee diferentes
propiedades que requieren el uso de distintos procedimientos de ensayo.

Procedimiento
1. Colocar en un tubo de ensaye estéril, 0.5 ml de plasma de conejo o humano.
2. Emulsificar una pequeña cantidad de colonia del microorganismo en el plasma.
3. Se incuba a 35oC de tres a cuatro horas y observar si se forma un coágulo inclinando
ligeramente el tubo.
Interpretación
La prueba de coagulasa en tubo se considera positiva si se detecta cualquier grado de
formación de coágulos.

SENSIBILIDAD A LA NOVOBIOCINA
Principio

Los estafilococos coagulasa negativos pueden dividirse en especies sensibles y


resistentes a la novobiocina. Entre las especies resistentes a la novobiocina, S.
saprophyticus es el único que suele recuperarse en el hombre como causantes de
infecciones del tracto urinario. Por lo tanto el tamizaje de los estafilococos coagulasa
negativos aislados de cultivos cuantitativos de orina en lo que respecta a la
susceptibilidad a la novobiocina proporciona una identificación presuntiva confiable de
esta especie.
Procedimiento
1. Preparar una suspensión del microorganismo a identificar en agua destilada estéril o
en caldo. La suspensión debe tener una turbidez equivalente al estándar 0.5 del
nefelómetro de Mc Farland.
2. Con un hisopo distribuir parte de la suspensión sobre la mitad de la placa de agar
Mueller-Hinton.
3. Colocar en forma aséptica un disco de novobiocina (5 µg) sobre el área sembrada.
Presionarse con suavidad el disco con pinzas estériles para asegurar el contacto con
la superficie del agar.
4. Incubar la placa en aerobiosis a 35º C de 18 a 24 horas.
5. Medir los diámetros de las zonas de inhibición con el vernier.
Interpretación
Resistentes: presentarán halos de inhibición entre 6 mm y 12 mm
Sensibles: Presentarán halos de inhibición de 16 mm o mayores.

17
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

Cuadro de identificación. Tomado de: Winns et al. 2008.

18
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

PRACTICA No. 3
ESTREPTOCOCOS (Streptococcus)

HABILIDADES
El estudiante, identifica las características de crecimiento, morfología
microscópica, los medios de aislamiento y pruebas disponibles para la identificación
de los estreptococos de importancia clínica, tomando como referencia NOM-017-STPS-
2008. Equipo de protección personal-Selección, uso y manejo en los centros de trabajo;
Manual-Microscopio óptico OLYMPUS y NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección
ambiental-Salud Ambiental-Residuos peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación y
especificaciones de manejo.

INTRODUCCIÓN
Los miembros del género Streptococcus, forman parte de la familia
Streptococcocaea. Los estreptococos son anaerobios facultativos, algunas cepas
desarrollan mejor en anaerobiosis y muchos aislamientos son estimulados por la
presencia de CO2. Los estreptococos, enterococos y aerococos de importancia médica
son homofermentadores, lo que significa que el único producto de la fermentación de la
glucosa es el ácido láctico. Los estreptococos son cocos Gram positivos, miden de 0.5 a 1
micra de diámetro, generalmente no móviles, agrupados en cadenas o en pares, son
catalasa negativa.
Son miembros de la flora normal de la boca y tracto intestinal del ser humano y
además agentes etiológicos de varias enfermedades graves que incluyen neumonía
neumocócica, meningitis, sepsis, endocarditis bacterianas, faringitis exudativa
estreptocócica, celulitis, infecciones de heridas y abscesos viscerales.
A principios de la década de 1930, Rebeca Lancenfield identificó 5 grupos
antigénicos de estreptococos (A, B, C, D y E), en base a las diferencias serológicas en los
polisacáridos de la pared celular. Desde entonces los continuos estudios e investigaciones
han ampliado el número, los cuales se han designado como el grupo piogénico, con
excepción de los del grupo D. Otros estreptococos en particular los del grupo viridans, no
poseen ninguno de los antígenos del grupo Lancenfield conocidos, aunque algunas cepas
pueden poseer antígenos similares que reaccionan en forma cruzada con antisueros
específicos del grupo antiestreptococos betahemolíticos.
Los estreptococos patógenos poseen varias características que contribuyen a su
virulencia. Los mecanismos de virulencia de los estreptococos -hemolíticos del grupo A
son los más estudiados. El principal factor de virulencia de este grupo es el antígeno de
superficie denominado proteína M, las cepas ricas en proteína M son resistentes a la
fagocitosis y muerte intracelular por parte de células polimorfonucleares. Algunas cepas
del grupo A poseen una cápsula compuesta de ácido hialurónico químicamente
indistinguible de la sustancia fundamental del tejido conectivo, lo que puede explicar la
carencia de inmunogenicidad de esta sustancia en el huésped infectado. El factor de
opacidad (OF) define otro antígeno de superficie celular asociado a la proteína M que es
un factor de virulencia potencial. Los estreptococos del grupo A producen dos
hemolisinas, la estreptolisina O y S, tóxicas para una variedad de tipos de células. Las
exotoxinas estreptocócicas pirógenas (SPE) son las responsables del Rash de la
escarlatina y también se supone que son las principales determinantes de la virulencia en
la patogenia del síndrome tóxico estreptocócico similar al Sock.
S. pneumoniae es la principal causa de neumonía adquirida en la comunidad. Su
principal factor de virulencia es la cápsula de polisacáridos, que permite que los

19
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

neumococos la ingestión y muerte por parte de las células fagocitarias del huésped. Se
han reconocido más de 80 tipos capsulares antigénicamente diferentes, algunos más
virulentos que otros.
Las especies más importantes de estreptococos con propiedades patógenas para
el hombre son:
- Streptococcus pyogenes ( estreptococos beta hemolítico del grupo A)
- Streptococcus agalactiae (estreptococos beta hemolítico del grupo B)
- Streptococcus faecalis (estreptococos del grupo D enterococos)
- Streptococcus pneumoniae (neumococo)
- Streptococcus viridans (grupo heterogéneo de diferentes especies)

El medio agar sangre de carnero al 5 % es un medio enriquecido que permite crecer


muy bien a los estreptococos y además se puede hacer la diferenciación en base al tipo
de hemólisis que producen. Las colonias de estreptococos presentan la siguiente
morfología: Son pequeñas, traslúcidas, o ligeramente opacas, circulares, de 0.5 a 2 mm
de diámetro, convexas y se observan como diminutas gotas de humedad sobre la
superficie del agar. Los estreptococos recuperados de muestras clínicas humanas se
identifican por sus propiedades hemolíticas, mediante pruebas serológicas para la
detección de antígenos capsulares o de pared celular, y por pruebas fisiológicas y
bioquímicas. Algunas de las pruebas realizadas en el laboratorio para la identificación
de estos microorganismos proporcionan resultados presuntivos, en tanto que otras
proporcionan resultados definitivos. Sin embargo antes de realizar las pruebas de
identificación debe comprobarse que los cocos Gram positivos son catalasa
negativos.

MATERIAL:
- Cultivo bacteriano de 24 horas con crecimiento masivo de diferentes especies de
Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae,
Streptococcus bovis, Enterococcus faecalis y Staphylococcus aureus.

Medios de cultivos en placas:


Agar Sangre
Pruebas de bioquímicas:
- Agar bilis esculina
- Caldo BHI
- Caldo BHI + NaCl 6.5%

Reactivos:
- Colorantes para tinción de Gram,
- Peróxido de hidrogeno 30%
- Desoxicolato de sodio al 10%,
- Solución rojo de fenol al 1%
- Solución hidróxido de sodio 0.1 N
- Discos de Bacitracina 0.04 U
- Discos de optoquina 5 µg
- Discos SXT 1.25 µg/23.75 µg.

Equipo y Materiales varios:


- Hisopos estériles
- Microscopios

20
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

- Incubadora a 37º C
- Mecheros
- Aceite de inmersión
- Papel seda para lentes

MATERIAL TRAIDO POR EL ALUMNO O POR EQUIPO:


- Asa y portasa - Alcohol
- Portaobjetos - Cuadros de algodón
- Lápiz con punta de diamante - Cerillos
- Pinzas de disección - Esponjas
- Maskintape
- Marcador

- PROCEDIMIENTO

PROCEDIMIENTO
1. En diferentes placas de gelosa sangre, sembrar por estría cruzada Streptococcus
beta-hemolítico del grupo A, grupo B y grupo C. Colocar un disco de bacitracina y un
disco de trimetropin-sulfametozaxol (SXT), sobre el inóculo primario, presionándolo
ligeramente para que se adhiera al agar. Hacer incisiones en las estrías.
2. En otra caja de agar sangre hacer la prueba de CAMP. (anexo 2)
3. En una placa de gelosa sangre, sembrar por estría cruzada Streptococcus
pneumoniae. Colocar un disco de optoquina en el centro del área de inóculo, presionar
suavemente el disco sobre el agar con una pinza o el asa estéril. Inocular este
microorganismo en caldo BHI, para posteriormente hacer la prueba de solubilidad en
bilis (anexo 2)
4. Sembrar por estría cruzada en una placa de agar sangre el Enterococcus faecalis y
Streptococcus bovis.
5. Incubar las cajas a 37º C durante 24 hrs en tensión de CO 2 (se le coloca en un frasco
al cuál se le introduce una vela encendida para crear una atmósfera de CO2).
6. Sembrar el Enterococcus faecalis y Streptococcus bovis en agar bilis esculina y en
caldo con NaCl al 6.5%. Incubar a 37º C durante 24 horas en atmósfera ambiente.
7. Hacer un frote de las colonias, teñir con Gram y observar la morfología colonial.
8. Realizar una prueba de catalasa (anexos).

RESULTADOS
1. Hacer la descripción de la morfología colonial, observar el tipo de hemólisis, la
morfología microscópica y resultado de la prueba de catalasa.

21
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

Morfología Morfología Catalasa


Microorganismo Hemólisis
colonial microscópica

Streptococcus
pyogenes
Streptococcus
agalactiae
Streptococcus bovis
Streptococcus
pneumoniae
Enterococcus
faecalis

2. Interpretar las pruebas realizadas.

22
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

Bilis Crecimiento Optoquina


Prueba
M.O Bacitracina SXT Esculina caldo con
de CAMP
NaCl 6.5%

Streptococcus
pyogenes
Streptococcus
agalactiae
Streptococcus
bovis
Streptococcus
pneumoniae
Enterococcus
faecalis

3. Comparar los resultados con el cuadro 2.

HAGA LA DISCUSIÓN E INTERPRETACION DE RESULTADOS Y ENSEGUIDA


LA CONCLUSIÓN.

INTERPRETACIÓN:
SENSIBILIDAD A BACITRACINA Y SXT
Principio
La susceptibilidad a bajas concentraciones del antibiótico polipeptídico bacitracina (0.04
unidades) y a la combinación del trimetroprima-sulfametoxazol (SXT) proporciona un
método sencillo y económico para la identificación presuntiva de los estreptococos
betahemolíticos de los grupos A y B. Los estreptococos del grupo A son sensibles a
concentraciones relativamente bajas de bacitracina y resistentes a la SXT. Los
estreptococos del grupo B son resistentes a ambos antibióticos. Otros estreptococos -
hemolíticos muestran sensibilidad variable a la bacitracina pero estos microorganismos
son habitualmente sensibles a la SXT. Por lo tanto, la realización de SXT junto con la
prueba de bacitracina aumenta la sensibilidad y el valor pronóstico de la prueba de
bacitracina.
Procedimiento
1. Tomar tres o cuatro colonias aisladas de estreptococos betahemolíticos y estriar el
inóculo hasta el centro de la mitad de una placa de agar sangre.
2. Con un hisopo estéril o un asa diseminar el inóculo sobre toda la mitad de la placa.
3. Colocar en forma aséptica un disco de bacitracina “A” y un disco de SXT sobre el
área sembrada. Asegurarse de que los discos estén igualmente separados. Utilizando
pinzas flameadas, golpear con suavidad los discos para que se adhieran a la
superficie de agar.
4. Incubar la placa en aire ambiente a 37°C.

Interpretación
Sensible (S) Cualquier tamaño de halo alrededor de cualquiera de los discos
Resistente (R) Desarrollo hasta el borde del disco.
CAMP
La actividad hemolítica de la β-hemolisina producida por la mayoría de los
Staphylococcus aureus es intensificada por una proteína extracelular producida por los

23
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

estreptococos del grupo B. La interacción de la β-hemolisina con este factor produce una
hemólisis sinérgica, que puede observarse fácilmente en una placa de agar sangre.
1. Hacer en el centro de una placa de agar sangre una única estría en línea recta con
Staphylococcus aureus productor de β-hemolisina.
2. Teniendo cuidado de no tocar la estría del estafilococo, realizar una estría de los
estreptococos betahemolíticos a identificar, en forma perpendicular a la estría de
estafilococos. Realizar estas estrías de tal manera que, después de la incubación, el
desarrollo de los microorganismos no se junte. La estría de estreptococos debe ser de
3 a 4 cm de longitud, en la misma placa debe sembrarse en forma similar cepas
conocidas de Streptococcus del grupo A y grupo B como controles negativos y
positivos respectivamente.
3. Incubar las placas a 37°C en are atmosférico durante 18 a 24 horas.
Interpretación
Se observa una zona de mayor hemólisis cuando la β-hemolisina secretada por el
estafilococo y el factor CAMP secretado por los estreptococos del grupo B se intersectan.

SOLUBILIDAD EN BILIS
Las sales biliares, específicamente el Desoxicolato de sodio y el taurocolato de sodio,
poseen la propiedad de lisar selectivamente a Streptococcus pneumoniae cuando se
agregan las bacterias en fase de crecimiento activo en medios agar o caldo. S.
pneumoniae produce enzimas autolíticas (autolisinas) que son las responsables de la
depresión o umbilicación característica de las colonias viejas de neumococos en medios
de agar. El agregado de sales biliares activa las autolisinas y aceleran la reacción lítica
natural observadas en los cultivos del neumococo.
La prueba de solubilidad en bilis se puede realizar con un cultivo líquido del
microorganismo o con colonias que se desarrollan en medio agar. Si el microorganismo es
soluble, la turbidez del cultivo en caldo líquido se aclara visiblemente cuando se agregan
sales biliares. En medios de agar las colonias solubles en bilis desaparecen cuando se
coloca una gota del reactivo sobre ellas. Debido a que el Desoxicolato de sodio puede
precipitar a pH de 6.5 o menor, el caldo utilizado debe ajustarse a pH de 7.0 para evitar
las reacciones negativas falsas.

Prueba en caldo
1. Transferir aproximadamente 0.5 mL de un caldo de cultivo de 18 a 24 horas a dos
tubos de ensayo limpios, Alternativamente puede prepararse una suspensión del
microorganismo en solución fisiológica tamponada con fosfato a pH de 7.0, a partir del
desarrollo en medio de agar.
2. Agregar una gota de indicador rojo de fenol a cada tubo.

24
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

3. Agregar NaOH 0.10 N para corregir el pH a 7.0 (el indicador vira a un color rosa
pálido).
4. Agregar 0.5 mL de Desoxicolato de sodio al 10% a uno de los tubos (marcado
prueba)
5. Agregar 0.5 mL de solución fisiológica estéril al otro tubo (marcado control).
6. Agitar suavemente ambos tubos y colocarlos en estufa o baño maría a 35°C durante
tres horas, observando cada hora.
Prueba en placa
1. Colocar una gota de desoxicolato de sodio al 2% sobre una pocas colonias bien
aisladas del microorganismo a probar desarrollado sobre el agar sangre de carnero.
2. Sin invertir la placa, colocar en una estufa a 35°C durante 30 minutos.

Interpretación
Prueba en caldo
Reacción positiva (solubles en bilis): Hay un aclaramiento visible de la suspensión del
tubo que contiene desoxicolato de sodio sin cambio enla suspensión control.
Reacción negativa (Insoluble en bilis): No hay cambios en la turbidez de la suspensión
del tubo que contiene desoxicolato de sodio, en comparación con la suspensión control.

Prueba en placa
Reacción positiva (solubles en bilis): Las colonias sobre las cuales se ha colocado el
reactivo desaparecen y dejan una zona parcialmente hemolisada en el lugar donde
estaban.
Reacción negativa (Insoluble en bilis): Las colonias sobre las cuales se ha colocado el
reactivo permanecen intactas y visibles.

HIDRÓLISIS DE ESCULINA
Esta prueba se basa en la capacidad de ciertas bacterias, particularmente los
estreptococos del grupo D y especies de Enterococcus, de hidrolizar esculina en
presencia de bilis al (4 % de sales biliares o 40% de bilis). La esculina es un
derivado glucosídico de la cumarina (6-β-glucósido-7-hidroxicumarina). Los dos residuos
de la molécula (glucosa y a glucona 7 – hidroxicumarina) se encuentran unidos por una
unión éster de oxígeno. Para esta prueba la esculina se incorpora a un medio que
contenga 4% de sales biliares.
Las bacterias bilis esculina positivas son primero de nada capaces de desarrollarse en
presencia de sales biliares. La hidrólisis de la esculina en el medio da como resultado la
formación de glucosa y un compuesto denominado esculetina. Esta a su vez reacciona
con los iones férricos (aportado por el componente de citrato férrico en el medio
inorgánico) para formar un complejo negro que se difunde.
1. Sembrar el microorganismo en el pico de flauta del medio bilis esculina con un
movimiento en S o estriar la superficie de una placa.
2. Incubar el tubo o la placa a 35°C durante 24-48 horas.

Interpretación
El ennegrecimiento difuso de más de la mitad del pico de flauta dentro de las 24-48
horas indica la hidrólisis de la esculina.

TOLERANCIA A LA SAL

25
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

La capacidad de desarrollarse en presencia de cantidades variables de cloruro de sodio


(NaCl) es una propiedad que ha sido utilizada para caracterizar varias bacterias, incluidos
los estreptococos del grupo viridans. Sin embargo es de particular utilidad para la
identificación presuntiva de del grupo de los microorganismos pertenecientes a los
estreptococos del grupo D, que poseen la capacidad específica de desarrollarse en
presencia de NaCl al 6.5% incorporados a medios líquidos o sólidos. Esta prueba junto
con la de agar bilis esculina se utiliza en pruebas de laboratorio para distinguir especies
de Enterococcus de los Streptococcus del grupo D, S. bovis y S. equinus.
El caldo infusión de corazón es un medio nutritivo de uso general que se utiliza para el
cultivo de muchas bacterias. Normalmente contiene 0.5% de NaCl. Si se aumenta la
concentración del NaCl al 6.5% el medio se hace semiselectivo para el desarrollo de
enterococos.
1. Inocular dos o tres colonias en el caldo BHI más NaCl al 6.5%.
2. Incubar toda la noche a 35°C en estufa con aire ambiente.

Interpretación
Una prueba positiva se manifiesta por la presencia de desarrollo bacteriano evidente en el
medio. Si el microorganismo es bilis esculina positivo y se desarrolla en caldo con 6.5%
de NaCl, pertenece a una especie de Enterococcus. Si es bilis esculina positivo, pero no
se desarrolla en caldo con 6.5% de NaCl, es un estreptococo del grupo D.

SENSIBILIDAD A LA OPTOQUINA
El clorhidrato de etilhidroxicupreína (Optoquina), un derivado de la quinina, inhibe
selectivamente el crecimiento de S. pneumoniae a concentraciones muy bajas (5µg/ml o
menos). Asimismo, la optoquina puede inhibir asimismo otros estreptococos del grupo
viridans, pero sólo a concentraciones mucho más altas. La prueba tiene una sensibilidad
de más del 95%, es barata y sencilla de realizar.
La optoquina es soluble en agua y difunde con rapidez en el medio de agar. Por lo tanto,
los discos de papel de filtro impregnados con optoquina pueden colocarse directamente
sobre la superficie del agar al realizar esta prueba. Las células de S. pneumoniae
alrededor del disco son lisadas debido a cambios en la tensión superficial y se produce
una zona de inhibición del crecimiento.
1. Mediante el empleo de un asa de inoculación seleccionar tres o cuatro colonias bien
aisladas del microorganismo de prueba y estriar en una mitad a un tercio de la placa
de agar sangre de carnero al 5%.
2. Colocar el disco de optoquina en el tercio superior del área sembrada. Presionar
suavemente el disco, para que se adhiera a la superficie del agar.
3. Incubar a 35oC durante 18 a 24 horas con vela o en incubadora de CO 2.

