Вы находитесь на странице: 1из 23

UNIVERSIDAD JOSE CARLOS MARIATEGUI

FACULTAD DE INGENIERIA Y ARQUITECTURA


ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AMBIENTAL

TECNICAS DE ADN RECOMBINANTE


DOCENTE:
Blga. ISABEL ESPINOZA
ALUMNA:
MARLY ARECA PERALTA
CURSO:
BIOTECNOLOGIA
CICLO:
VII

ILO-PERU
2019
TÉCNICAS DE ADN RECOMBINANTE: LA MANIPULACIÓN
GENÉTICA

A partir de los años 70 se desarrollaron las herramientas de la biología molecular o la


ingeniería genética o lo que se ha llamado técnicas del ADN recombinante. Y esto
ocurrió, en comparación con lo que fue el resto de la historia de la ciencia, de forma
muy rápida entre los años 70 y 80.

En estas primeras etapas se estaba trabajando sobre la posibilidad de manipular los


genes, es decir:

A) tenerlos aislados,

B) amplificarlos, en el sentido de tener muchas copias de la misma secuencia.

C) conocer la secuencia exacta, es decir el orden de las bases de esos genes.

D) una vez aislado poderlo expresar fuera de su localización natural, lo cual tendrá
una enormidad de otras aplicaciones.

Toda esta manipulación genética está simplemente basada en unas pocas


propiedades del ADN

que han permitido avanzar muchísimo en las técnicas.

1) ENZIMAS DE RESTRICCION

Uno de los avances más importante en los inicios de la biología molecular, fue el
descubrimiento de las endonucleasas de restricción, es decir de enzimas que pueden
cortar el ADN y que tienen la ventaja de que lo cortan en sitios concretos. Fueron
descubiertas en bacterias, y son enzimas que estas bacterias usan para destruir ADN
que ingresa a ellas, por ejemplo, ADN de virus bacteriófagos. Con las enzimas, la
bacteria puede degradar este ADN foráneo sin degradar su propio ADN. Varias de
ellas fueron identificadas en la década del 70 y siguieron descubriéndose otras
posteriormente, aisladas de diferentes cepas bacterianas. La ventaja de estas enzimas
es que reconocen un sitio para cortar, pueden ser un diseño de 4, 6, 8 bases, pero
tienen que estar organizadas con una secuencia exacta y no otra. Por ejemplo, la
enzima que se llama EcoR1 (porque se aisló de la bacteria Escherichia Coli, que reside
normalmente en el intestino), solo corta si encuentra la secuencia GAATTC. Si hay una
base que está cambiada ya no corta.

Estas enzimas de restricción, entonces permiten cortar el ADN en sitios específicos.


Algunas de ellas cortan dejando extremos cohesivos que se pueden pegar nada más
que por complementariedad de bases. Esto quiere decir que un extremo que generó
una enzima y otro que generó la misma enzima, aunque provengan de moléculas de
ADN diferentes, se pueden unir y generar lo que se llamó inicialmente un ADN
recombinante. Este hito de los años 70 de poder recombinar, es decir hacer
construcciones genéticas, hacer ingeniería en genética fue la base de una enormidad
de otros avances. En 1972 justamente se genera el primer ADN recombinante
combinando el ADN de un plásmido, con un tramo de ADN de anfibio.

2) LOS VECTORES

Con el paso del tiempo surgió la necesidad de que los vectores albergaran pedazos
más grandes. El tamaño medio del inserto de un plásmido es de 10000 bases. El
objetivo de clonar genes eucariotas completos o de secuenciar un genoma exige poder
incluir trazas de mayor tamaño. De esta manera, uno de los grandes polos de
desarrollo que surgieron fue loa obtención de mejores vectores, vectores que
albergaran pedazos grandes en lo posible genes enteros. El primer paso fue pasar a
utilizar como vectores los propios bacteriófagos (virus que infectan bacterias); y
después se desarrollaron otros, que fueron construcciones, combinaciones, de trozos
de plásmido, de bacteriófago, de cromosoma de levadura, etc. Siempre buscando
vectores que llevaran mayores insertos y que fueran eficientes. Así surgen muchos,
como por ejemplo los BACs (bacterial artificial chromosome) en los que están
contenidos actualmente los trozos de ADN del genoma humano. Así se pudo por
ejemplo clonar un gen que tiene alrededor de un millón de pares de bases que es el
gen de la distrofia muscular, el gen se pudo tener entero para poderlo estudiar y
eventualmente expresar.