Interpretación
Un estreptococo del grupo viridans puede identificarse en forma presuntiva como S.
pneumoniae si muestra una zona de inhibición de 14 mm o más alrededor de un disco de
optoquina de 6 mm o una zona de 16 mm o más si se utiliza un disco de 10 mm. Los
estreptococos que muestran zonas de diámetro menor deben ser sometidos a la prueba
de solubilidad en bilis.

Cuadro 2. Tomado de: Winns et al. 2008

26
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

27
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

28
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

M.O. EMB Mc Conkey SS XLD Agar sangre

2. Describir la morfología Microscópica de cada una de las cepas utilizadas.


3. Comparar los resultados con la tabla de identificación para Enterobacterias.
4. Analizar los resultados
5. Hacer discusión y Conclusiones

PRACTICA No. 5
IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA DE ENTEROBACTERIAS

HABILIDADES

Emplea pruebas bioquímicas adecuadas para la identificación de las principales


especies de Enterobacterias, y utiliza tablas convencionales para su reconocimiento e
identificación tomando como referencia NOM-017-STPS-2008. Equipo de protección
personal-Selección, uso y manejo en los centros de trabajo; Manual-Microscopio óptico
OLYMPUS y NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental-Salud Ambiental-
Residuos peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación y especificaciones de manejo.

INTRODUCCIÓN

La identificación de las especies de la familia de las Enterobacterias requiere la


determinación de características metabólicas que reflejan el código genético y la identidad
única del organismo en estudio. Se dispone de una gran variedad de pruebas
diferenciales y de numerosos esquemas para la identificación final de especies de
enterobacterias.

Las pruebas utilizadas ampliamente en los laboratorios clínicos incluyen la siguiente serie:
 Utilización de hidratos de carbono
 Actividad de o-nitrofenil-β-D-galactopiranósido (ONPG)
 Producción de indol

29
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

 Rojo de metilo
 Producción de acetoína ( Voges Proskauer )
 Utilización de citrato
 Producción de ureasa
 Descarboxilación de la lisina, ornitina y arginina
 Producción de fenilalanina desaminasa
 Producción de gas sulfuro de hidrógeno
 Movilidad
Para la determinación de estas pruebas bioquímicas se pueden utilizar medios
únicos o simples (demuestran una determinada característica del microorganismo),
medios múltiples o combinados (destacan varias características en forma simultánea). En
la práctica se utilizan preferentemente medios combinados, los más utilizados para la
identificación de Enterobacterias son: Agar hierro de Kligler (KIA) o agar hierro triple
azúcar (TSI), Agar hierro lisina (LIA), Agar citrato de Simmons, Medio MIO (movilidad-
indol-ornitina), Medio rojo de metilo- Voges Proskauer (RM-VP), Caldo Urea, caldo base
rojo de fenol más carbohidratos, agar Fenilalanina, Gelatina.

MATERIAL

Equipo y materiales: Incubadora, Microscopio y material propio del laboratorio de


microbiología.
Medios de cultivo: Pruebas bioquímicas (Kligler, LIA, Citrato, MIO, medio MR-VP, caldo
urea, fenilalanina desaminasa, Caldo base rojo de fenol con glucosa y campana Durham)
Reactivos: Reactivo de Kovacs, cloruro férrico, rojo de metilo, alfa – naftol al 5 % y
solución de KOH al 40 %.
Biológicos: Cultivo de 24 horas de diferentes especies de Enterobacterias.
PROCEDIMIENTO
1. De una colonia aislada sembrar la batería bioquímica proporcionadas con una asa
recta.
2. Incubar las pruebas bioquímicas a 37oC durante 24 horas.
3. Después de la incubación, leer la batería bioquímica.
4. Comparar con tablas de identificación de Enterobacterias.

RESULTADOS

5. Interpretación de cada una de las pruebas bioquímicas (ver apéndices).

MICROORGANISMO

KIA
Fermentación de glucosa
Fermentación de lactosa
Producción de H2S
Producción de gas
MEDIO LIA
Descarboxilación de la lisina
Desaminación de la lisina
MEDIO MIO
Movilidad
Descarboxilación de la ornitina
Producción de Indol

30
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

RM
VP
Fenil alanina desaminasa
CITRATO
Hidrólisis de urea
CALDO BASE ROJO DE FENOL
Fermentación de glucosa
Producción de gas

6. ANALIZAR LOS RESULTADOS

7. HACER DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

PRACTICA No. 6
IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS MEDIANTE SISTEMAS MINIATURIZADOS
API 20E

HABILIDADES
Usa métodos semiautomatizados para la identificación rápida de enterobacterias y
otros bacilos gramnegativos, y evalúa sus ventajas y desventajas, tomando como
referencia NOM-017-STPS-2008. Equipo de protección personal-Selección, uso y manejo
en los centros de trabajo; y NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental-Salud
Ambiental-Residuos peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación y especificaciones de
manejo.

INTRODUCCIÓN
Actualmente, muchos laboratorios clínicos utilizan uno o más sistemas comerciales
de determinaciones múltiples disponibles para la identificación de ciertos
microorganismos. Numerosas pruebas en laboratorios diagnósticos y de investigación han
demostrado una concordancia del 95% o mayor entre la mayoría de estos sistemas de
identificación y los métodos convencionales para la identificación de microorganismos. La
batería de pruebas API20E es un sistema estandarizado que permite la identificación
rápida para bacterias de la familia Enterobacteriaceae y otras bacterias Gram negativas
no exigentes. Básicamente consta de 21 pruebas bioquímicas estandarizadas y
miniaturizadas, y una base de datos. Este sistema presenta las ventajas de ser rápido,
eficaz y de permitir realizar numerosas pruebas a la vez. Cada tira de API 20E contiene 20
microtubos con distintos sustratos deshidratados. Cada tubo es una prueba bioquímica
distinta. La prueba número 21, la oxidasa, se hace de forma independiente a la tira.

31
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

.
MATERIAL Y MÉTODOS
Equipo: Incubadora, Micropipetas
Material: Placas de EMB, Mac Conkey, SS, XLD, Agar sangre
Galerías API 20E
Reactivos: Reactivo de Kovac, cloruro férrico, alfa – naftol al 5 % y solución de KOH al
40 %.
Biológicos: Cultivo de 24 horas de diferentes especies de Enterobacterias.

PROCEDIMIENTO

1. Sembrar las cepas de Enterobacterias proporcionadas por estría cruzada, en cada


uno de los medios de cultivo en placa proporcionados.
2. A partir de una colonia bien aislada del microorganismo, hacer una suspensión en 5 mL
de solución salina (1% de NaCl) o 5 mL de agua estéril).
3. Llenar con la suspensión de bacterias los tubos, no la cúpula (cada pocillo tiene un
tubo y una cúpula, parte aerobia), de todos los pocillos.
4. Llenar la cúpula de los pocillos CIT, VP, GEL con la suspensión de bacterias.
5. Cubrir con parafina las cúpulas de los pocillos ADH, LDC, ODC, URE, H 2S para
obtener anaerobiosis.
6. Poner la tira en su propia cámara húmeda de incubación. Previamente poner agua en
los alvéolos de la cámara para proporcionar una atmósfera húmeda durante la
incubación.

7. Incubar a 37 °C durante 18-24 h.


8. Después transcurrido el tiempo de incubación se adicionan los reactivos
correspondientes a cada prueba.
 TDA: Añadir una gota de FeCl3 10 %.
 VP: Añadir una gota de (KOH al 40%) y una gota del reactivo alfa-naftol.
 IND: Añadir una gota de reactivo de Kovacs.

Interpretación: La lectura de los resultados se lleva a


cabo por comparación de los colores de cada pocillo con los de las tablas de lectura, y
anotando el resultado como positivo o negativo.

32
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

RESULTADOS

1. Describir la morfología colonial de cada cepa, en cada uno de los medios de cultivo.
M.O. EMB Mc Conkey SS XLD Agar sangre

2. Del conjunto de reacciones y resultados se obtiene un perfil numérico de 7 cifras. Los


pocillos están separados en grupos de tres: en total tenemos 7 grupos de tres tubos o
tripletes (el test número 21 corresponde al test de la oxidasa).

Para obtener el perfil numérico de 7 cifras, a cada pocillo se le dará el valor 0, 1, 2 ó 4, de


acuerdo a los siguientes criterios:

 Si la reacción es negativa se pone 0.

 Si la reacción es positiva se pone: 1 si es el primer pocillo de un triplete, 2 si es el


segundo, 4 si es el tercero.

 Se suman los valores de cada triplete, con las sumas de los siete tripletes se obtiene
un código de 7 cifras.

33
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

3. Con este código se busca en la tabla de identificación la especie de que se trata, para
realizar esta operación hay programas informáticos.
4. Compara los resultados de la morfología colonial y las pruebas Bioquímicas con las
reportadas en la Bibliografía
5. ¿Cuáles son las ventajas de utilizar un sistema automatizado?
6. ¿Qué diferencias hay entre las pruebas Bioquímicas y convencionales y los
automatizados?
7. Analizar resultados
8. Hacer discusión y conclusiones

PRACTICA No. 7
BACILOS GRAM NEGATIVOS NO FERMENTADORES

HABILIDADES

Aplica las características morfológicas (Macroscópicas y microscópicas) y


bioquímicas de las bacterias para identificar las principales especies de bacilos
gramnegativos no fermentadores aislados de muestras clínicas, tomando como referencia
NOM-017-STPS-2008. Equipo de protección personal-Selección, uso y manejo en los
centros de trabajo; Manual-Microscopio óptico OLYMPUS y NOM-087-ECOL-SSA1-2002,
Protección ambiental-Salud Ambiental-Residuos peligrosos biológico-infecciosos -
Clasificación y especificaciones de manejo.

34
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

INTRODUCCIÓN
Los bacilos Gramnegativos no fermentadores, constituyen un grupo de bacilos no
esporulados aerobios, que no utilizan hidratos de carbono como fuente de energía o los
degradan a través de vías metabólicas distintas de la fermentación. Dentro de este grupo
existen varios géneros y especies de bacterias con requerimientos especiales de
crecimiento. El microbiólogo puede sospechar de un bacilo Gram negativo desconocido
es miembro del grupo no fermentador al observar una o más de las siguientes
características: falta de evidencia de fermentación de glucosa (KIA alcalino/alcalino),
reacción de citocromo oxidasa positiva y falta de crecimiento en agar Mac Conkey. La
mayoría de los no fermentadores tienen su hábitat natural en varios microambientes que
sirven como posibles reservorios de infecciones humanas como agua prevalentes en
hospitales: Humificadores, nebulizadores, baños de agua, soluciones desinfectantes y de
irrigación, vías de agua destilada, crema para manos, lociones corporales, etc. Por lo que
estos microorganismos se pueden aislar de casos de septicemia, neumonías, bronquitis,
artritis séptica, infecciones urinarias, infecciones de heridas posoperatorias o
postraumáticas y conjuntivitis.
Tres son las especies más comúnmente aisladas en los laboratorios: Pseudomona
aeruginosa, Acinetobacter baumannii y Stenotrophomonas matophiliai. La mayoría de las
cepas pueden identificarse con facilidad solo sobre la base de algunas observaciones y
pruebas bioquímicas.
Más del 95% de las cepas P. aeruginosa aisladas de muestras clínicas pueden
identificarse observando la presencia de las siguientes características primarias: colonias
grandes con olor similar a uvas, productoras de pigmento (piocianina) verde azulado
hidrosoluble y oxidasa positivas. Algunas cepas de P. aeruginosa pueden producir
pigmentos con otros colores. Piorrubina (rojo), piomelanina (pardo o negro) y pioverdina
(amarillo). La producción de fluoresceína se observa bajo la luz ultravioleta. Las siguientes
características adicionales son útiles para identificar cepas de P. aeruginosa que no
producen pigmento: crecimiento a 42°C, alcalinización de acetamida, desnitrificación de
nitratos a nitritos, móviles con flagelos polares o monótricos. Para identificar otras
especies de Pseudomonas se utiliza la misma bacteria de pruebas bioquímicas de las
enterobacterias, adicionando otra prueba más que es la de OF. Especies de importancia a
nivel clínico:P. aeruginosa, P. fluorecens, P. cepacea, P. putida, P. maltophila, P. stutzeri, P.
pseudomallei, P. mallei, P. picketti.
La identificación presuntiva de Acinetobacter baumannii puede ser con las siguientes
características: Las colonias en agar Mac Conkey pueden tener una tinción ligeramente
rosadas, aparecen como cocos o cocobacilos en la tinción de Gram, no producen
citocromo oxidasa, muestran una rápida utilización de glucosa y lactosa al 10% con
producción de ácidos en el medio OF, son inmóviles y son resistentes a la penicilina.
S. maltophilia es el tercer fermentador en frecuencia hallado en muestras clínicas. Las
siguientes son las características por medio de las cuales se puede hacer la identificación
presuntiva: Buen crecimiento en agar Mac Conkey o agar sangre, no produce citocromo
oxidasa, Produce ácido en OF maltosa pero puede ser negativa en OF glucosa, lisina
descarboxilasa positiva, DNasa positivo y algunas cepas tienen pigmento amarillo.

35
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

Si los bacilos gramnegativos no son los anteriormente mencionados, deben determinarse


otras características para la identificación de una especie. En la actualidad se utilizan
varios esquemas en los laboratorios clínicos. En muchos de ellos se utilizan híbridos de
los procedimientos usados en los esquemas publicados. El criterio de selección depende
en gran parte de la preferencia personal, la experiencia pasada y la disponibilidad de los
medios requeridos para realizar las distintas pruebas.

MATERIAL
Equipo y materiales: Incubadora, Microscopio y material de apoyo del laboratorio de
microbiología.
Medios de cultivo: Placas de agar Mac Conkey, Mueller Hinton, Agar sangre, Pruebas
bioquímicas (Kligler, LIA, MIO, caldo nitrato con campana, caldo urea, medio OF con
glucosa, medio OF con maltosa),
Reactivos: Colorantes para tinción de Gram, Reactivo de Kovacs, reactivo de oxidasa,
Alfanaftilamina, ácido sulfanílico, aceite mineral estéril, y solución de KOH al 40 %.
Biológicos: Cultivo de 24 horas de diferentes especies de Pseudomona aeruginosa,
Acinetobacter baumannii y Stenotrophomonas maltophilia

PROCEDIMIENTO
1. Sembrar las cepas proporcionadas por estría cruzada en agar sangre, agar Mac
Conkey y agar Mueller-Hinton.
2. Inocular cada cepa en la batería bioquímica proporcionada.
3. El medio OF sembrar por picadura en duplicado y agregar aceite mineral a un tubo.
4. Incubar los cultivos a 35oC, durante 24 horas.
5. Describir la morfología colonial y cambios observados en cada uno de los medios
utilizados.
6. Hacer un frotis, teñir con Gram y observar al microscopio.
7. Realizar la prueba de oxidasa (apéndices)
8. Revisar las pruebas metabólicas e identificar al microorganismo en estudio
comparando con tablas de identificación.

RESULTADOS
1. Describir la morfología colonial de cada cepa, en cada uno de los medios de cultivo.
Medio Pseudomona Acinetobacter Stenotrophomans
aeruginosa baumannii maltophilia
Agar Sangre
Agar Mac Conkey
Agar Mueller Hinton
(Pigmento)

2. Interpretar cada una de las pruebas bioquímicas (ver apéndices).


Prueba Bioquímica Pseudomona Acinetobacter Stenotrophomans
aeruginosa baumannii maltophilia

36
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

Oxidasa
Kligler
Fermentación de glucosa
Fermentación de lactosa
MEDIO MIO
Descarboxilación de Lisina
Movilidad
Indol
Medio OF
Metabolismo de glucosa
Metabolismo de Lactosa
Metabolismo de Maltosa
Lisina descarboxilasa
Reducción de nitrato
Gas de nitrato
Hidrólisis de urea

3. Comparar los resultados con la tabla de identificación para Bacilos Gramnegativos no


fermentadores.
4. Analizar los resultados
5. Hacer la Discusión y Conclusiones

PRACTICA No. 8
BACILOS GRAM NEGATIVOS OXIDASA (+) Y FERMENTADORES DE LACTOSA

HABILIDADES

Emplea medios de cultivo y pruebas bioquímicas adecuadas para el aislamiento


bacilos fermentadores oxidasa positiva. Así como reconoce las características
morfológicas y bioquímicas para la identificación de los principales especies, tomando
como referencia NOM-017-STPS-2008. Equipo de protección personal-Selección, uso y
manejo en los centros de trabajo; Manual-Microscopio óptico OLYMPUS y NOM-087-
ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental-Salud Ambiental-Residuos peligrosos biológico-
infecciosos - Clasificación y especificaciones de manejo.

37
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

INTRODUCCIÓN
Los principales géneros de importancia clínica que se caracterizan por ser bacilos
gramnegativos fermentadores, oxidasa negativos son: Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas y
Cromobacterium.
Las especies de Vibrio tienen tanto interés histórico como contemporáneo, V.
cholerae es el agente etiológico del cólera asiático en los seres humanos, una
enfermedad diarreica potencialmente grave, que se caracteriza por la aparición brusca de
diarrea acuosa y abundante, vómito, deshidratación rápida, acidosis, colapso circulatorio y
en casos no tratados se produce la muerte dentro de las primeras 24 horas. Los Vibrios
que se aíslan en seres humanos pueden dividirse en dos grupos: Vibrio cholerae y los
vibriones no coléricos. Las cepas de V. cholerae pueden ser divididas con base a su
antígeno somático en 139 serogrupos diferentes. Las cepas pandémicas se han
designado 01 y pueden separarse, además, en uno de los tres serotipos: Inaba. Ogawua
e Hikojima. Las cepas epidémicas serogrupo 01 pueden dividirse a su vez en
biovariedades, el clásico y El Tor.
La mayoría de los casos de vibriones no coléricos son menos graves y de menor
duración. Las afecciones extraintestinales producidas por Vibrio con más frecuencia son
infecciones de heridas cutáneas u otitis externa, por contaminación de la piel al nadar o
navegar en aguas marinas o después de manipulas mariscos crudos contaminados. Los
vibriones crecen fácilmente en los medios aislamientos utilizados (Agar sangre y
MacConkey), el crecimiento de todas las especies aumenta con el agregado de NaCl al
1% al medio. Las colonias son lisas, convexas, de consistencia cremosa, blanco
grisáceas y de bordes enteros. El TCBS es un medio diferencial útil para la identificación
presuntiva de V. cholerae, V. alginolyticuas, V. parahaemolitico y V. vulnificus. Los Vibrios
fermentadores de sacarosa forman colonias amarillas en el medio TCBS. Desde el punto
de vista microscópico, se observan bacilos gramnegativos, rectos o curvos.
El hábitat natural de las especies de Aeromonas es el agua dulce o el agua salada,
donde suelen causar enfermedades infecciosas en animales acuáticos de sangre fría.
Pueden causar cuatro categorías de infecciones humanas: gastroenteritis, celulitis e
infecciones de heridas, septicemia y otras infecciones.
El término Plesiomonas deriva de la palabra griega “vecino”, lo que indica una
estrecha relación con Aeromonas. P. shigelloides es ubicuo en las aguas superficiales y
en los suelos, e infecta distintos animales de sangre fría. Las Plesiomonas están
relacionadas con gastroenteritis en los seres humanos. Son bacilos Gramnegativos
móviles, rectos, redondeados y cortos con flagelos polares y generalmente lofótricos.
Algunas cepas de Cromobacterium son fermentadoras oxidasas positivas y pueden
confundirse con especies de Aeromonas, Vibrios o Plesiomonas. Cromobacterium
violaceum es la especie encontrada con mayor frecuencia en los laboratorios de análisis
clínicos, aunque rara vez se asocia con enfermedad humana. Crece bien en agar sangre
y la mayoría de las cepas producen abundante pigmento violeta.

MATERIAL
Equipo y materiales: Incubadora, Microscopio y material propio del laboratorio de
microbiología.

38
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

Medios de cultivo: Placas de Mac Conkey, TCBS, Agar sangre. Pruebas bioquímicas
(Kligler, LIA, MIO, caldo base rojo de fenol con glucosa + campana, Caldo base rojo de
fenol sacarosa, Caldo nutritivo, Caldo nutritivo + NaCl al 6%)
Reactivos: Colorantes para tinción de Gram, Reactivo de Kovacs, oxidasa.
Biológicos: Cultivo de 24 horas de Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides,
Cromobacterium violaceum y Vibrio cholerae.
PROCEDIMIENTO:
1. Sembrar cada cepa por estría cruzada en los medios proporcionados.
2. Inocular cada cepa en la batería bioquímica proporcionada.
3. Incubar los cultivos a 35oC, durante 24 horas.
4. Describir la morfología colonial y cambios observados en cada uno de los medios
utilizados.
5. Hacer un frotis, teñir con Gram y observar al microscopio.
6. Realizar la prueba de oxidasa (apéndice).
7. Revisar las pruebas metabólicas e identificar al microorganismo en estudio
comparando con tablas de identificación.

RESULTADOS

1. Describir la morfología colonial de cada cepa, en cada uno de los medios de cultivo.
Microorganismo Agar Agar Mac Conkey Agar TCBS
Sangre
Aeromonas hydrophila

Plesiomonas shigelloides

Cromobacterium violaceum

Vibrio cholerae

2. Hacer la interpretación de cada una de las pruebas bioquímicas (ver apéndices).


Prueba Bioquímica Aeromonas Plesiomonas Vibrio cholerae
hydrophila shigelloides
Oxidasa
KLIGLER
Fermentación de glucosa
Fermentación de lactosa
Caldo base rojo de fenol
Gas de glucosa
Gas de sacarosa
Fermentación de glucosa
Fermentación de sacarosa
MEDIO MIO
Movilidad
Descarboxilación de la ornitina
Producción de Indol

39
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

Lisina descarboxilasa
Crecimiento NaCl 0%
Crecimiento NaCl 6%

3. Comparar los resultados con tablas de identificación.


4. Analizar los resultados.
5. Hacer la discusión y conclusión.

PRACTICA No. 9
GÉNERO: Haemophilus spp

HABILIDADES
Aplica las características morfológicas (Macroscópicas y microscópicas) y
bioquímicas de las bacterias para identificar las principales especies de Haemophilus,
tomando como referencia NOM-017-STPS-2008. Equipo de protección personal-
Selección, uso y manejo en los centros de trabajo; Manual-Microscopio óptico OLYMPUS
y NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental-Salud Ambiental-Residuos
peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación y especificaciones de manejo.

INTRODUCCIÓN

Los miembros del género Haemophilus, son bacilos Gram negativos, inmóviles y
no esporulados. En materiales biológicos presentan un pleomorfismo que va desde

40
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

pequeños cocobacilos hasta bacilos largos filamentosos. Se trata de huéspedes


obligados, tal es así que salvo raras excepciones (ej. Haemophilus ducreyi) son
comensales de las mucosas del tracto respiratorio humano. Estas bacterias representan
alrededor del 10% de la microbiota habitual de la mucosa orofaríngea.
Actualmente se reconocen las siguientes especies como agentes causales de infecciones
en el género humano: Haemophilus influenzae, H. aegyptius, H. haemolyticus,
Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus parahaemolyticus, H. ducreyi, H. pittmaniae y
H. paraphrohaemolyticus. Gran parte de las especies de origen animal originariamente
incluidas en el género Haemophilus forman parte en la actualidad de los géneros
Pasteurella y Aggregatibacter. Estos últimos, además del género Haemophilus y nuevos
géneros, constituyen hoy la familia Pasteurellaceae.
Todas las especies de Haemophilus son anaerobias facultativas. Otra
característica distintiva es que para su desarrollo in vitro requieren factores adicionales
presentes en la sangre: factor X (hemina) y/o factor V (NAD). H. influenzae requiere
ambos mientras que la mayoría de las otras especies requiere solo uno. Desarrollan mejor
en atmósfera húmeda con 5 -10% de CO 2. H. influenzae requiere de ambos factores el
factor x se puede obtener mediante la digestión péptica de la sangre y el factor V que es
termolábil, se puede obtener a partir del extracto de levadura y es producido por ciertas
bacterias como Staphylococcus aureus.
La temperatura óptima de crecimiento es de 33 °C a 37 ºC. Las especies de
Haemophilus, excepto H. ducreyi, fermentan ciertos hidratos de carbono: glucosa,
sacarosa, lactosa, manosa y xilosa (Tabla1). Los productos finales obtenidos son los
ácidos succínico, láctico y acético.
El aislamiento primario de las especies de Haemophilus a partir de muestras
clínicas, por lo común se logra mediante el empleo de uno de los siguientes
procedimientos:
1. Agar chocolate que contiene ambos factores.
2. Técnica de la estría estafilocócica.
3. Agar sangre de Cassman y disco de bacitracina de 10 microgramos, a este medio hay
que agregarle la Nicotinamida y almidón de maíz, púes solo es ricoen cuanto al factor
x.
4. Agar Levinthal o agar con enriquecimiento de Fildes, Estos medios ya contienen los
factores x y V incluidos.
Las especies de Haemophilus reducen los nitratos, dan positiva la prueba de
fosfatasa alcalina y negativa la prueba de CAMP.
Según criterios taxonómicos tradicionales H. aegyptius no debería ser una especie
separada de H. influenzae. Existen entre ambos diferencias fenotípicas y serológicas:
H. aegyptius crece mal en medios semisólidos, no fermenta xilosa, es indol negativo y
tiene capacidad de hemaglutinar. También presenta dificultad para crecer en agar
chocolate y no crece en agar tripteína de soja con agregado de factores X y V. Por otra
parte, la experiencia clínica indica diferencias absolutas en el potencial patogénico de
ambos microorganismos. Sin embargo, ninguna de estas características los diferencia
inequívocamente. Además, estudios de hibridación de ADN revelan que son
filogenéticamente una única especie. Existe una amplia diversidad genética en el género

41
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

Haemophilus. Por ejemplo, los genomas de H. ducreyi y H. influenzae respectivamente


muestran poca homología.

MATERIAL
Equipo y materiales: Incubadora, Microscopio y material de apoyo del laboratorio de
microbiología.
Reactivos: Colorantes para tinción de Gram,
Biológicos: Cultivo de 24 horas de:
- Haemophilus influenzae
- Haemophilus parainfluenzae
- Staphylococcus aureus hemolítico
-
Medios de cultivo:
- Agar sangre
- Agar Soya tripticaseína
Otros materiales.
- Colorantes para la tinción de Gram
- Microscopios
- Aceite de inmersión
- Mecheros

MATERIAL TRAIDO POR EL EQUIPO


- Asa bacteriológica
- Portaobjetivos previamente desengrasados

PROCEDIMIENTO
1. En una placa de gelosa sangre y en otra de agar Soya tripticaseína, inocular
profundamente por estrías la cepa de Haemophilus influenzae.

42
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

2. Con el asa de inocular trazar una estría única, angosta de Staphylococcus aureus
hemolítico, atravesando el área donde se ha sembrado la cepa de Haemophilus
influenzae
3. Incubar a 37º C durante 24 a 48 horas en tensión de CO2.
4. Después del periodo de incubación buscar colonias muy pequeñas como gotitas de
rocio, que crecen en la Zona hemolítica (esto en el agar sangre) de la línea del
estafilococo. Las colonias del haemófilo se desarrollan como satélites y a este
fenómeno se le denomina satelitismo. Las colonias del haemófilo se hacen más
pequeñas a medida que aumenta su distancia de la línea de crecimiento del
Staphylococcus aureus. También se debe buscar el crecimiento de Haemophilus en
agar soya tripticaseína.
5. Realizar el mismo procedimiento con la cepa de Haemophilus parainfluenzae
6. De las colonias de haemófilos, hacer la descripción de la morfología colonial.
7. Hacer un frotis, teñir con Gram y observar al microscopio con el objetivo de inmersión
8. Hacer esquemas de todas las observaciones
9. Hacer prueba de oxidasa y catalasa.

HACER EL REPORTE TOMANDO ENCUENTA:


- RESULTADOS
- DISCUSIÓN
- CONCLUSIÓN

PRACTICA No. 10
BACILOS GRAM POSITIVOS (Bacillus subtilis y Listeria spp)

HABILIDADES
Aplica las características morfológicas (Macroscópicas y microscópicas) y
bioquímicas de las bacterias para identificar las principales especies de Bacillus subtilis y
Listeria spp, tomando como referencia NOM-017-STPS-2008. Equipo de protección
personal-Selección, uso y manejo en los centros de trabajo; Manual-Microscopio óptico
OLYMPUS y NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental-Salud Ambiental-
Residuos peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación y especificaciones de manejo.

INTRODUCCIÓN

43
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

La mayoría de los bacilos Gram positivos se encuentran ampliamente distribuidos


en la naturaleza y pueden formar parte de la microbiota normal tanto en el hombre como
en animales. Existen algunas especies virulentas e importantes en patología humana
como:

Bacillus
Características generales

Este género es prototipo de la familia Bacillaceae. Son BGP grandes y


esporulados, no exigentes y en general móviles. Incluye bacterias aerobias y anaerobias
facultativas. Están ampliamente distribuidos en la naturaleza; algunos forman parte de la
flora normal y suelen ser contaminantes del laboratorio.
El manual Bergey’s de sistemática bacteriana describe 34 especies, pero Bacillus
anthracis es el más importante en microbiología médica y veterinaria. Existe una gran
diversidad de contenido G+C en su genoma, 32-62 mol % dentro del género, lo que refleja
su gran heterogeneidad. Ciertos miembros del género tienen implicancias médicas por la
producción de antibióticos como polimixina y bacitracina, además de uso industrial en la
producción de solventes, enzimas, vitaminas, etc.

Bacillus anthracis
El carbunco o ántrax (evitar la confusión con el término carbunclo) fue una de las
primeras infecciones bacterianas para las cuales se estableció definitivamente la causa.
Dio lugar al desarrollo de la primera vacuna bacteriana que fue desarrollada por Louis
Pasteur. Es una enfermedad que afecta sobre todo a animales herbívoros, en particular
ovinos y bovinos. El hombre la adquiere de forma accidental: en el contexto agrícola como
una infección cutánea local, en el contexto industrial (manipuladores de cuero y pelo de
animal) como una neumonía (poco frecuente). Es entonces, una zoonosis y una
enfermedad laboral. Por producir endosporas altamente resistentes y ser capaz de
producir infecciones respiratorias graves, es un arma biológica potencial. De hecho, es
conocido el episodio de bioterrorismo que ocurrió en Estados Unidos hace algunos años,
que dio lugar a varias muertes y que alarmó enormemente al mundo entero.
Otros Bacillus de importancia

B. cereus
Es agente de toxiinfección alimentaria, es capaz de producir una
enterotoxina termoestable que produce vómitos y una termolábil responsable del
síndrome diarreico. El arroz y otros vegetales son los principales vehículos de
transmisión. En Uruguay, entre 1995 y 2001, se notificaron 3 brotes de
enfermedad transmitida por alimentos (ETA). Morfológicamente es similar a B.
anthracis pero se diferencia por ser móvil y resistente a la penicilina. Produce una
βlactamasa y es también resistente al trimetoprim-sulfametoxazol
.

44
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

Es agente también de infecciones oculares. Stearothermophilus: se utiliza como


control biológico en el autoclave.
B. subtilis presente en el aire y polvo, es un contaminante del laboratorio pero puede
producir enfermedad en inmunodeprimidos. Se utiliza como control biológico en el horno.
Pasteur y esterilización con ETO gas.
B. thuringiensis, es utilizado como pesticida por producir una toxina letal para ciertos
insectos.

Listeria
El género Listeria incluye bacilos Gram-positivos cortos, no esporulados, que aparecen
solos o en cortas cadenas. Las colonias son pequeñas, lisas y de color gris. Las especies
del género Listeria crecen en un rango de temperatura de 1-45oC, con una temperatura
óptima entre 30 y 37oC, y producen colonias pequeñas, lisas y de color grisáceo. Tienen la
capacidad de crecer en un rango de pH de 5.5-9.5 y a una concentración de NaCl de
hasta 10%. Su metabolismo es anaerobio facultativo. Las especies de Listeria presentan
un movimiento rotatorio de un extremo a otro a temperatura ambiente (22-25 oC), pero no
a 37oC. La gran mayoría de los aislamientos son catalasa-positiva y oxidasa-negativa. La
clasificación antigénica se basa en la tipificación de los antígenos O y H. Actualmente se
han descrito las siguientes especies en el género Listeria:

L. grayi
L. innocua
L. ivanovii
L. monocytogenes
L. murrayi
L. seeligeri
L. welshimeri
Todas las especies de Listeria son de amplia distribución en la naturaleza y se
encuentran en suelos y plantas, así como también contaminando vegetales, aguas,
carnes, mariscos, productos lácteos, etc. Solamente la especie L. monocytogenes puede
provocar infecciones en seres humanos, mientras que L. monocytogenes y L. ivanovii se
pueden aislar de animales. L. monocytogenes produce principalmente septicemia,
meningitis y encefalitis en adultos ancianos o con algún tipo de compromiso inmunológico
con baja inmunidad celular, como trasplantes, linfomas y SIDA. En mujeres embarazadas
producen bacteriemia y aborto y en neonatos provocan prematuridad, granulomatosis
infantisepticum y meningitis.

Corynebacterium
El género Corynebacterium está constituido por un gran número de especies con gran
heterogeneidad genética y fenotípica, y se caracterizan por ser bacilos Gram-positivos,
pleomóficos, no-esporulados, no-encapsulados, no-móviles, que pueden presentar
gránulos metacromáticos visibles mediante tinción con azul de metileno. Las especies de
Corynebacterium son catalasa-positiva y están ampliamente distribuidas en el ambiente,
pudiéndose encontrar en suelos y agua, como también constituyen parte importante de la
flora normal en piel y mucosas del ser humano y de animales. La especie más importante
es C. diphteriae, la cual es el agente responsable de la difteria, una infección del tracto

45
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

respiratorio superior con efectos sistémicos debido a la producción de la toxina diftérica.


La toxina diftérica se encuentra genéticamente codificada por un bacteriófago temperado,
por lo cual no todos los aislamientos de C. diphteriae son toxigénicos. C. diphteríae
también puede causar difteria cutánea en piel traumatizada.

Pruebas de identificación para Listeria, Erysipelothrix y Corynebacterium


Características fenotípicas de los géneros Listeria, Erysipelothrix y Corynebacterium.
Característica Listeria Erysipelothrix Corynebacterium
BG+, ligeramente
BG+, cortos, individuales o BG+, conos y/o largos
Morfo1ogía microscópica¹ curvos, tipo letra
en cadenas filamentosos
china
Catalasa + – +
Ureasa – – V
Motilidad (25 ºC) + – –
Acido a partir de glucosa + + +²
Producción de H2S – + –
Reducción de nitratos –³ – V
Características fenotípicas de especies de Listeria.
Cuadro 2. L. monocytogenes L. innocua L. ivanovii
Características
fenotípicas de especies
de Listeria.
Característica
Hemólisis β² + – ++
Reacción de CAMP
S. aureus (hemolisina + – –
β+)
R. equi – – +
Acido a partir de:
Glucosa + + +
Lactosa V + +
Manitol – – –
Ramnosa + V –
Ribosa – – +
Sacarosa – V V
Xilosa – – +
Reducción de nitratos – – –
MATERIAL
Equipo y materiales: Incubadora, a 37ºC Microscopio y material de apoyo del laboratorio
de microbiología.
- Frasco con vela (CO2)
Medios de cultivo: Placas con división de tres conteniendo
- Agar Soya tripticasa
- Agar Soya almidón
- Agar sangre,
Pruebas bioquímicas:
- Kligler
- Citrato de Simmons
- Caldo Nitrato
- Caldo urea
- Bilis esculina

46
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

- Tubos con Carbohidratos: con glucosa, maltosa, sacarosa y manitol


Reactivos:
- Colorantes para tinción de Gram
- Alfanaftilamina,
- Ácido sulfanílico
- Frasco de metanol
- Reactivo de catalasa
Biológicos: Cultivo de 24 horas de diferentes especies de cepas de Listeria, Bacillus,
Gardnerella y Lactobacillus

MATERIAL TRAIDO POR EQUIPO:


- Traer un Yakult o Yogur
- Asa y portasa - Alcohol
- Portaobjetos - Cuadros de algodón
- Lápiz con punta de diamante - Pinzas de disección
- Maskintape - Esponjas
- Marcador - Cerillos o encendedor
- Una regla con escala milimétrica
- Una lupa de mano

PROCEDIMIENTO
- Marcar los medios y Sembrar las cepas proporcionadas por estría en agar Soya
tripticasa, Agar sangre ( Sellar y colocar en frasco con vela (CO2) y Soya con almidón
- Inocular cada cepa en la batería bioquímica proporcionada.
- Hacer un frotis de las cepas proporcionadas y teñir con Gram y observar al
microscopio.
- Para la tinción de Lactobacillus, EL FROTIS SE FIJARÁ COLOCANDO LA
PREPARACIÓN EN LA ENCUBADORA DURANTE 5 MINUTOS, PASADO EL
TIEMPO COLOCAR 2 GOTAS DE METANOL A LA PREPARACIÓN dejar que actúe
durante 1 a 2 min y enseguida lavar el frotis, CONTINUAR CON LA TINCIÓN DE
GRAM.

- Incubar los cultivos a 37oC, durante 24 horas.


- Describir la morfología colonial y cambios observados en cada uno de los medios
utilizados.
- Realizar la prueba de catalasa y Oxidasa
- Analizar los tubos de cado nitrato agregando 2 gotas de Alfanaftilamina y 2 gotas de
Ácido sulfanílico
- Y revisar las pruebas metabólicas

LECTURA E INTERPRETACIÓN
PROCEDIMIENTO
1. Estriar las pacas con agar con cultivo bacteriano por división. (Ver figura)
2. Incubar a 37º C durante 24 horas
3. Al término del periodo de incubación, colocar unas gotas de solución de Lugol
alrededor del crecimiento (en cada estriado). Y en una zona en donde no haya
inoculado al microorganismo.
4. El almidón intacto toma una coloración azul violácea con el Lugol.

INTERPRETACION
DIGESTION DEL ALMIDON POSITIVO: Aparición de un halo claro alrededor de la estría.

47
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

DIGESTION DEL ALMIDON NEGATIVO: No se observa halo alrededor de la estría.

Listeria: Las colonias de Listeria, son medianas, cremosas, translúcidas, ligeramente


convexas de bordes regulares, con pequeños halos beta hemolítico, además de las
características macro y microscópicas de las colonias, se utiliza la prueba de la catalasa
que permite diferenciarlas del género Streptococcus.

ANALIZAR LOS RESULTADOS. Y HACER LA DISCUSIÓN Y CONCLUSIÓN


RESULTADOS
- Describir la morfología colonial de cada cepa, en cada uno de los medios de cultivo.
Medio Listeria Bacillus
Agar Sangre
Agar Soya tripticasa
Agar Soya almidón
Interpretación de cada una de las pruebas bioquímicas

TABLA DE RESULTADOS:
M.O.