De esta forma se puede también tener todo el genoma cortado en pedazos y clonado
(cada pedazo inserto en un vector) para posteriormente estudiarlo. Esto es justamente
una genoteca: el clonado de un juego completo del genoma de una especie, genoteca
o biblioteca genómica. Este tipo de trabajo obviamente, no se realiza solamente con la
especie humana, y el genoma de otras especies ha sido muy estudiado, y en algunos
casos el Proyecto de descripción de su genoma está muy avanzado o terminado.

1. Para hacer una genoteca debemos extraer ADN de algún tejido del individuo.
2. Luego, hacer uso de las enzimas de restricción que cortan en sitios concretos;
esos sitios un poco al azar aparecen a lo largo de todo el genoma y entonces van
a cortar el ADN en trozos, y se puede lograr que todos sean incluidos en vectores.
Estos vectores pueden volver a su huésped (por ejemplo, la bacteria) y así
conservarse la genoteca en una heladera, en un freezer.
3. La reacción en cadena de la polimerasa. También en los años 80 apareció otra
técnica evolucionaria que permite tener mucha cantidad de un fragmento de ADN
de interés: es la técnica de PCR, o “reacción en cadena de la polimerasa”.

Es una técnica muy rápida, que por otra parte puede funcionar partiendo de trazas de
ADN. Por ello en se utiliza mucho en el área forense y de identificación humana, así
como en genética de poblaciones, en casos en los que se tiene muy poquito ADN, esta
técnica aprovecha las características de la replicación del ADN, es decir que a partir
de un pequeño cebador la polimerasa puede proseguir una cadena. El requisito como
se ve en la figura es poder diseñar dos cebadores adecuados. Por la posición de estos
cebadores, al cabo de una serie de rondas de replicación, (hablamos de una reacción
en cadena), tenemos grandes cantidades de un solo trozo, el tramo que va desde uno
de los cebadores al otro. Esta técnica, en la que el ADN tiene que ser desnaturalizado
por calor para iniciar cada nuevo ciclo tornó muy fácil cuando hizo uso de una
polimerasa. Que resiste el calor (aislada de una bacteria de aguas termales). Esta
técnica se utiliza ya rutinariamente para muchos diagnósticos.

3) ADN LIGASA

Es la unión de los fragmentos de Okazaki (son las cadenas complementarias


originadas a partir de las cadenas molde) con las cadenas complementarias necesita
una enzima que la catalice. Esta enzima es la ADN ligasa. Su función es catalizar un
enlace fosfodiéster entre el grupo 3'-hidroxilo extremo de una de las cadenas de ADN
y el grupo 5'-difosfato del extremo de la otra cadena de ADN. Para llevar a cabo esta
reacción, la célula necesita energía porque se trata de una reacción
termodinámicamente desfavorable, es decir, no es una reacción que sucede de
manera espontánea. Por un lado, en las células eucariotas y en las arqueas, la fuente
de energía es el ATP (Adenosin Trifosfato). La molécula de ATP se separa en AMP
(Adenosin Monofosfato) y pirofosfato para facilitar la dirección.