PRUEBAS
Tubo con Glucosa
Tubo con Maltosa
Tubo con Sacarosa
Tubo con Manitol
KLIGLER
Glucosa
Lactosa
Gas
H2S
Citrato de Simmons
Caldo urea
Caldo Nitrato

48
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

Bilis esculina
Prueba de oxidasa
Prueba de catalasa

PRACTICA No. 11
CORINEBACTERIAS o EXUDADO FARÍNGEO

HABILIDADES

Reconoce los medios de cultivo y pruebas bioquímicas para la identificación de


Corinebacterias, así como las características de crecimiento sobre estos medios, tomando
como referencia NOM-017-STPS-2008. Equipo de protección personal-Selección, uso y
manejo en los centros de trabajo; Manual-Microscopio óptico OLYMPUS y NOM-087-
ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental-Salud Ambiental-Residuos peligrosos biológico-
infecciosos - Clasificación y especificaciones de manejo.

INTRODUCCIÓN

49
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

El género Corynebacterium está compuesto por muchas especies, que incluyen el


patógeno clásico C. diphtheriae, el agente causal de la difteria. Muchos de los
microorganismos del género Corynebacterium constituyen parte de la flora normal de la
piel y las vías respiratorias altas, pero han comenzado a ser relacionadas como agentes
importantes de enfermedades humanas.
El género Corynebacterium está compuesto por bacilos Gram positivos pleomóficos con
forma de porra o maza que son catalasa positiva, inmóvil, no esporulados y no ácido
alcohol resistentes. Las descripciones clásicas de este género incluye su tendencia a
formar disposiciones en cerca y en letras chinas sobre los teñidos con Gram. La mayoría
de las especies son facultativas y son fermentativas en su metabolismo de hidratos de
carbono, aunque algunas son no fermentativas o utilizan los hidratos de carbono en forma
oxidativa. Algunas especies también requieren de lípidos para su crecimiento óptimo
(lipofilia).
La identificación de especies de Corynebacterium y otras bacterias corineformes se
realiza originalmente con pruebas fenotípicas de la misma forma que para otras bacterias
facultativas. Los requerimientos lipídicos se determinan por la inoculación en superficie
del microorganismo en un medio que no contiene lípidos (Mueller-Hinton, BHI, agar soya
tripticasa) y colocando una gota de Tween 80 al 0.1% en el inóculo. Después de la
incubación las cepas lipofílicas muestran mayor crecimiento en el área de depósito del
Tween y un crecimiento escaso o nulo en las áreas alejadas al lípido.

MATERIAL
Equipo y material: Incubadora, Microscopio y material propio del laboratorio de
microbiología.
Medios de cultivo: Placas de agar sangre. Pruebas bioquímicas (Caldo urea, caldo
nitrato, medio SIM, caldo base rojo de fenol con glucosa, maltosa, sacarosa y xilosa)
Reactivos: Colorantes para tinción de Gram, Peróxido de hidrogeno 30%.
Biológicos: Cultivos de 24 horas de especies de Corynebacterium xerosis

PROCEDIMIENTO
1. Sembrar la cepa proporcionada por estría cruzada en agar sangre.
2. Inocular la cepa en el medio SIM, urea, caldo nitrato, maltosa, glucosa, lactosa y
xilosa.
3. Incubar los cultivos a 35oC, durante 24 horas.
4. Hacer un frotis, teñir con Gram y observar al microscopio.
5. Realizar la prueba de catalasa (apéndice 1)
6. Leer pruebas bioquímicas

RESULTADOS
1. Describir la morfología colonial, microscópica y el tipo de hemólisis que presente.

50
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

M.O. Agar Agar Agar Hemólisis Morfología


sangre Chocolate Nutritivo microscópica

2. Revisar las pruebas metabólicas e identificar al microorganismo en estudio comparando con


tablas de identificación.

Prueba Bioquímica
Catalasa
Medio SIM
Producción de H2S
Producción de Indol
Movilidad
Hidrólisis de urea
Reducción de nitratos
Ácido producido en anaerobiosis de:
Glucosa
Maltosa
Sacarosa
Xilosa

3. Comparar con tablas de referencia


4. Analizar los resultados
5. Hacer discusión y conclusiones.

PRACTICA No. 12
BACILOS GRAM POSITIVOS POCOS FRECUENTES (Microaerófilos)
(Gardnerella vaginalis y Lactobacillus)

HABILIDADES
Aplica las características morfológicas (Macroscópicas y microscópicas) y
bioquímicas de las bacterias para identificar, tomando como referencia NOM-017-STPS-
2008. Equipo de protección personal-Selección, uso y manejo en los centros de trabajo;
Manual-Microscopio óptico OLYMPUS y NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección
ambiental-Salud Ambiental-Residuos peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación y
especificaciones de manejo.

INTRODUCCIÓN
Gardnerella vaginalis

51
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

Son bacilos o cocobacilos Gram variables, inmóviles, pleomorfos y aerobios. Se


asocian con frecuencia a otros gérmenes anaerobios y constituyen la llamada vaginosis
bacteriana La vaginosis bacteriana (VB) es la causa más frecuente de aumento del flujo
vaginal en las mujeres en edad fecunda. Aunque no se considera una enfermedad de
transmisión sexual, se ha demostrado que la actividad sexual es un factor de riesgo, ya
que su incidencia aumenta al aumentar el número de parejas sexuales recientes a lo largo
de la vida y al tener una nueva pareja.
Gardnerella vaginalis es considerada como un patógeno de transmisión sexual sin
embargo sus hallazgo no siempre se relaciona al factor de actividad sexual pues se ha
encontrado, en mujeres sanas sin manifestaciones clínicas, por lo que también se le
considera como un habitante normal de la flora vaginal, que solo con la presencia de otras
bacterias se manifiesta clínicamente como responsable de la vaginitis inespecífica. Su
presencia en la uretra masculina o en el glande no ha sido usualmente, considerada como
clínicamente significativa. Gardnerella vaginalis ha sido relacionada con patologías como
endometritis, cistitis, aminionitis, septicemia, neonatal, meningitis, vaginitis inespecífica,
balanitis, entre otras.

Lactobacillus:

Son bacilo microaerófilos, Gram positivos y catalasa negativos, estos organismos forman
ácido láctico como producto principal de la fermentación de los azúcares. Los
Lactobacilos homofermentativos dan lugar a ácido láctico como producto principal de
fermentación. Este grupo está integrado por Lactobacillus caucasicus, Lactobacillus
bulgaricus, Lactobacillus lactis, Lactobacillus acidophilus y Lactobacillus delbrueckü. Los
Lactobacilos heterofermentativos producen además de ácido láctico, dióxido de carbono
etanol y otro productos volátiles; Lactobacillus fermenti es heterofermentativo y es capaz
además, de dar buen crecimiento a temperaturas elevadas (45 ºC, 113 ºF).

Característica del Microorganismo: Morfológicamente, algunos bacilos son bastones


delgados y largos; otros son algo parecido al colibacilo, pero, al contrario de este, todos
son Gram positivos. Casi todos son inmóviles, pero se han señalado excepciones.
Muchos cultivos muestran una forma diplobacilar característica, a menudo reniforme.
Frecuentemente los cultivos viejos muestran considerable pleomorfismo.

Los Lactobacilos, son microaerófilos o anaerobios, pero después de cultivos continuos,


algunas cepas pueden desarrollarse en presencia de aire. Sus necesidades nutritivas son
complejas, y la mayor parte de las cepas no puede cultivarse en los medios nutritivos
ordinarios, q menos que se enriquezcan con glucosa y suero. Las necesidades
individuales de aminoácidos varían de dos a 15; en general, se requiere piridoxina,
tiamina, riboflavina, biotina, ácido fólico y ácido nicotínico, variando las necesidades en
cada caso. Estos requerimientos nutritivos variados tienen aplicación práctica en técnicas
de dosificación microbiológica de vitaminas y de algunos aminoácidos, para los cuales
son más sensibles que los métodos químicos disponibles. En concentración adecuada,
hay cierta relación definida, incluso lineal, entre la concentración de vitamina en un medio
de cultivo adecuado, pero exento de vitamina, y el desarrollo o la cantidad de ácido
producidos.

Algunos bacilos forman parte de la flora intestinal normal y pueden predominar en


lactantes e individuos con ingestión elevadas de azúcares, especialmente lactosa. Se
supuso que la flora intestinal de lactobacilo era preferible a una flora proteolítica de

52
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

coliformes, ya que tendía a inhibir los trastornos degenerativos aumentando la vitalidad en


personas de edad avanzada, y que esa flora podía establecerse consumiendo leches
fermentadas o leches búlgaras y acidófilos. De esta manera puede alterarse la
composición de la flora intestinal, y también mediante el consumo de cantidades
equivalentes de leche azucarada, pero el cambio es pasajero, y no está demostrado que
esa flora intestinal por sí misma favorezca la salud.

Aunque se han encontrado raros casos de relación de Lactobacilos con procesos


patológicos como endocarditis y enfermedad febril, estas bacterias esencialmente no son
patógenas, excepto las raras veces que pueden relacionarse con caries dentales. Son
fundamentalmente interesante en la industria de derivados lácteos y de fermentación,
donde tienen importancia considerable. La clasificación de los Lactobacilos se ha basado
en la fuente de donde se aislaron.

Algunas especies de lactobacilos:

Clasificación de los grupos de Lactobacilos

Homofermentati Heteroferment
vos ativos

Termófilos Mesófilos Termófilo Mesófilo

Hel Jugurt Bulgaricus Lactis ÁcidoPhilu casei Plantaru Fermenti Brevis


veti i s m s
cus

53
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

Cultivo a 15º - - - - - + + - +

45º + + + + + - - + -

Resistencia a 60º / 90 + - + - - - - -
min

65º / 30 - - + - - - - -
min
1,2 –
Ácido (%) en la leche 2,7 2,7 1,7 1,7 0,8 0,3 – 1,2 0,5 0,5
1,5

Tipo de ácido láctico DL Dl D D DL L DL DL DL

Producción CO2 - - - - - - - + +
de (azúcares)

NH3 - - - - - - - + +
(arginina)

Cultivo en NaCl 2% - - - + + + + +
presencia de

NaCl 4 & - - - - + + + +

Teepol 0,4 - + - +
%

Exigencias nutritivas a) RP RP R RC RFC PF - T TF

Fermentación de - - - - - - +/- - +
pentosas b)
1,2,3,4 1,2,3,4 1,2,3,4
Fermentación de otros 1 (4) - 1,2,3, , 1, (4,5),8 1,5
azúcares c) (4) 4 (5), 6, 7 5,6,7,8,
6,7,9,0
9,0

Hidrólisis de la esculina - - - - - + + - +/-

Grupo Serológico A A E E ¿ B, C D F E
(Sharpe)

MATERIAL

54
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

Equipo y material: Incubadora, Microscopio y material propio del laboratorio de


microbiología.
- Mecheros
- Gradillas
- Pipetas automatizada
- Puntas azules estériles
Medios de cultivo:
- Placas de agar sangre.
- Agar Mueller Hilton
Pruebas bioquímicas:
- Hidrolisis del hipurato
- Reactivos:
- Colorantes para tinción de Gram,
- Reactivo de catalasa.
- Solución de hipurato en tubo de13x100 con 1 ml. Uno por equipo
- Cloruro férrico (1 frasco son solución)
Biológicos: Cultivos de 24 horas de especies de
- Gardnerella vaginalis
- Lactobacillus

MATERIAL TRAIDO POR EQUIPO:


- Asa y portasa - Alcohol
- Portaobjetos - Cuadros de algodón
- Lápiz con punta de diamante - Pinzas de disección
- Maskintape - Esponjas
- Marcador - Cerillos o encendedor
- Una regla con escala milimétrica
- Una lupa de mano
PROCEDIMIENTO
1. Sembrar las cepas proporcionadas por estría cruzada en las placas de agar sangre
combinada con Mueller Hilton para Inocular las pruebas metabólicas indicadas.
2. Incubar la cepa 37oC, las placas de agar sangre se incuban en tensión de CO 2,
durante 24-48 horas.
3. Hacer un frotis del microorganismo, teñir con Gram, observar al microscopio. Y leer
morfología colonial.
4. Realizar la prueba de catalasa
5. Revisar las pruebas metabólicas e identificar al microorganismo.
NOTA: Para la prueba de hidrólisis del Hipurato se realiza colocando en tubo de 13x100, 1
ml de suspensión bacteriana y 1 ml de hipurato, homogeneizar e incubar 30 min y
enseguida agregar a tubo 3 a 5 gotas de cloruro férrico (FeCl) y observar:
PRUEBA POSITIVA: Color marrón oscuro en el medio.
PRUEBA NEGATIVA: No hay cambio de color, el medio persiste de color claro

RESULTADOS
1. Describir la morfología colonial y microscópica de cada uno de los microorganismos
en los diferentes medios y el tipo de hemólisis que presenten.

Microorganismo Agar sangre Hemólisis Agar Mueller Morfología microscópica


Hilton

55
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

2. Interpretar las pruebas bioquímicas realizadas.

Hidrolisis del
Microorganismo Catalasa hipurato

3. Analizar los resultados

Hacer la discusión y conclusiones


Ejemplo: Agar Sangre

Gardnerella
Lactobacillus

PRACTICA No. 13
NEISERIAS
HABILIDADES
Conoce la morfología microscópica y colonial de las Neiserias patógenas y
saprofitas, así como sus características diferenciales tomando como referencia NOM-017-
STPS-2008. Equipo de protección personal-Selección, uso y manejo en los centros de
trabajo; Manual-Microscopio óptico OLYMPUS y NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección
ambiental-Salud Ambiental-Residuos peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación y
especificaciones de manejo.

INTRODUCCIÓN
Los miembros del género Neisseria son microorganismos Gramnegativos
baciliformes o con forma de cocos que por lo general se encuentran en pares o cadenas
cortas. Las especies diplococos tienen sus caras adyacentes aplanadas, lo que les
confiere el aspecto de granos de café. Todas las especies del género Neisseria viven en la
superficie de las mucosas de huéspedes de sangre caliente. Estos microorganismos son
inmóviles, no forman esporas, y la mayoría de las especies crecen en forma óptima entre
35°C y 37°C. Son capnófilos y se desarrollan mejor en ambientes húmedos. Las especies

56
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

de Neisseria producen ácidos en forma oxidativa a partir de hidratos de carbono. Todas


las especies del género son oxidasa positiva y (excepto subespecies de N. Elongata)
son catalasa positiva.
N. gonorroheae es el agente causal de la gonorrea, una infección de transmisión
sexual de enorme importancia en salud pública. N. Meningitidis es un patógeno primario
que produce un espectro de procesos infecciosos que varían desde una sepsis oculta con
recuperación rápida hasta una enfermedad abrumadora fulminante con un desenlace
fatal. La manisfetación clínica más grave de la enfermedad meningocócica es la
meningitis. Las cepas virulentas de N. meningitidis poseen una cápsula de polisacáridos
situada en la parte exterior de la membrana externa, la cual confiere resistencia a los
microorganismos contra la fagocitosis, particularmente en ausencia de anticuerpos
opsonizantes. Las especies patógenas de Neisseria también producen otros factores que
se suponen que contribuyen a su virulencia. Las condiciones nutricionales y atmosféricas
también contribuyen a la virulencia de los gonocos y los meningococos.
La naturaleza exigente de N. gonorroheae y N. meningitidis, requiere de medios
selectivos para su aislamiento, que incluyen el medio de Thayer- Martín modificado
(MTM), el medio de Martín-Lewis (ML), el medio New York City (NYC) y el medio GC-lect.
Todos estos preparados contienen antimicrobianos que inhiben a otros microorganismos y
permiten la recuperación selectiva de estos microorganismos. La vancomicina y la
colistina inhibe a las bacterias grampositivas y gramnegativas (con inclusión de especies
saprofitas de neisseria) respectivamente. Se agrega Trimetroprima para inhibir la
diseminación de especies de Proteus. La nistatina, la anfotericina B o la anisomicina se
agregan para inhibir levaduras y hongos. El MTM y el ML son medios con base de agar
chocolate suplementados con factores de crecimiento para microorganismos exigentes.

MATERIAL
Equipo y material: Incubadora, Microscopio y material propio del laboratorio de
microbiología.
Medios de cultivo: Placas de agar sangre Agar chocolate suplementado, agar nutritivo
Pruebas bioquímicas (Agar CTA con glucosa, CTA con maltosa, CTA con fructosa, CTA
con lactosa)
Reactivos: Colorantes para tinción de Gram, Peróxido de hidrogeno 30%, reactivo de
oxidasa.
Biológicos: Cultivos de 24 horas de especies de Neisseria

PROCEDIMIENTO
1. Sembrar las cepas proporcionadas por estría cruzada en las placas de agar chocolate,
agar sangre, y agar nutritivo.
2. Inocular cada una de las cepas en el medio CTA más maltosa, glucosa, fructosa y
lactosa.
3. Incubar los cultivos a 35oC en tensión de CO2, durante 24 horas.
4. Hacer un frotis de cada microorganismo, teñir con Gram y observar al microscopio.
5. Realizar la prueba de catalasa (apéndice)
6. Realizar la prueba de oxidasa (apéndice)

57
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

7. Revisar las pruebas metabólicas e identificar al microorganismo.

RESULTADOS
8. Describir la morfología colonial y microscópica de cada uno de los microorganismos en los
diferentes medios y el tipo de hemólisis que presenten.

M.O. Agar Agar Agar Hemólisis Morfología


sangre Chocolate Nutritivo microscópica

9. Interpretar las pruebas bioquímicas realizadas.

Microorganismo Oxidada Catalasa Glucosa Maltosa Fructosa Lactosa

10. Comparar resultados con el cuadro 3.


11. Analizar los resultados
12. Hacer la discusión y conclusiones.

58
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

59
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

60
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

Reactivos: Colorantes para tinción de Gram,


Biológicos: Cultivo de 24 horas de:
- Clostridium spp
- Bacteroides spp

PROCEDIMIENTO
1. Hacer un frotis de las cepas proporcionadas y teñirlas con Gram. Observar al
microscopio y anotar la morfología de las bacterias.
2. Sembrar las cepas proporcionadas por dispersión, agregando una gotas del cultivo en
las placas de agar sangre y la caja con gelosa bilis esculina,
3. Incubar en anaerobiosis a 37º C durante 48 horas.
4. Describir la morfología colonial y el tipo de hemólisis en caso de presentarse
5. Confirmar la presencia de anaerobiosis realizando las pruebas de aerotolencia
6. Para hacer la identificación bioquímica confirmativa, propagar la colonia aislada del
microorganismo problema en un tubo con caldo Tioglicolato enriquecido.
7. Sellar el tubo con aceite mineral estéril en la parte superior e incubar a37ºC por 24-48
horas.
8. Realizar la lectura de las pruebas bioquímicas tomando 2 gotas de cada reactivo e
identificar al microorganismo.
9. Analizar los resultados
10. Hacer la discusión y conclusiones

61
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

PRACTICA No. 15
TINCION DE ZIEHL NEELSEN

HABILIDADES
El estudiante
- Aplica el mecanismo de la tinción de Ziehl Neelsen, con microorganismo conocidos y
desconocidos.
- Utiliza una técnica de coloración para la diferenciación de microorganismo ácido
alcohol resistente, tomando como referencia NOM-017-STPS-2008. Equipo de
protección personal-Selección, uso y manejo en los centros de trabajo; Manual-
Microscopio óptico OLYMPUS y NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental-
Salud Ambiental-Residuos peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación y
especificaciones de manejo.

NORMATIVIDAD Y BIOSEGURIDAD
- NOM-017-STPS-2008. Equipo de protección personal-Selección, uso y manejo en los
centros de trabajo.
- NOM-087-ECOL-SSA1-2002. Protección ambiental - Salud ambiental - Residuos
peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación y especificaciones de manejo.
- Manual. Microscopio óptico OLYMPUS.

INTRODUCCION

La tinción de Ziehl Neelsen es otro tipo de coloración diferencial que separa los
géneros Mycobacterium y Nocardia del resto de las bacterias.
Los géneros mencionados presentan característicamente un alto contenido de
ácidos grasos de cadena muy larga, los ácidos micólicos y nocardicos respectivamente.
Estos ácidos parecen jugar un papel fundamental en la respuesta de las bacterias a esta
coloración.
En esta técnica se utiliza fucsina básica o fenicada como colorante primario, esta
solución se aplica con calentamiento a emisión de vapores. Como agente decolorante se
aplica una mezcla de etanol y ácido sulfúrico o ácido clorhídrico. El azul de metileno es el
colorante secundario.

62
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

La explicación que se da a la respuesta a la coloración involucra varios factores,


por un lado, se ha postulado que el alto contenido de ácidos grasos intervienen
decisivamente y al calentar el colorante primario a emisión de vapores, se favorece la
disolución de los ácidos grasos y se permite el paso del colorante al interior de la célula.
Al suspender el calentamiento y lavar con agua fría se provoca una nueva solidificación
de los ácidos grasos de modo que el colorante se ve impedido totalmente de salir de las
bacterias; por otra parte, el calentamiento aumenta la energía cinética de las moléculas
del colorante lo cual también facilita su entrada a las bacterias. Por último, se ha
postulado que el complejo colorante-fenol es más soluble en los lípidos bacterianos que el
agente decolorante, lo cual contribuye a su permanencia en el interior de las células;
puesto que el proceso de decoloración es muy enérgico, cualquier bacteria que no
contenga abundante lípidos como Mycobacterium y Nocardia perderá fácilmente el
colorante primario y fijará entonces el azul de metileno.
Las bacterias que resisten la decoloración son llamadas BACTERIAS ACIDO
ALCOHOL RESISTENTES (BAAR), y se observan de color rojo. LAS BACTERIAS NO
ACIDO ALCOHOL RESISTENTES (NO BAAR) se observan de color azul.

MATERIAL
- Cultivos bacterianos mixtos de 24 horas en tubo de bacterias ácido alcohol resistentes
(baar) y no ácido alcohol resistentes (no baar).
- Cepas puras de 24 horas con crecimiento masivo de bacterias ácido alcohol
resistentes placas (Mycobacterium y Nocardia) y no ácido alcohol resistentes
- Incluir Vibrio cholerae
- Microscopios suficientes REACTIVOS PARA TINCION DE
- Mecheros ZIEHL NEELSEN:
- Aceite de inmersión - Fucsina fenicada o básica
- Papel seda para lentes -Alcohol ácido
- Puente para tinción - Azul de metileno.
- Frasco gotero con agua destilada

MATERIAL TRAIDO POR EL ESTUDIANTE O EQUIPO

- Pinza de disección - Lápiz graso o lápiz con punta de


diamante
- Portaobjetos - Cerillos o encendedor
- Asa y portaasa - Dos rollos de algodón
- alcohol

PROCEDIMIENTO

1. Hacer 2 frotis de las cepas proporcionadas, dejar secar al aire y fijarlos al calor
(como se indicó en la práctica anterior).
2. Colocar el frotis sobre el puente para tinción
3. Cubrir la preparación con solución de FUCSINA FENICADA O FUCSINA BASICA
DURANTE 5 MINUTOS A EMISION DE VAPOR.
Es decir calentar suavemente el portaobjeto con la flama de mechero o bien pase la
flama utilizando un rollo de algodón humedecido con alcohol y sostenido con una
pinza de disección. Hasta que desprenda vapor.
4. Mantener la emisión de vapores durante 5 minutos. Observar que el colorante no
debe secarse ni hervir (añadir más colorante si es necesario).

63
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

5. Dejar enfriar el portaobjetos, escurrir el colorante y en seguida lavar con un chorro


suave de agua.
6. Cubrir la preparación con el DECOLORANTE ALCOHOL- ACIDO Y DEJELO
ACTUAR DURANTE 30 A 60 SEGUNDO. Hasta que no aparezca más colorante en
el lavado.
7. Escurrir y lavar con un chorro suave de agua.
8. Cubrir el frotis con AZUL DE METILENO Y DEJELO ACTUAR DURANTE 1
MINUTO
9. Escurrir y lavar con un chorro suave de agua.
10. Dejar secar la preparación completamente al aire en forma vertical y observar con
el objetivo 100 x utilizando aceite de inmersión.

RESULTADOS:

- LAS BACTERIAS ACIDOS ALCOHOL RESISTENTES SE TIÑEN DE COLOR ROJO.


(BAAR)

- LAS BACTERIAS NO ACIDOS ALCOHOL RESISTENTES SE TIÑEN DE COLOR


AZUL. (NO BAAR).

NOTA: EL COLORANTE INDICADO, DEBERA CUBRIR UNICAMENTE EL


EXTENDIDO DE LA PREPARACION.

INTRUCCIONES:
- Hacer 2 preparaciones de los cultivos proporcionados.
- Observar una preparación fija
- Tomar fotografía de la morfología observada de cada uno de los especímenes para su
reporte
- Quitar el aceite del objetivo con papel seda para lentes.
- Limpiar los objetivos del microscopio con algodón humedecido con alcohol.
- Colocar el microscopio en el lugar indicado.

DIVERSIDAD DE FORMA Y AGRUPACION DE ORGANISMOS PROCARIOTICOS

FORMA AGRUPACION EJEMPLO DE BACTERIA


1. ESFERICA (COCOS) Diplococcus Neisseria meningitidis
Staphylococcus Staphylococcus aureus
Streptococcus Streptococcus pyogenes
Tetracoccus Pediococcus spp.
Sarcinas Sarcina luteus

FORMA AGRUPACION EJEMPLO DE BACTERIA


2. DE BASTON (BACILOS)
BACILOS CORTOS AISLADOS INDIVIDUAL MUCHAS
ENTEROBACTERIAS
BACILOS LARGOS DIPLOBACILOS (Escherichia , Salmonella,
ESTREPTOBACILOS etc.

64
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

Klebsiella pneumoniae
Lactobacillus

FORMA AGRUPACION EJEMPLO DE BACTERIA


3.CURVA O ESPIRAL
CURVA AISLADOS INDIVIDUAL Treponema
ESPIRAL AISLADOS INDIVIDUAL Vibrio

LITERATURA CITADA

- Díaz; R. G. y Goñi, L.I. Manual Práctico de Microbiología (2009) Ed. Masson,


Barcelona.
- Koneman, W. E. Aller, S.D. Janda, W.M. Schreckenberger. P.C. (2008).
Diagnóstico Microbiológico; 5ª. ed; Ed. Panamericana; España.
- Prescott, L.M., J.P. Harley y D.A. Klein. (2000) Microbiología. McGraw-Hill
Interamericana. Madrid. .
- Manual de Prácticas de microbiología. (2017) ENCB del IPN. México, DF.
- Ramírez G. RM., Luna M.B., Velázquez M.O., Vierna G.L, et al. (2000).
Laboratorio de Microbiología Experimental. Fac. de Química, UNAM. México,
D.F.

INFORME.

De acuerdo al cuadro anterior y en base a la técnica de tinción Ziehl Neelsen y las


observaciones. Indique en la tabla siguiente, la morfología microscópica y la reacción de
Ziehl Neelsen de cada microorganismo

MORFOLOGIA MICROSCOPICA
FORMA AGRUPACION ZIEHL NEELSEN MICROORGANISMO
(BAAR O NO BAAR)

ESCRIBA LA DISCUSION Y CONCLUSION DE ESTA PRÁCTICA.

65
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

66
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

67
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

68
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

ANEXOS

Anexo 1

INSTRUCCIONES PARA PREPARAR REACTIVOS Y COLORANTES

1. ALCOHOL ACETONA
Acetona .........................................................................50 ml
Alcohol etílico.................................................................50 ml
Mezclar los ingredientes respectivos

2. ALCOHOL ÁCIDO
HCL concentrado ...........................................................3 ml
Alcohol etílico al 70 %.....................................................100 ml
Agregar lentamente el ácido en el alcohol.

3. ÁCIDO SULFANILICO
Ácido sulfanílico..............................................................0.8 g
Ácido acético (5N), 30 %...............................................100 ml
Agregar el ácido sulfanílico en el acético.

4. ALFA-NAFTILAMINA
Alfa- naftilamina..............................................................5 g
Ácido acético (5N), 30 %................................................100 ml
Agregar el alfa-naftilamina en el ácido.

5. ALFA-NAFTOL
Alfa- naftol......................................................................5 g
Alcohol etílico absoluto...................................................100 ml
Disolver el alfa-naftol en el alcohol. Proteger de la luz y refrigerar.

6. AZUL DE METILENO
Azul de metileno.............................................................0.3 g
Alcohol etílico al 95 %.....................................................30 ml
Agua destilado................................................................100 ml

7. CARBOLFUCSINA
Cristales de fenol...........................................................2.5 g
Alcohol al 95%................................................................5 ml
Fucsina básica................................................................0.5 g
Agua destilada................................................................100 ml
Disolver la fucsina en el alcohol y el fenol en el agua, mezclar las dos soluciones.

8. CRISTAL VIOLETA
Cristal violeta..................................................................2.0 g
Alcohol etílico al 95 %.....................................................20 ml
Oxalato de amonio..........................................................0.8 g
agua destilada................................................................100 ml
Disolver el cristal violeta en el alcohol y el oxalato de amonio en el agua. Mezclar
las dos soluciones.

69
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

9. CLORURO FERRICO
Cloruro férrico.................................................................10 g
HCL concentrado ...........................................................2.5 ml
Agua destilada................................................................100ml

10. HIDROXIDO DE POTASIO.


KOH................................................................................40g
Agua destilada................................................................100 ml

11. KOVAC PARA INDOL


P-dimetilaminobenzaldehido...........................................10 g
Alcohol amílico o isoamílico puro...................................150 ml
HCL concentrado............................................................50 ml
Disolver el aldehído en el alcohol por calentamiento suave en baño maría, enfriar y
agregar el ácido. Proteger de la luz y refrigerar.

12. KOVAC PARA OXIDASA


Clorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina......................1.0 g
Agua destilada...............................................................100 ml
Proteger de la luz refrigerar y evitar la oxidación agregando ácido ascórbico al 1%.

13. LUGOL
Yoduro de potasio ..........................................................2.0 g
Cristales de yodo...........................................................1.0 g
Agua destilada................................................................1.0 g
Mezclar bien y conservar en un frasco ámbar con tapón esmerilado.

14. ROJO DE METILO


Rojo de metilo......................................................... 0.1 g
Alcohol etílico al 95%.............................................. 300 ml
Agua destilada......................................................... 200 ml
Disolver El indicador de pH en el alcohol etílico, agregar el agua destilada.

15. SAFRANINA
Safranina O ...................................................................2.5 g
Alcohol etílico al 95 %.....................................................100 ml
Disolver la safranina en el alcohol. La solución de trabajo se prepara diluyendo 10 ml
de la solución madre en 100ml de agua destilada.

70
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

Anexo 2

NEFELOMETRICO DE Mc FARLAND

1. Utilizar 11 tubos de ensaye de igual tamaño y buena calidad que hallan sido
cuidadosamente lavados y enjuagados.

2. Preparar ácido sulfúrico al 1%.

3. Preparar una solución acuosa de cloruro de bario puro al 1%.

4. Colocar en el tubo las cantidades de cada solución indicadas en el siguiente cuadro,


completando 10 ml por tubo.

5. Sellar los tubos. La suspensión de sulfato de bario formada corresponde


aproximadamente, en el intervalo estándar, a las concentraciones de una suspensión
homogénea de Escherichia coli, según se indica en el cuadro.

Tubo No. 0.5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Cloruro de bario 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1
(ml)

Acido sulfurico 9.95 9.9 9.8 9.7 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9

Densidad celular 1.5 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30


aproximada
(x 108/ml)

Anexo 3

71
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

TINCIONES

TINCIÓN DE GRAM

1. Hacer un frote, dejar al aire y fijarlo al calor


2. Cubrir el frote con solución cristal violeta durante 1 minuto.
3. Escurrir el colorante y lavar con agua corriente suave de la llave.
4. Cubrir el preparado con lugol durante 1 minuto.
5. lavar nuevamente como se indicó anteriormente.
6. Sostener el portaobjetos sobre el pulgar y el índice y bañar la superficie con
unas gotas de decolorante alcohol –acetona hasta no arrastrar más colorante
violeta. Esto requiere habitualmente unos 10 segundos o menos.
7. Lavar con agua corriente.
8. Cubrir la superficie con safranina durante 30 segundos.
9. Dejar secar el extendido y observar a inmersión

TINCIÓN DE ZIEHL NEELSEN

1. Hacer un frote, dejar secar al aire y fijarlo al calor.


2. Colocar el portaobjeto en el puente de tinción.
3. Cubra toda la superficie del portaobjeto fucsina fenicada
4. Utilizando una llama de hisopo de algodón con alcohol caliente suavemente el
portaobjetos hasta que se desprenda el vapor, pero sin dejar que se seque
(añadir mas colorante si es necesario), durante 5 minutos.
5. Escurrir el colorante y lavar con agua corriente.
6. Cubra el portaobjeto con la solución decolorante (alcohol ácido) y manténgalo
sobre el portaobjetos durante 3 minutos.
7. Enjuague una vez más el portaobjeto e inclínelo para quitar el exceso de agua. Si
el portaobjetos aún está rosa, aplique una cantidad adicional de la solución
decolorante de 1 a 3 minutos. hasta que no aparezca más colorante en el lavado.
8. Aplicar la solución de contraste, azul de metileno durante 1 minuto.
9. Vuelva a enjuagar, escurrir y dejar secar al aire.
10. Observe al microscopio con el objetivo 100 X de aceite de inmersión.

Anexo 4

72
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

Agar bilis esculina

Este medio es útil para la detección selectiva de estreptococos del grupo D. Determina si
un microorganismo es capaz de hidrolizar la esculina en presencia de bilis.
Agar 15.00 g
Extracto de carne 3.00 g
Peptona 5.00 g
Bilis de buey 40.00 g
Esculina 1.00 g
Citrato férrico 0.5 g
Agua destilada 1000 mL
pH final 7.0

Preparación: Suspender 64 g del medio en un litro de agua destilada. Dejar remojar de 5 a


10 minutos. Mezclar y calentar agitando hasta ebullición, dejar enfriar a 50° C y ajustar el
pH indicado. Distribuir en tubos de 16 x 125 mm un volumen de 5 mL. Esterilizar a 121° C
por 15 minutos, enfriar en posición inclinada.

Agar citrato de Simmons

Determina si un microorganismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente de


carbono para el metabolismo, produciendo alcalinidad.

Agar 15.00 g
Azul de bromotimol 0.08 g
Citrato de sodio 2.00 g
Cloruro de sodio 5.00 g
Fosfato dihidrogenado de amonio 1.00 g
Fosfato dipotásico 1.00 g
Sulfato de magnesio 0.20 g
Agua destilada 1000 mL
pH final 6.9 + 0.2

Preparación: Suspender 24.2 g del medio en un litro de agua destilada. Dejar remojar de 5
a 10 minutos. Mezclar y calentar agitando hasta ebullición, dejar enfriar a 50° C y ajustar
el pH indicado. Distribuir en tubos de 13 x 100 mm un volumen de 4 mL. Esterilizar a 121°
C por 15 minutos, enfriar en posición inclinada.

Agar Columbia

Medio para aislar Gardnerella vaginalis. Se le adiciona sangre humana debido a que este
microorganismo es -hemolítico en este tipo de sangre, pero no en sangre de otros
animales.

73
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

Peptona especial 23.00 g


Agar 10.00 g
Cloruro de sodio 5.00 g
Almidón 1.00 g
pH final 7.2 + 0.2

Preparación: Suspender 3.9 gramos de medio deshidratado en 100 ml de agua destilada,


mezclar. Dejar reposar de 5 a 10 minutos, hervir durante un minuto. Esterilizar a 121° C
por 20 minutos. Después de esto enfriar a 45 – 50° C. Añadir de 5 a 10 mL de sangre
humana, homogenizar y vaciar a placas.

Agar Eosina Azul de Metileno (EMB)

Medio selectivo y diferencial para el cultivo y aislamiento de enterobacterias.

Agar 15.00 g
Azul de metileno 0.065 g
Eosina 0.04 g
Fosfato dipotásico 2.00 g
Lactosa 5.00 g
Saxarosa 5.00 g
Peptona especial 10.00 g
Agua destilada 1000 mL
pH final 7.2 + 0.2

Preparación: Rehidratar 36 g del medio de cultivo en un litro de agua destilada. Calentar


hasta el punto de ebullición para disolver el medio por completo. Dejar enfriar
aproximadamente a 50 ° C y ajustar al pH indicado. Distribuir en matraces sin sobrepasar
las 2/3 partes del volumen del total del matraz, esterilizar a 121° C por 15 minutos. Dejar
enfriar a 50° C y vaciar en cajas de Petri estériles.

74
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

Agar fenilalanina

La fenilalanina es un aminoácido que por desaminación forma un cetoácido, el ácido


fenilpirúvico.

Agar 12.00 g
DL-fenilalanina 2.00 g
Extracto de lelvadura 3.00 g
Cloruro de sodio 5.00 g
Fosfato de sodio 1.00 g
Agua destilada 1000 mL
pH final 7.3

Preparación: Suspender 23 g del medio en un litro de agua destilada. Dejar remojar de 5 a


10 minutos. Mezclar y calentar agitando hasta ebullición, dejar enfriar a 50° C y ajustar el
pH indicado. Distribuir en tubos de 13 x 100 mm un volumen de 4 mL. Esterilizar a 121° C
por 15 minutos, enfriar en posición inclinada.

Agar gelatina

Se utiliza para determinar la capacidad de la bacteria de hidrolizar la gelatina.

Extracto de carne 3.00 g


Peptona 5.00 g
Gelatina 120.00 g
Agua destilada 1000 mL
pH final 6,8

Preparación: Suspender 128 g del medio en un litro de agua destilada. Dejar remojar de 5
a 10 minutos. Mezclar y calentar agitando hasta ebullición, dejar enfriar a 50° C y ajustar
el pH indicado. Distribuir en tubos de 13 x 100 mm un volumen de 4 mL. Esterilizar a 121°
C por 15 minutos, enfriar en posición recta

Agar Hierro Lisina (LIA)

Medio muy útil para diferenciar tempranamente cepas de enterobacterias como


Salmonella y Arizona de Citrobacter. Se basa en la descarboxilación de la Lisina,
formación de sulfuros y fermentación de glucosa. También detecta desaminación oxidativa
de la lisina.

Agar 15.00 g
Citrato de amonio férrico 0.50 g
Extracto de levadura 3.00 g
Glucosa 1.00 g
L-lisina 10,00 g
75
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

Peptona de gelatina 5.00 g


Púrpura de bromocresol 0.02 g
Tiosulfato de sodio 0.04 g
Agua destilada 1000 mL
pH final 6.7

Preparación: Suspender 34.5 g del medio en un litro de agua destilada. Dejar remojar de 5
a 10 minutos. Calentar cuidadosamente agitando con frecuencia y hervir durante un
minuto, o hasta la disolución completa del agar, dejar enfriar a 50° C y ajustar el pH
indicado. Distribuir en tubos de 13 x 100 mm un volumen de 4 mL. Esterilizar a 121° C
por 15 minutos, enfriar en posición inclinada.

Agar Kligler (KIA)


Medio utilizado para determinar la capacidad de un microorganismo de atacar la glucosa o
lactosa con producción o no de gas, junto con la determinación de posible producción de
ácido sulfhídrico.

Agar 12.00 g
Peptona 15.00 g
Peptona proteosa 5.00 g
Cloruro de sodio 5.00 g
Extracto de carne 3.00 g
Lactosa 10.00 g
Glucosa 1.00 g
Tiosulfato de sodio 0.3 g
Sulfato ferroso 0.2 g
Rojo de fenol 0.024 g
Agua destilada 1000 mL
Preparación: Suspender 51 g del medio en un litro de agua destilada. Dejar remojar de 5 a
10 minutos. Mezclar y calentar agitando hasta ebullición, dejar enfriar a 50° C. Distribuir
en tubos de 13 x 100 mm un volumen de 4 mL. Esterilizar a 121° C por 15 minutos, enfriar
en posición inclinada.

Agar Mac Conkey

Medio empleado ampliamente para aislar e identificar selectivamente a enterobacterias a


partir de heces, orinas, aguas negras y diversos alimentos.

Agar 13.50 g
Peptona de gelatina 17.00 g
Mezcla de peptonas 3.00 g
Mezcla de sales biliares 1.50 g
Lactosa 10.00 g
Cloruro de sodio 5.00 g
Rojo neutro 0.03 g
Cristal violeta 0.001 g
Agua destilada 1000 mL
pH final 7.1 + 0.2

76
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

Preparación: Rehidratar 50 g del medio de cultivo en un litro de agua destilada, remojar


bien durante 10 a 15 minutos. Calentar hasta el punto de ebullición para disolver el medio
por completo. Dejar enfriar aproximadamente a 50 ° C y ajustar al pH indicado. Distribuir
en matraces sin sobrepasar las 2/3 partes del volumen del total del matraz, esterilizar a
121° C por 20 minutos. Dejar enfriar a 50° C y vaciar en cajas de Petri estériles unos 20
mL por caja. Dejar solidificar para evitar que se deposite un exceso de humedad en la
superficie del medio.

Agar Mueller – Hinton

Es un medio muy rico en nutrientes que se recomienda en las pruebas de sensibilidad.


Agar 17.00 g
Infusión de carne de res 300.00 g
Peptona de caseína ácida 17.5 g
Almidón 1.50 g
Agua destilada 1000 mL
pH final 7.4 + 0.2
Preparación: Suspender 38 g del medio deshidratado comercial en un litro de agua
destilada. Remojar de 10 a 15 minutos. Mezclar bien agitando frecuentemente. Hervir
durante un minuto, dejar enfriar aproximadamente a 50 ° C y ajustar al pH indicado.
Distribuir en matraces sin sobrepasar las 2/3 partes del volumen del total del matraz,
esterilizar a 121° C por 20 minutos. Dejar enfriar a 50° C y vaciar en cajas de Petri
estériles aproximadamente 30 mL por caja y dejar solidificar.

Agar Sacarosa, sales biliares-citrato-tiosulfato (TCBS)

Medio empleado para el aislamiento de Vibrio cholerae y otros Vibrios enteropatógenos.

Agar 14.00 g
Azul de bromotimol 0.04 g
Azul de timol 0.04 g
Bilis de buey 5.00 g
Citrato férrico 1.00 g
Citrato de sodio 10.00 g
Cloruro de sodio 10.00 g
Desoxicolato de sodio 3.00 g
Extracto de levadura 5.00 g
Polipeptona 10.00 g
Sacarosa 20.00 g
Tiosulfato de sodio 10.00 g
Agua destilada 1000 mL
pH final 8.6+0.2

Preparación: Suspender 88 g del polvo en un litro de agua destilada, calentar agitando


constantemente hasta ebullición y completa disolución. Dejar hervir un minuto, enfriar a

77
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

45° C. Ajustar al pH indicado con NaOH 1 N y vaciar en cajas de Petri estériles, 30 mL por
placa. No se esteriliza.

Agar Salmonella Shigella

El agar SS se emplea ampliamente para aislamiento de Salmonella y Shigella inhibiendo


el desarrollo de los bacilos coliformes. Puede diferenciar las cepas fermentadoras de la
lactosa de las no fermentadoras.

Agar 13.50 g
Extracto de carne 5.00 g
Peptona 5.00 g
Mezcla de sales biliares 8.50 g
Lactosa 10.00 g
Citrato de sodio 8.50 g
Tiosulfato de sodio 8.50 g
Citrato férrico 1.00 g
Rojo neutro 0.025 g
Verde brillante 0.33 g
Agua destilada 1000 mL

Preparación: Rehidratar 60 g del medio de cultivo en un litro de agua destilada, remojar


bien durante 10 a 15 minutos. Calentar hasta el punto de ebullición para disolver el medio
por completo. Dejar enfriar aproximadamente a 50 ° C y vaciar en cajas de Petri estériles.

Agar Sal y Manitol

Medio empleado para aislamiento selectivamente de estafilococos patógenos, ya que


muchas bacterias son inhibidas por la alta concentración salina.

Agar 15,00 g
Extracto de carne 1.00 g
Proteasa peptona 10.00 g
Manitol 10.00 g
Lactosa 10.00 g
Cloruro de sodio 75.00 g
Rojo de fenol 0.025 g
Agua destilada 1000 mL

Preparación: Rehidratar 111 g del medio de cultivo en un litro de agua destilada, remojar
bien durante 10 a 15 minutos. Calentar hasta el punto de ebullición para disolver el medio
por completo. Dejar enfriar aproximadamente a 50 ° C. Distribuir en matraces sin
sobrepasar las 2/3 partes del volumen del total del matraz, esterilizar a 121° C por 20
minutos. Dejar enfriar a 50° C y vaciar en cajas de Petri estériles.

78
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

Agar Sulfito de bismuto

Es un medio altamente selectivo para el aislamiento de Salmonella typhi, así como bacilos
entéricos de heces, aguas negras, aguas de bebidas y diversos alimentos.

Agar 20.00 g
Mezcla de peptonas 10.00 g
Extracto de carne 5.00 g
Dextrosa 5.00 g
Fosfato dipotásico 4.00 g
Sulfato ferroso 0.30 g
Indicador de sulfito de bismuto 8.00 g
Verde brillante (solución acuosa al 5%) 5.0 mL
Agua destilada 1000 mL

Preparación: Suspender 52 g del medio de cultivo en un litro de agua destilada. Dejarlo


remojar de 10 a 15 minutos para obtener un buen gel. Hervir no mas de un minuto
agitando continuamente para que se disuelva completamente el agar. Dejar que el medio
se enfríe entre 50° y 55° C y sin dejar de agitarlo vacíe en cajas de Petri estériles no
menos de 20 mL del medio fluido. Las placas deben permanecer descubiertas hasta que
se seque la superficie del medio y usarlo el mismo día. Evite el sobrecalentamiento.

Agar Thayer-Martin

Se recomienda este medio para el aislamiento de Neisseria gonorrhoeae a partir de


cualquier muestra de flora mixta y también para el aislamiento de N. Meningitidis a partir
de materiales nasofaríngeos y de garganta..

Agar base GC 72.00 g


(doble concentración)
Agar 10.00 g
Agua destilada 1000 mL

Preparación: Suspender el medio deshidratado en agua destilada, mezclar y calentar con


agitación. Hervir durante un minuto, esterilizar a 121° C por 15 minutos. Simultáneamente
esterilizar una suspensión de 20 g de hemoglobina dehidratada en un litro de agua
durante 15 minutos (la suspensión debe ser homogénea antes de esterilizar).
Enfriar ambas a 50° C, mezclarlas asépticamente y luego agregar 20 ml de IsoVilaeX
(BBL) y 20 ml de inhibidor V-C-N (BBL). Vaciar en cajas de Petri estériles unos 20 mL por
caja. Dejar solidificar y refrigerar.

Agar Xilosa Lisina Desoxicolato

El medio XLD es útil para el aislamiento de patógenos entéricos, especialmente las


Shigella..
Agar 13.50 g

79
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

Xilosa 3.50 g
L-lisina 5.00 g
Sacarosa 7.50 g
Lactosa 7.50 g
Cloruro de sodio 5.00 g
Rojo de fenol 0.08 g
Extracto de levaduras 3.00 g
Desoxicolato de sodio 2.50 g
Tiosulfato de sodio 6.80 g
Citrato de hierro y amonio 0.80 g
Agua destilada 1000 mL
pH final 7.4

Preparación: Disolver el medio en agua destilada calentando justo hasta el punto de


ebullición, agitando con frecuencia. No dejar que hierva. Enfriar aproximadamente a 50 °
C y ajustar al pH indicado. Vaciar en cajas de Petri estériles unos 20 mL por caja. Debe
tener un color rojo naranja y ser prácticamente transparente.

Base de agar sangre (BAB)

Medio para aislar u cultivar diversos microorganismos. Al añadir sangre este medio puede
usarse para descubrir la actividad hemolítica y para aislar estreptococos y otros Gram
positivos.

Infusión de músculo cardiaco 37.50 g


Peptona de carne 10.00 g
Cloruro de sodio 5.00 g
Agar 15.00 g
pH final 7.3 + 0.2

Preparación: Suspender 40 gramos de medio deshidratado en un litro de agua destilada,


mezclar. Dejar reposar de 5 a 10 minutos, hervir durante un minuto, dejar enfriar
aproximadamente a 50° C. Ajustar el pH indicado y vaciar en matraces sin sobrepasar los
2/3 de volumen. Distribuir en tubos de 13 x 100 mm si se necesita BAB sin sangre. Tapar
y esterilizar a 121° C por 20 minutos. Después de esto enfriar a 45 – 50° C. Vaciar a las
placas para obtener BAB medio en placa sin sangre. Añadir de 5 a 10 mL de sangre
estéril de borrego, conejo o humana, homogenizar y vacie a placas o tubos. Incubar a 35°
C durante 24 horas para comprobar esterilidad.

Caldo base rojo de fenol

Este medio puede usarse como base para determinar las reacciones de fermentación de
carbohidratos.

Hidrolizado pancreático de caseína 10.00 g


Cloruro de sodio 5.00 g
Rojo de fenol 0.018 g

80
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

Agua destilada 1000 mL


pH final 7.4

Preparación: Disolverer 1.5 g en 90 ml agua destilada y mezclar. Si es necesario, se


calienta hasta disolver. Por otro lado disolver 1 gramo del carbohidrato en 10 ml de agua.
Mezclar las dos solucionesy distribuir en tubos de 13 x 100 mm un volumen de 4 mL.
Puede colocarse un tubo de Durham en los tubos con medio para detectar la formación de
gas. Esterilizar a 121° C por 10 minutos.

Caldo infusión cerebro corazon


Este caldo se recomienda para el cultivo de neumococos para la prueba de solubilidad en
bilis y oros microorganismos nutricionalmente exigentes. Se le puede adicionar agar
Infusión cerebro de ternera 200.00 g
Infusión de corazón bovino 250.00 g
Proteasa de peptona 10.00 g
Glucosa 2.00 g
Cloruro de sodio 5.00 g
Fosfato disódico 2.50 g
Agua destilada 1000 mL
pH final 7.4
Preparación: Disolverer los componentes en agua destilada y mezclar. Si es necesario, se
calienta hasta disolver. Ajustar el pH indicado y distribuir en tubos de 13 x 100 mm un
volumen de 4 mL. Esterilizar a 121° C por 15 minutos.

Caldo nitrato

Este caldo se utiliza para la prueba de reducción de nitratos a nitritos, adicionando


reactivos para la detección de este último.

Extracto de carne 3.00 g


Peptona 5.00 g
Nitrato de potasio 1.00 g
Agua destilada 1000 mL
pH final 7.3

Preparación: Disolverer 9 g del medio en un litro de agua destilada y mezclar. Si es


necesario, se calienta hasta disolver. Ajustar el pH indicado y distribuir en tubos de 13 x
100 mm un volumen de 4 mL. Esterilizar a 121° C por 15 minutos. Se puede adicionar
campana de Durham para detectar la producción de gas.

Caldo rojo de metilo – Voges Proskauer (MR-VP)

81
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

Medio líquido empleado para efectuar las reacciones indicadas de rojo de metilo y acetil-
metil-carbinol del grupo Echerichia/Enterobacter.

Mezcla de peptonas 7.00 g


Dextrosa 5.00 g
Fosfato de potasio 5.00 g
Agua destilada 1000 mL
pH final 6.9 +1

Preparación: Disolverer 17 g del medio en un litro de agua destilada y mezclar. Si es


necesario, se calienta hasta disolver. Ajustar el pH indicado y distribuir en tubos de 13 x
100 mm un volumen de 4 mL. Esterilizar a 121° C por 15 minutos.

Caldo tetrationato

Es un medio líquido de enriquecimiento, empleado para aislar Salmonella typhi y otras


salmonelas provenientes de heces, agua de albañal, alimentos, etc.

Mezcla de peptonas 5.00 g


Sales biliares 1.00 g
Carbonato de calcio 10.00 g
Tiosulfato de sodio 30.00 g
pH final 8.0

Preparación: Mezclar bien y calentar a ebullición. Dejar enfriar y distribuir en tubos de 16 x


150 mm con tapón de rosca un volumen de 10 mL cada uno. No esterilizar en autoclave.
Momentos antes de usarlo agregar 0.2 mL (2 a 3 gotas) de la siguiente solución de yodo
yodurada a cada tubo.

Yodo en cristales 6g
Yoduro de potasio 5g
Agua destilada 20 mL

Caldo urea

Para la diferenciación de microorganismos según la capacidad de hidrolizar la urea.

Extracto de levadura 0.1 g


Fosfato disódico 9.5 g
Fosfato monopotásico 9.1 9
Urea 20.00 g
Rojo de fenol 0.01 g
Agua destilada 1000 mL
pH final 6.8 + 0.2

82
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

Preparación: Disolver 3.87 g del medio en 100 mL de agua destilada. Cuando el polvo se
ha disuelto, filtrar a través de un filtro bacteriológicol pH indicado. Distribuir en tubos de
13 x 100 mm un volumen de 4 mL. Esterilizar a 121° C por 15 minutos, enfriar en posición
inclinada.

Gelosa chocolate
Se pueden utilizar como base los siguientes componentes:
Agar infusión de res
Agar base sangre
Agar Mueller-Hinton
Preparación: Adicionar un suplemento como el polienrriquecimiento liofilizado y
reconstituido de Bioxon. Preparar un volumen a doble concentración de la base y
adicionar volúmenes de suspensión de hemoglobina estéril al 2%.

Medio CTA

Para la diferenciación de especies de Neisseria según la capacidad de utilizar


carbohidratos.

Cistina 0.50 g
Digerido pancreático de caseína 20.00 g
Agar 3.50 g
Cloruro de sodio 5.00 g
Rojo de fenol 0.017 g
Sulfito de sodio 0.50 g
Agua destilada 1000 mL

Preparación: Para preparar 250 mL pesar 7.1 g del medio deshidratado y suspenderlo en
250 mL de agua destilada. Pasar a matraces de 50 mL y Esterilizar a 121° C por 15
minutos.
Preparar soluciones al 20% de los carbohidratos a usar: fructosa, lactosa,
sacarosa y maltosa, pesar 0.5 g del carbohidrato y suspenderlo en 2.5 mL de agua.
Colocar en condiciones asépticas a cada matraz, la solución de carbohidrato
correspondiente, la cual previamente se ha esterilizado por filtración de membrana de
0.45  de poro. Agitar y pasar 5 mL a tubos chicos con tapón de rosca y estériles. Rotular
los tubos con el carbohidrato que tienen. Una vez enfriados, se incuban a 35° C durante
24 horas, para comprobar su esterilidad. Finalmente se guardan en bolsas de plástico
bien cerradas y se conservan en refrigeración.

Medio Oxidación Fermentación

Permite la detección de ácidos producido por agentes metabolizantes débiles.


Peptona o triptona 2.00 g
Fosfato dipotásico 0.30 g
Agar 2.50 g
Cloruro de sodio 5.00 g

83
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

Azul de bromotimol 0.03 g


Agua destilada 1000 mL

Preparación: Pesar 9.8 g del medio deshidratado y suspenderlo en un litro de agua


destilada. Pasar a matraces en porciones de 200 mL y Esterilizar a 121° C por 15 minutos.
Preparar soluciones al 10% de los carbohidratos a usar: fructosa, lactosa, sacarosa y
maltosa, pesar 2 g del carbohidrato y suspenderlo en 20 mL de agua.
Colocar en condiciones asépticas a cada matraz, la solución de carbohidrato
correspondiente, la cual previamente se ha esterilizado por filtración de membrana de 0.2
 de poro. Agitar y pasar 5 mL a tubos chicos con tapón de rosca y estériles. Rotular los
tubos con el carbohidrato que tienen. Una vez enfriados, se incuban a 35° C durante 24
horas, para comprobar su esterilidad. Finalmente se guardan en bolsas de plástico bien
cerradas y se conservan en refrigeración.

Medio Stuart

Medio utilizado para el transporte de muestras clínicas.

Glicerofosfato de sodio 10.00 g


Tioglicolato de sodio 1.00 g
Cloruro de calcio dihidratado 0.10 g
Agua destilada 1000 mL

Preparación: Mezclar cuidadosamente los componentes. Fraccionar en tubos de 16 x 125


mm con tapon de rosca, 5 mL. Por tubo. Esterilizar a 121° C por 10 minutos. Ajustar las
tapas y conservar los tubos a temperatura ambiente.|

84
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

Anexo 5

INTERPRETACIÓN PRUEBAS BIOQUÍMICAS

AGAR HIERRO DE KLIGLER o TSI

a) utilización de hidratos de carbono


 PICO ALCALINO ( ROJO) / FONDO ALCALINO ( ROJO ) = K / K
No hay fermentación de azúcares, característica de bacterias no
fermentadoras como Pseudomonas aeruginosa
 PICO ALCALINO ( ROJO ) / FONDO ACIDO ( AMARILLO ) = K / A
Glucosa fermentada, lactosa no fermentada
 PICO ALCALINO ( ROJO ) / FONDO ACIDO ( NEGRO ) = K / A / H2S
Glucosa fermentada, lactosa no fermentada, producción de H2S,
característico de bacterias no fermentadoras de lactosa y productoras de
H2S como especies de Salmonella, especies de Citrobacter, especies de
Arizona y algunas especies de Proteus.
 PICO DE FLAUTA ACIDO / PROFUNDIDAD ACIDA (A / A)
Glucosa y lactosa ( o sacarosa con agar TSI ) fermentadas. Característico de
coliformes que fermentan lactosa como Escherichia coli y grupo Klebsiella –
Enterobacter.
b) producción de gas CO2 y H2.
Se manifiesta de las siguientes maneras:
 Una sola burbuja de gas

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

 Burbuja en el medio
 Desdoblamiento del medio
 Desplazamiento completo del medio hacia arriba del tubo, dejando un área
clara.
c) producción de ácido sulfhídrico
La capacidad de ciertas bacterias para liberar azufre de aminoácidos y otros
compuestos que lo contienen, se detecta por la presencia de un precipitado de color
negro resultado de reaccionar el gas H 2S con un indicador como el sulfato ferroso. Puede
estar distribuido parcial o totalmente en toda la capa profunda o a lo largo de la picadura.

AGAR HIERRO LISINA (LIA)


Este medio nos sirve para medir la capacidad que tienen las bacterias de
descarboxilar el aminoácido lisina con liberación de la amina cadaverina de reacción
alcalina.
El agar se prepara en pico de flauta y se siembra por picadura y estría. Se incuba a 37 oC
durante 18 a 24 horas.

Interpretación
a) Descarboxilación de la lisina ( lisina positiva )
- Pico de flauta y fondo de color morado, reacción alcalina.
- Pico de flauta color morado ( alcalino ) y fondo transparente, reacción
intermedia o neutra.
b) No descarboxilación de la lisina ( lisina negativa )
- La presencia de cualquier reacción ácida ( amarilla ) ya sea en el
pico de flauta o en el fondo.

c) Producción de ácido sulfhídrico


- En este medio también se puede observar la producción de ácido
Sulfhídrico que se hace visible por el ennegrecimiento del medio.
d) Desaminación de la lisina
- En pico de flauta reacción ácida, color rojo
- Capa profunda reacción ácida, color amarillo.

CAMP

La actividad hemolítica de la -hemolisina producida por la mayoría de los


Staphylococcus aureus es intensificada por una proteína extracelular producida por los
estreptococos del grupo B. La interacción de la -hemolisina con este factor produce una
hemólisis sinérgica, que puede observarse fácilmente en una placa de agar sangre.

86
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

1. Hacer en el centro de una placa de agar sangre una única estría en línea recta con
Staphylococcus aureus productor de -hemolisina.
2. Teniendo cuidado de no tocar la estría del estafilococo, realizar una estría de los
estreptococos betahemolíticos a identificar, en forma perpendicular a la estría de
estafilococos. Realizar estas estrías de tal manera que, después de la incubación, el
desarrollo de los microorganismos no se junte. La estría de estreptococos debe ser de
3 a 4 cm de longitud, en la misma placa debe sembrarse en forma similar cepas
conocidas de estreptococcus del grupo A y grupo B como controles negativos y
positivos respectivamente.
3. Incubar las placas a 37°C en are atmosférico durante 18 a 24 horas.

Interpretación
Se observa una zona de mayor hemólisis cuando la -hemolisina secretada por el
estafilococo y el factor CAMP secretado por los estreptococos del grupo B se intersectan.

Estreptococo no

Pertenece al grupo B

Estría de estafilococo

Estreptococos del
Grupo B

CATALASA

La catalasa es una enzima que descompone el peróxido de hidrógeno (H 2O2) en


oxígeno y agua. Químicamente la catalasa es una hemoproteína, de estructura similar a la
hemoglobina, excepto que los cuatro átomos de hierro de la molécula están en estado
oxidativo (Fe 3+) en lugar de reducido ( Fe 2+ ). Excluyendo los estreptococos, la mayoría
de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas poseen actividad de catalasa, la
mayoría de las bacterias anaerobias descomponen el peróxido de hidrógeno con
peroxidasa semejantes a la catalasa, salvo que cada molécula contiene un ion férrico.
El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo
oxidativo o aerobio de los hidratos de carbono, si se deja acumular, el peróxido de
hidrógeno es letal para las células bacterianas. La catalasa convierte al peróxido de
hidrógeno en agua y oxígeno, como lo demuestra la siguiente reacción:

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

Catalasa
H2O2 H2O + O2 (Burbujas de gas)
La prueba de catalasa, llevada a cabo en portaobjetos o en tubos es muy
comúnmente utilizada para diferenciar estreptococos (negativos) de estafilococos
(positivos ) o especies de bacilos Grampositivos y micobacterias.
Procedimiento
1. Con una aguja de inoculación o un palillo de madera, transferir parte del centro de una
colonia bien aislada a la superficie de un portaobjeto.
2. Agregar una gota de peróxido de hidrógeno al 3 % y observar la formación de
burbujas.
Interpretación
La aparición rápida y sostenida de burbujas o efervescencia constituye una
reacción positiva.. la observación de unas pocas burbujas pequeñas después de 20 a 30
segundos no se considera un resultado positivo. Debe tenerse cuidado de no tomar
eritrocitos junto con el material de la colonia.

COAGULASA

La coagulasa es una enzima proteica de composición química desconocida, que


tiene actividad similar a la protrombina, capaz de transformar el fibrinógeno en fibrina, lo
que da como resultado la formación de un coágulo visible en los sistemas apropiados. Se
piensa que in vivo la coagulasa produce una barrera de fibrina en la localización de la
infección estafilocócica. En el laboratorio, la prueba de coagulasa se utiliza para identificar
Staphylococcus aureus y diferenciarlo de otras especies de estafilococos.
La coagulasa se presenta en dos formas, libre y unida; y cada una posee diferentes
propiedades que requieren el uso de distintos procedimientos de ensayo.
Procedimiento
1. Colocar en un tubo de ensaye estéril, 0.5 ml de plasma de conejo o humano.
2. Emulsificar una pequeña cantidad de colonia del microorganismo en el plasma.
3. Se incuba a 35oC de tres a cuatro horas y observar si se forma un coágulo
inclinando ligeramente el tubo.
Interpretación
La prueba de coagulasa en tubo se considera positiva si se detecta cualquier
grado de formación de coágulos.

FOSFATASA ALCALINA

La actividad de fosfatasa es una actividad frecuente entre los aislamientos de


estafilococos humanos y esta actividad podría ser constitutiva en algunas especies y
reprimida por los fosfatos en otras. Geary y Stevens publicaron un método simple en
medio sólido (agar PNP) que utiliza agar de Mueller Hinton tamponado a pH de 5.6 – 5.8 y

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

que contiene p- nitrofenilfosfato (0.495 mg/mL). Estos autores encontraron que el 83% de
S. epidermidis eran PNP positivos.
Procedimiento
1. Sembrar en forma de mancha el microorganismo en una placa de PNP.
2. Incubar de 18 a 24 horas a 35°C.
Interpretación
La presencia de un color amarillo brillante por debajo y alrededor del inóculo constituye
una prueba positiva.

FENILALANINA DESAMINASA

La fenilalanina es un aminoácido que por desaminación forma un cetoácido, ácido


fenilpirúvico. Algunas enterobacterias poseen la enzima desaminasa necesaria para esta
conversión. La prueba de fenilalanina depende de la detección de ácido fenilpirúvico en el
medio de prueba después del crecimiento del microorganismo en estudio. Se inocula el
pico de flauta del medio. Después de incubar a 35 oC durante 24 horas, se agregan de 4 a
5 gotas de cloruro férrico al 10 % directamente a la superficie del agar. A medida que se
agrega el reactivo, se gira el tubo para desalojar a la colonia de la superficie.

Interpretación
La aparición inmediata de un intenso color verde indica la presencia de ácido fenilpirúvico
y una prueba positiva.

FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS

Caldo base rojo de fenol se utiliza comúnmente para ver la capacidad de un


organismo de degradar un carbohidrato específico incorporado al medio, produciendo
ácido o ácido con gas. La tripteína es un hidrolizado de caseína que se incluye en las
fórmulas de los medios para proveer carbono y nitrógeno, el cloruro de sodio actúa como
estabilizador osmótico y como inhibidor del desarrollo de muchas especies bacterianas
que son contaminantes comunes del medio ambiente. El rojo de fenol es un indicador de
pH que hace virar los medios al amarillo, si la producción de ácidos hace que el pH
descienda por debajo de 6.8. El hidrato de carbono en estudio se añade a esta base hasta
una concentración final de 0.5 al 1 %. Se recomienda autoclavar primero la base de
fermentación, añadiendo luego la solución de hidrato de carbono esterilizada por filtración,
para evitar la degradación hidrolítica del azúcar y la posibilidad de resultados falsos
negativos.
Interpretación
- Prueba positiva: Color amarillo
- Prueba negativa: Color rojo

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

HIDRÓLISIS DE ESCULINA

Esta prueba se basa en la capacidad de ciertas bacterias, particularmente los


estreptococos del grupo D y especies de Enterococcus, de hidrolizar esculina en
presencia de bilis al (4 % de sales biliares o 40% de bilis). La esculina es un derivado
glucosídico de la cumarina (6--glucósido-7-hidroxicumarina). Los dos residuos de la
molécula (glucosa y aglucona 7 – hidroxicumarina) se encuentran unidos por una unión
éster de oxígeno. Para esta prueba la esculina se incorpora a un medio que contenga 4%
de sales biliares.
Las bacterias bilis esculina positivas son primero de nada capaces de desarrollarse en
presencia de sales biliares. La hidrólisis de la esculina en el medio da como resultado la
formación de glucosa y un compuesto denominado esculetina. Esta a su vez reacciona
con los iones férricos (aportado por el componente de citrato férrico en el medio
inorgánico) para formar un complejo negro que se difunde.
1. Sembrar el microorganismo en el pico de flauta del medio bilis esculina con un
movimiento en S o estriar la superficie de una placa.
2. Incubar el tubo o la placa a 35°C durante 24-48 horas.
Interpretación
El ennegrecimiento difuso de más de la mitad del pico de flauta dentro de las 24-
48 horas indica la hidrólisis de la esculina.

HIDRÓLISIS DE GELATINA

Se incorpora gelatina a diversos medios para determinar la capacidad de un


organismo de producir enzimas de tipo proteolítico que, a su vez, son detectadas por la
digestión o licuefacción de gelatina presente. Estas enzimas que son capaces de la
gelatinólisis, se denominan gelatinasa.
Se inocula el medio de gelatina nutritiva por punción profunda, se incuban los
tubos de prueba y de control sin inocular a 22 – 25 oC o 35oC por 24 – 48 hora. Se
refrigeran los tubos media hora antes de hacer la lectura.
Interpretación
- Prueba positiva: Gelatina líquida
- Prueba negativa: Gelatina sólida.

HIDRÓLISIS DE UREA

La urea es una diamina del ácido carbónico. Todas las amidas se hidrolizan
fácilmente, con liberación de amoniaco y dióxido de carbono. La ureasa es una enzima
que poseen muchas especies de microorganismos, que pueden hidrolizar la urea.

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

En el medio líquido se siembra con una asada del cultivo puro del microorganismo a
probar; la superficie de un pico de flauta de un medio sólido se estría con el
microorganismo a probar. Ambos medios se incuban a 25°C durante 24 horas.

Interpretación
POSITIVA: color rojo rosado intenso en el medio
NEGATIVA: No cambia de color el caldo ( color canela ).

MEDIO MIO

En este medio se determinan las siguientes pruebas: movilidad, descarboxilación


de la ornitina e indol. Es un medio semisólido, se inocula con picadura con asa recta, se
incuba a 37oC durante 18 a 24 horas.
Las lecturas se deberán realizar en el siguiente orden:
a) MOVILIDAD: Aquí se determina si un microorganismo es móvil o no.
- Movilidad Positiva: Se observa turbiedad en el medio, debido a que los
microorganismos migran de la línea de siembra y difunden.
- Movilidad negativa: Se observa crecimiento nada más en la línea de siembra y
el medio circundante se mantiene claro.
b) DESCARBOXILACIÓN DE LA ORNITINA: Esta prueba nos indica la capacidad que
tiene un microorganismo de descarboxilar la ornitina para formar una amina
( putrecina ) con la consiguiente alcalinidad.
- Ornitina positiva: El color del medio se mantiene de color morado,
descarboxilación de la ornitina.
- Ornitina negativa: El color del medio será amarillo, no descarboxilación de la
ornitina.
c) PRUEBA DEL INDOL: El indol es uno de los productos de degradación del
metabolismo del aminoácido triptófano. Las bacterias que poseen la enzima
triptofanasa son capaces de clivar triptófano produciendo indol, ácido pirúvico y
amoníaco.
Para leer esta prueba agregar 5 gotas del reactivo de Kovac ( p –
dimetilaminobenzaldehído ) directamente a un tubo incubado, agitar suavemente el tubo
e interpretar el resultado.
- Indol positivo: Anillo rojo en la superficie del medio.
- Indol negativo: no cambia de color el reactivo de Kovac.
- Indol variable: Color anaranjado en la superficie del medio.

OXIDACIÓN – FERMENTACIÓN

Los microorganismos sacarolíticos liberan ácidos fermentativos u oxidativamente.


Los productos de la fermentación son ácidos mixtos relativamente fuertes que se pueden
detectar en un medio de fermentación convencional. En cambio los ácidos formados por
degradación oxidativa de la glucosa son sumamente débiles y para su detección se
requiere de un medio oxido fermentación como medio OF.

91
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

Se requiere de dos tubos para esta prueba inoculados por picadura por el organismo
desconocido. Cubrir el tubo con una capa de 1 cm de aceite mineral estéril, dejando el
otro tubo sin aceite.
Incubar los tubos a 37oC durante 48 horas o más.
La producción de ácido se detecta en el medio por la aparición de color amarillo y se
interpreta de la siguiente manera:

TUBOS SIN ACEITE TUBO CON ACEITE TIPO DE METABOLISMO

Ácida (amarillo) alcalina (verde) oxidativo


Ácida (amarillo) ácida (amarillo) fermentativo
Alcalina (verde) alcalina (verde) No sacarolítico

Se puede utilizar campana en el medio para la detección de gases.

92
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

OXIDASA

La prueba citocromo oxidasa utiliza ciertos reactivos colorantes como el


diclorohidrato de p – fenilendiamina, que actúa como aceptor artificial de electrones
sustituyendo al oxígeno, este reactivo es incoloro es estado reducido pero en presencia
de citocromo oxidasa y oxígeno atmosférico se oxida formando así indofenol.
La prueba se lleva a cabo añadiendo, unas gotas de reactivo a una tira de papel filtro, en
la zona del papel donde haya reactivo se extiende una asada de la colonia sospechosa.
Las colonias bacterianas con actividad citocromo oxidasa desarrollan en segundos un
intenso color azul en el sitio de la inoculación.

REDUCCIÓN DE NITRATOS

Los microorganismos que reducen los nitratos tienen la capacidad de extraer el


oxígeno de nitratos para formar nitritos y otros productos de reducción. La ecuación
química es:
NO3- + 2e- + 2H NO2 + H2 O

1. Inocular el medio para nitratos con una asada del microorganismo en estudio e
incubar a 35°C, durante 18 a 24 horas.
2. Finalizada la incubación, agregar 1 mL de -naftilamina y 1 mL de ácido sulfanílico, al
medio de prueba, en ese orden.

Interpretación
La aparición de un color rojo en los 30 segundos posteriores al agregado de los
reactivos indica la presencia de nitritos y representa una reacción positiva. SI no aparece
el color, puede indicar que los nitratos no han sido reducidos (una verdadera reacción
negativa) o que han sido reducidos a otros productos, como amoniaco, nitrógeno
molecular, óxido nítrico u óxido nitroso e hidroxilamina. Dado que los reactivos de prueba
detectan sólo nitritos, este último proceso llevaría a una lectura falso – negativa, por ende
es necesario agregar una pequeña cantidad de zinc a todas las reacciones negativas.
Los iones de zinc reducen los nitratos a nitritos y la aparición de color rojo después del
agregado del polvo de zinc indica la presencia de nitratos residuales y confirma una
reacción negativa verdadera.
Se puede utilizar campana en el medio para la detección de gases.

ROJO DE METILO

Nos sirve para comprobar la capacidad que tiene un microorganismo de producir y


mantener estables los productos terminales ácidos de la fermentación de la glucosa.
Prueba es útil para identificar especies bacterianas que son fuertemente productoras de
ácidos.

93
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

Agregar 5 gotas del indicador rojo de metilo a una alícuota de medio MR – VP


incubado 24 horas.

Interpretación
– Rojo de metilo positivo: El cultivo es lo suficientemente ácido como para
permitir que el indicador de rojo de metilo mantenga su color en la
superficie del medio (pH 4.4).
– Rojo de metilo negativo: Color amarillo en la superficie del medio (pH
6.0).
– Reacción retardada: Color anaranjado.

SENSIBILIDAD A BACITRACINA Y SXT


Principio
La susceptibilidad a bajas concentraciones del antibiótico polipeptídico bacitracina
(0.04 unidades) y a la combinación del trimetroprima-sulfametoxazol (SXT) proporciona
un método sencillo y económico para la identificación presuntiva de los estreptococos
betahemolíticos de los grupos A y B. Los estreptococos del grupo A son sensibles a
concentraciones relativamente bajas de bacitracina y resistentes a la SXT. Los
estreptococos del grupo B son resistentes a ambos antibióticos. Otros estreptococos -
hemolíticos muestran sensibilidad variable a la bacitracina pero estos microorganismos
son habitualmente sensibles a la SXT. Por lo tanto, la realización de SXT junto con la
prueba de bacitracina aumenta la sensibilidad y el valor pronóstico de la prueba de
bacitracina.
Procedimiento
1. Tomar tres o cuatro colonias aisladas de estreptococos betahemolíticos y estriar el
inóculo hasta el centro de la mitad de una placa de agar sangre.
2. Con un hisopo estéril o un asa diseminar el inóculo sobre toda la mitad de la placa.
3. Colocar en forma aséptica un disco de bacitracina “A” y un disco de SXT sobre el área
sembrada. Asegurarse de que los discos estén igualmente separados. Utilizando
pinzas flameadas, golpear con suavidad los discos para que se adhieran a la
superficie de agar.
4. Incubar la placa en aire ambiente a 37°C.
Interpretación
Sensible (S) Cualquier tamaño de halo alrededor de cualquiera de los discos
Resistente (R) Desarrollo hasta el borde del disco.

SENSIBILIDAD A LA NOVOBIOCINA
Principio
Los estafilococos coagulasa negativos pueden dividirse en especies sensibles y
resistentes a la novobiocina. Entre las especies resistentes a la novobiocina, S.
saprophyticus es el único que suele recuperarse en el hombre como causantes de
infecciones del tracto urinario. Por lo tanto el tamizaje de los estafilococos coagulasa
negativos aislados de cultivos cuantitativos de orina en lo que respecta a la

94
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

susceptibilidad a la novobiocina proporciona una identificación presuntiva confiable de


esta especie.
Procedimiento
1. Preparar una suspensión del microorganismo a identificar en agua destilada estéril o
en caldo. La suspensión debe tener una turbidez equivalente al estándar 0.5 del
nefelómetro de Mc Farland.
2. Con un hisopo distribuir parte de la suspensión sobre la mitad de la placa de agar
Mueller-Hinton.
3. Colocar en forma aséptica un disco de novobiocina (5 g) sobre el área sembrada.
Presionarse con suavidad el disco con pinzas estériles para asegurar el contacto con
la superficie del agar.
4. Incubar la placa en aerobiosis a 35oC de 18 a 24 horas.
5. Medir los diámetros de las zonas de inhibición con el vernier.
Interpretación
RESISTENTES: presentarán halos de inhibición entre 6 mm y 12 mm
SENSIBLES: Presentarán halos de inhibición de 16 mm o mayores.

SENSIBILIDAD A LA OPTOQUINA
El clorhidrato de etilhidroxicupreína (Optoquina), un derivado de la quinina, inhibe
selectivamente el crecimiento de S. pneumoniae a concentraciones muy bajas (5g/ml o
menos). Asimismo, la optoquina puede inhibir asimismo otros estreptococos del grupo
viridans, pero sólo a concentraciones mucho más altas. La prueba tiene una sensibilidad
de más del 95%, es barata y sencilla de realizar.
La optoquina es soluble en agua y difunde con rapidez en el medio de agar. Por lo tanto,
los discos de papel de filtro impregnados con optoquina pueden colocarse directamente
sobre la superficie del agar al realizar esta prueba. Las células de S. pneumoniae
alrededor del disco son lisadas debido a cambios en la tensión superficial y se produce
una zona de inhibición del crecimiento.
1. Mediante el empleo de un asa de inoculación seleccionar tres o cuatro colonias
bien aisladas del microorganismo de prueba y estriar en una mitad a un tercio de
la placa de agar sangre de carnero al 5%.
2. Colocar el disco de optoquina en el tercio superior del área sembrada. Presionar
suavemente el disco, para que se adhiera a la superficie del agar.
3. Incubar a 35oC durante 18 a 24 horas con vela o en incubadora de CO2.

Interpretación
Un estreptococo del grupo viridans puede identificarse en forma presuntiva como
S. pneumoniae si muestra una zona de inhibición de 14 mm o más alrededor de un disco
de optoquina de 6 mm o una zona de 16 mm o más si se utiliza un disco de 10 mm. Los
estreptococos que muestran zonas de diámetro menor deben ser sometidos a la prueba
de solubilidad en bilis.

95
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

SOLUBILIDAD EN BILIS
Las sales biliares, específicamente el desoxicolato de sodio y el taurocolato de
sodio, poseen la propiedad de lisar selectivamente a Streptococcus pneumoniae cuando
se agregan las bacterias en fase de crecimiento activo en medios agar o caldo. S.
pneumoniae produce enzimas autolíticas (autolisinas) que son las responsables de la
depresión o umbilicación característica de las colonias viejas de neumococos en medios
de agar. El agregado de sales biliares activa las autolisinas y aceleran la reacción lítica
natural observadas en los cultivos del pneumococo.
La prueba de solubilidad en bilis se puede realizar con un cultivo líquido del
microorganismo o con colonias que se desarrollan en medio agar. Si el microorganismo es
soluble, la turbidez del cultivo en caldo líquido se aclara visiblemente cuando se agregan
sales biliares. En medios de agar las colonias solubles en bilis desaparecen cuando se
coloca una gota del reactivo sobre ellas. Debido a que el desoxicolato de sodio puede
precipitar a pH de 6.5 o menor, el caldo utilizado debe ajustarse a pH de 7.0 para evitar
las reacciones negativas falsas.
Prueba en caldo
1. Transferir aproximadamente 0.5 mL de un caldo de cultivo de 18 a 24 horas a dos
tubos de ensayo limpios, Alternativamente puede prepararse una suspensión del
microorganismo en solución fisiológica tamponada con fosfato a pH de 7.0, a partir del
desarrollo en medio de agar.
2. agregar una gota de indicador rojo de fenol a cada tubo.
3. Agregar NaOH 0.10 N para corregir el pH a 7.0 (el indicador vira a un color rosa
pálido).
4. Agregar 0.5 mL de desoxicolato de sodio al 10% a uno de los tubos (marcado prueba).
5. Agregar 0.5 mL de solución fisiológica estéril al otro tubo (marcado control).
6. Agitar suavemente ambos tubos y colocarlos en estufa o baño maría a 35°C durante
tres horas, observando cada hora.
Prueba en placa
1. Colocar una gota de desoxicolato de sodio al 2% sobre una pocas colonias bien
aisladas del microorganismo a probar desarrollado sobre el agar sangre de
carnero.
2. Sin invertir la placa, colocar en una estufa a 35°C durante 30 minutos.

Interpretación
Prueba en caldo
Reacción positiva (solubles en bilis): Hay un aclaramiento visible de la suspensión del
tubo que contiene desoxicolato de sodio sin cambio enla suspensión control.
Reacción negativa (Insoluble en bilis): No hay cambios en la turbidez de la suspensión del
tubo que contiene desoxicolato de sodio, en comparación con la suspensión control.
Prueba en placa
Reacción positiva (solubles en bilis): Las colonias sobre las cuales se ha colocado el
reactivo desaparecen y dejan una zona parcialmente hemolisada en el lugar donde
estaban.

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

Reacción negativa (Insoluble en bilis): Las colonias sobre las cuales se ha colocado el
reactivo permanecen intactas y visibles.

TOLERANCIA A LA SAL

La capacidad de desarrollarse en presencia de cantidades variables de cloruro de


sodio (NaCl) es una propiedad que ha sido utilizada para caracterizar varias bacterias,
incluidos los estreptococos del grupo viridans. Sin embargo es de particular utilidad para
la identificación presuntiva de del grupo de los microorganismos pertenecientes a los
estreptococos del grupo D, que poseen la capacidad específica de desarrollarse en
presencia de NaCl al 6.5% incorporados a medios líquidos o sólidos. Esta prueba junto
con la de agar bilis esculina se utiliza en pruebas de laboratorio para distinguir especies
de Enterococcus de los estreptococcus del grupo D, S. bovis y S. equinus.
El caldo infusión de corazón es un medio nutritivo de uso general que se utiliza para el
cultivo de muchas bacterias. Normalmente contiene 0.5% de NaCl. Si se aumenta la
concentración del NaCl al 6.5% el medio se hace semiselectivo para el desarrollo de
enterococos.
1. Inocular dos o tres colonias en el caldo BHI más NaCl al 6.5%.
2. Incubar toda la noche a 35°C en estufa con aire ambiente.

Interpretación
Una prueba positiva se manifiesta por la presencia de desarrollo bacteriano evidente en el
medio. Si el microorganismo es bilis esculina positivo y se desarrolla en caldo con 6.5%
de NaCl, pertenece a una especie de Enterococcus. Si es bilis esculina positivo, pero no
se desarrolla en caldo con 6.5% de NaCl, es un estreptococo del grupo D.

VOGES PROSKAUER
Nos permite determinar la capacidad de algunos microorganismos de producir un
producto final neutro, el acetil-metil-carbinol (acetoína), a partir de la fermentación de
glucosa.
1. Sembrar un tubo de caldo MR/VP con un cultivo puro de microorganismos a probar
e incubar 24 horas a 35°C.
2. Finalizada la incubación, adicionar 12 gotas de -naftol al 5% y 6 gotas de KOH al
40%, en ese orden.
3. Agitar suavemente el tubo, para exponer el medio al oxígeno atmosférico y dejar el
tubo en reposo durante 10 a 15 minutos.

Interpretación
POSITIVA: Color rojo rosado en la superficie del medio.
NEGATIVA: Color amarillo (mismo color del medio).

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

UTILIZACIÓN DE CITRATO:
Sirve para determinar la capacidad de un organismo de utilizar citrato de sodio como
única fuente de carbono para su metabolismo y desarrollo.
Se siembra por estría el microorganismo en estudio en el pico de flauta del agar citrato de
Simmons. Incubar 24 horas a 35oC.

Interpretación
- Prueba positiva: Producción de un color azul en el medio.
- Prueba negativa : El medio permanece de color verde ( no hay crecimiento del
microorganismo )

REFERENCIAS BIBLIOGRAFÍCAS

1. Forbes BA, Sahm DF, Weissfeld AS. Bailey & Scott Diagnóstico microbiológico. 12ª
edición. Editorial Médica Panamericana. Argentina 2009.

2. MacFaddin JF. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia


clínica. 3ª. Edición. Editorial Médica Panamericana. Argentina 2004.

3. Romero Cabello. Microbiología y parasitología Humana. 3ª edición. Editorial Médica


panamericana. México 2007.

4. Tortora GJ, FunkeBR, Case CL. Introducción a la Microbiología. 9ª edición. Editorial


médica Panamericana. Argentina 2007.

5. Tay Zavala J, Microbiología y Parasitología Médicas. 3ª edición. Méndez Editores,


México 2003.

6. Winn WC, Allen SD, Janda WM, Koneman EW, Procop CW, Schreckenberger PC,
Woods GL. Koneman Diagnóstico Microbiológico: Texto y atlas en color. 6ª. Edición.
Editorial Médica Panamericana. Argentina 2008.

7. Zárate-Aquino ML, Escobar-Gutierrez A, Giono-cerezo S. Manual de técnicas de


laboratorio. 1995. INDRE. México.

98
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

PRÁCTICA No. 11
AISLAMIENTO DE BACTERIAS A PARTIR DE PRODUCTOS BIOLÓGICOS
(TOMA DE EXUDADO FARINGEO)
HABILIDADES
El estudiante, conoce algunas técnicas y medios de cultivo para el aislamiento y
cultivo de microorganismos a partir de productos biológicos (toma de exudado faríngeo).
.
INTRODUCCIÓN
Los seres vivos se encuentran conviviendo en relaciones ecológicas que van
desde el parasitismos hasta la simbiosis obligadas. En particular los microorganismos se
pueden encontrar viviendo en los tegumentos, mucosas, cavidades y hasta dentro de
algunos tejidos de plantas, animales y del hombre. Constituyendo lo que se llama
microbiota normal. Las funciones de estas microbiota son variadas, siendo frecuente
que la salud, la resistencia a infecciones, o funcionamiento de organelos vitales del
organismo que la alberga dependan de la integridad de estos microorganismos asociados.
El estudio de la microbiota humana permite detectar individuos portadores de
microorganismos potencialmente patógenos para otros individuos.
En el hombre se pueden encontrar microorganismos de la microbiota normal,
como bacterias, hongos y protozoarios en cavidades como la nasal, bucal, vaginal y
otica, en la piel, en el tracto digestivo y respiratorio. En algunos casos, la cantidad de
microorganismo es muy abundante como en piel, cavidad bucal, oral y vaginal. En
individuos sanos
En individuos sanos no hay microorganismos en la sangre, líquido cefalorraquídeo,
orina y órganos internos y generalmente la presencia transitoria de éstos en esas
localización indica el desarrollo de un proceso infeccioso.
En el aislamiento de microorganismos a partir de productos biológicos se usan
varios medios de cultivos. La selección de estos depende de la cantidad y variedad de
microorganismos en la muestra original, del tipo de microorganismos que se prefiere aislar
y los y los que se quieren eliminar para que su abundancia no encubra o dificulte nuestras
preferencias. Para este propósito se usan una diversidad de medios de cultivos sólidos
entre los que se encuentran medios ricos con una abundancia en la cantidad, variedad y
calidad de los nutrientes.
La toma de las muestras a partir de fluidos y órganos puede ser una actividad muy
fácil, como la de exudado faríngeo (ver figura), la nasal y ótico, raspados dentales y bucal,
pero puede requerir también de instrumental médico y personal especializado para su
obtención como las tomas de líquidos cefalorraquídeo y amniótico, la punción de médula
ósea y el exudado nasofaríngeo –

Equipo y material:
- Mecheros
- Gradillas
- Incubadora a 37º C
- Microscopio
- Abatelenguas estériles (2)
Medios de cultivo:
- Placas de agar sangre.
- Agar Biggy
- Agar Sal y manitol
Pruebas bioquímicas:
- Reactivos:

99
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

- Colorantes para tinción de Gram,


Producto biológico: Muestra de exudado faríngeo

MATERIAL TRAIDO POR EQUIPO:


- Cuatro Hisopos estériles
- Asa y portasa - Alcohol
- Portaobjetos - Cuadros de algodón
- Lápiz con punta de diamante - Pinzas de disección
- Maskintape - Esponjas
- Marcador - Cerillos o encendedor
- Una regla con escala milimétrica
- Una lupa de mano

TOMA DE MUESTRA PARA EXUDADO FARINGEO

1. Preparar el material estéril a utilizar y placas con medio de cultivo sin humedad.
2. Sentado el paciente en posición cómoda, llevar la cabeza ligeramente hacia atrás y
con un abatelenguas estéril presionar la lengua e introducir un hisopo estéril hasta las
amígdalas y se frota contra la parte posterior de la mucosa de un lado a otro o contra
cualquier mancha blanca o ulceración. No tocar la lengua, úvula o la zona periodontal.
3. Inmediatamente depositar la muestra del hisopo en Agar Sangre y Agar Mac Conkey
4. Con el asa aislar por estría cruzada los medios de cultivos antes mencionados,
5. Incubar 24-48 horas a 37°C.
6. Describir la morfología colonial y cambios observados en cada uno de los medios
utilizados.
7. Hacer un frotis de cada microorganismo, teñir con Gram y observar al microscopio
8. Observar en agar sangre la producción hemolítica

NOTA: Se puede utilizar el medio de transporte de Stuart para muestras tomadas en


periodo de 2 a 24 horas.

SITIOS DE TOMA DE EXUDADO FARIGEO

100
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

101
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

102
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

FORMA DE REPORTAR:
INFORME
 Describa en la tabla siguiente, la morfología colonial y microscopia de
una colonia bacteriana aislada de cada medio de cultivo.
COLONIA 1 COLONIA 2 COLONIA 1 COLONIA 2 COLONIA 1 COLONIA 2
CARACTERISTICAS
(Muestra en (Muestra en (Muestra en (Muestra en (Muestra en (Muestra en
agar sangre) agar sangre) Agar Biggy) agar Biggy) agar sal y agar sal y
manitol) manitol)
Microorganismo
Medio de cultivo
Tamaño (mm)
Forma
Elevación
Marge o borde
Color
Superficie
Aspecto
Luz reflejada
Luz transmitida
Consistencia
MORFOLOGIA MICROSCOPICA
Tinción de Gram
Morfología
Agrupación
En agar sangre ver
el tipo de
HEMÓLISIS

 ¿Tiene alguna importancia para su carrera o desarrollo


profesional estas técnicas? Explique.
 ¿Qué características en común tienen los medios de cultivo
utilizados en la toma de exudado faríngeo?

LITERATURA CITADA
- Díaz; R. G. y Toñi, L.I. Manual Práctico de Microbiología (2009) Ed. Masón, Barcelona.
- Koneman, W. E. Aller, S.D. Jinda, W.M. Schreckenberger. P.C. (2008). Diagnóstico
Microbiológico; 5ª. ed; Ed. Panamericana; España.
- Pelczar, M.J.Jr., R.D. Reid y E.C.S. Chan., Microbiología, (2004) 4a. de. MacGraw-Hill-Book,
Company, Nueva York.
- Prescott, L.M., J.P. Harley y D.A. Klein. (2000) Microbiología. McGraw-Hill Interamericana.
Madrid. .
- Manual de Prácticas de microbiología. (2017) ENCB del IPN. México, DF.

103
BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

PRÁCTICA No. 12
AISLAMIENTO DE BACTERIAS A PARTIR DE PRODUCTOS BIOLÓGICOS
(TOMA DE EXUDADO OTICO)
HABILIDADES
- El estudiante, conoce algunas técnicas y medios de cultivo para el aislamiento y
cultivo de microorganismos a partir de productos biológicos (toma de exudado otico).
- Describe las condiciones adecuadas para la toma de muestra en los sitios anatómicos
relacionado con el exudado otico.
- Analiza macroscópicamente y microscópicamente la muestra en estudio.
- Valora el crecimiento obtenido en los distintos medios de cultivo.
.
INTRODUCCIÓN
Los seres vivos se encuentran conviviendo en relaciones ecológicas que van
desde el parasitismos hasta la simbiosis obligadas. En particular los microorganismos se
pueden encontrar viviendo en los tegumentos, mucosas, cavidades y hasta dentro de
algunos tejidos de plantas, animales y del hombre. Constituyendo lo que se llama
microbiota normal. Las funciones de estas microbiota son variadas, siendo frecuente
que la salud, la resistencia a infecciones, o funcionamiento de organelos vitales del
organismo que la alberga dependan de la integridad de estos microorganismos asociados.
El estudio de la microbiota humana permite detectar individuos portadores de
En el aislamiento de microorganismos a partir de productos biológicos se usan
varios medios de cultivos. La selección de estos depende de la cantidad y variedad de
microorganismos en la muestra original, del tipo de microorganismos que se prefiere aislar
y los y los que se quieren eliminar para que su abundancia no encubra o dificulte nuestras
preferencias. Para este propósito se usan una diversidad de medios de cultivos sólidos
entre los que se encuentran medios ricos con una abundancia en la cantidad, variedad y
calidad de los nutrientes.
La toma de las muestras a partir de fluidos y órganos puede ser una actividad muy
fácil, como la de exudado faríngeo (ver figura), la nasal y ótico, raspados dentales y
bucal, pero puede requerir también de instrumental médico y personal especializado para
su obtención como las tomas de líquidos cefalorraquídeo y amniótico, la punción de
médula ósea y el exudado nasofaríngeo. Flora habitual del oído externo La
microbiota general del oído externo es similar a la de la piel, predominando
Staphylococcus (coagulasa-negativo) y miembros del género Corynebacterium.
Con menos frecuencia se observan especies de Bacillus, Micrococcus y
Neisseria. En esta localización se han aislado también otros microorganismos
que colonizan la piel en forma transitoria como Streptococcus pneumoniae, P.
aeruginosa y especies de la familia Enterobacteriaceae, entre ellos, los géneros
Proteus, Escherichia, Enterobacter y Klebsiella. Estudios micológicos
demuestran que los siguientes géneros de hongos pertenecen a la microbiota
normal: Aspergillus, Alternaria, Penicillium, Candida y Saccharomyces. Agentes
causales comunes
Equipo y material:
- Tubo de 13x100 con solución salina fisiológica estéril (SSF) 0.85% con 2ml.
- Mecheros
- Gradillas
- Incubadora a 37º C
- Microscopio
Medios de cultivo:
- Placas de agar sangre.
- Agar Biggy

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

- Agar Sal y manitol


- Agar MacConkey
- Reactivos:
- Colorantes para tinción de Gram,
Producto biológico: Muestra de exudado otico

MATERIAL TRAIDO POR EQUIPO:


- Hisopos delgados (2)
- Asa y portasa - Alcohol
- Portaobjetos - Cuadros de algodón
- Lápiz con punta de diamante - Pinzas de disección
- Maskintape - Esponjas
- Marcador - Cerillos o encendedor
- Una regla con escala milimétrica
- Una lupa de mano

TOMA DE MUESTRA PARA EXUDADO OTICO

Procedimiento
Toma de muestra del conducto auditivo externo:
1. Preparar el material estéril a utilizar y placas con medio de cultivo sin humedad.
2. El paciente debe estar sentado en posición cómoda con la cabeza hacia un lado. Es
necesario contar con una buena iluminación para observar el canal auditivo.
3. Introducir con cuidado un hisopo delgado estéril impregnado con solución salina
fisiológica estéril (SSF) y tomar la muestra del conducto auditivo externo del oído.
4. Al Introducir el hisopo, este debe de rotarse lentamente. Sacar lentamente el hisopo.
5. Hacer un examen directo (frotis) y colorearlo con la tinción de Gram y enseguida
inocular los medios de cultivos. (agar Biggy, sal y manitol, Mac Conkey y agar sangre).
Descartar los hisopos una vez utilizados.
6. Dispersar el inoculo en cada medio de cultivo y posteriormente con el asa aislar
mediante estría cruzada.
7. Incubar a 37º C durante 24-48 horas. El agar sangre se incuba en tención de CO2.
8. Describir la morfología colonial y cambios observados en cada uno de los medios
utilizados.
Observar al microscopio los frotis teñidos
9. Observar en agar sangre la producción hemolítica

SITIOS DE TOMA DE EXUDADO OTICO

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA I

FORMA DE REPORTAR:
INFORME
i. Describa en la tabla siguiente, la morfología colonial y microscopia de
una colonia bacteriana aislada de cada medio de cultivo.
COLONIA COLONIA COLONIA COLONIA COLONIA COLONIA
COLONIA COLONIA
1 2 1 2 1 2
1 2
CARACTERISTICAS (Muestra en (Muestra (Muestra (Muestra (Muestra (Muestra
(Muestra (Muestra
Agar en en agar sal en agar sal en agar en agar
en agar en agar
Biggy) Agar y manitol) y manitol) Mac Mac
sangre) sangre)
Biggy) Conkey) Conkey)
Microorganismo
Medio de cultivo
Tamaño (mm)
Forma
Elevación
Marge o borde
Color
Superficie
Aspecto
Luz reflejada
Luz transmitida
Consistencia
MORFOLOGIA MICROSCOPICA
Tinción de Gram
Morfología
Agrupación
En agar sangre
ver el tipo de
HEMÓLISIS

LITERATURA CITADA
- Díaz; R. G. y Toñi, L.I. Manual Práctico de Microbiología (2009) Ed. Masón, Barcelona.
- Koneman, W. E. Aller, S.D. Jinda, W.M. Schreckenberger. P.C. (2008). Diagnóstico
Microbiológico; 5ª. ed; Ed. Panamericana; España.
- Pelczar, M.J.Jr., R.D. Reid y E.C.S. Chan., Microbiología, (2004) 4a. de. MacGraw-Hill-Book,
Company, Nueva York.
- Prescott, L.M., J.P. Harley y D.A. Klein. (2000) Microbiología. McGraw-Hill Interamericana.
Madrid. .
- Manual de Prácticas de microbiología. (2017) ENCB del IPN. México, DF.

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