Por otro lado, las bacterias obtienen la energía del NAD+ (nicotinamida adenina
dinucleótido) el cual se divide en AMP y NMN (mononucleótido de nicotinamida) con
la misma finalidad que lo hace el ATP de eucariotas y arqueas. El ADN ligasa no puede
unir dos moléculas de ADN de cadena sencilla (ADN con una sola cadena) ni formar
un ADN circular de cadena sencilla, sino que su función es sellar las roturas que han
tenido lugar en las moléculas de ADN de doble cadena (ADN con dos cadenas
enrolladas en forma de doble hélice) en el momento de la separación de la doble hélice.
La bacteria escherichia coli es capaz de formar un enlace fosfodiéster si hay al menos
algunas bases nitrogenadas de ADN de cadena sencilla con el extremo de un
fragmento de ADN de doble cadena y formar pares de bases.

La ligasa codificada por el bacteriófago T4 puede unir dos fragmentos de doble hélice
de extremos romos, esta capacidad se explota en la tecnología de ADN recombinante.
La manera más sencilla del ADN es aquella que tiene su extremo romo. Este tipo de
moléculas terminan con un par de bases. Las moléculas con extremos romos tienen
dos desventajas; la primera es que las cadenas con extremos romos tienen menos
rendimiento y la segunda es que tiene más posibilidades de insertar el fragmento de
ADN deseado en la dirección opuesta a la que se quiere. por otro lado, dos extremos
romos siempre serán compatibles entre sí.

a) Mecanismo de actuación de la ADN ligasa

Para formar los dos enlaces fosfodiéster covalentes entre ambos extremos de
las dos cadenas, la ADN ligasa cataliza una reacción junto con el ATP que sigue
3 pasos:

1-Adenización de un residuo en el centro activo de la enzima liberando fosfato.

2- Transferencia del AMP hacia el fosfato 5 'del donante originando la formación


de un enlace pirofosfato.

3-Formación de un enlace fosfodiéster entre el fosfato 5 'del donante y el


hidroxilo 3' del aceptor.

La enzima reacciona con ATP o


NAD+ para formar una molécula
de AMP ligada por un grupo
fosfoamido con el grupo amino del
sitio activo de la lisina.B. El fosfato
50 del ADN ataca el grupo fosforilo
del AMP para formar ADN
adenilado.C. La ADN ligasa
cataliza la reacción entre el grupo
OH del ADN y el fosfato 50
activado para formar un enlace
fosfodiéster así liberando AMP.
Cuando la ligasa trabaja sobre extremos romos requiere mayor concentración de
enzimas y diferentes condiciones de reacción.

b) Tipos de ADN ligasas

Existen dos ramas principales de ADN ligasas: las ADN ligasas ATP-
dependientes y las NAD+-dependientes. El cofactor ATP es principal en las
células de mamíferos mientras que las bacterias utilizan principalmente el NAD+
como cofactor de la enzima, aunque se encuentran bacterias con la capacidad
de formar enzimas que necesitan de ATP como cofactor para funcionar. No
obstante ambas enzimas siguen el mismo mecanismo reactivo.

 ADN Ligasa (ATP)

Enzima celular dependiente de ATP que cataliza la replicación, reparación y


recombinación del ADN mediante la formación de enlaces de éster
internucleotídicos entre los restos de fosfato y desoxirribosa. Las células
vertebradas codifican tres ADN ligasas bien caracterizadas, ADN ligasa I, III y
IV, todas ellas relacionadas en estructura y secuencia. Las ADN ligasas
requieren ATP o NAD. Sin embargo, las ADN ligasas arqueobacterianas, las
virales y las de algunas eubacterias son dependientes de ATP

4) PLASMIDOS APLICADO EN LA CONSERVACION DEL MEDIO AMBIENTE

Son moléculas de DNA circulares extracromosomales que se encuentran en la


mayoría de las bacterias y en algunas células de eucariontes.

Características de los plásmidos.

 Un plásmido típico es una molécula de DNA bicatenario y circular.


 El tamaño de los plásmidos que existen en la naturaleza varía de 1 a más de
1000 kilopares de bases.
 Muchos plásmidos usan la misma maquinaria de replicación del DNA
cromosomal y contienen un origen de replicación que es reconocido.
 Los plásmidos autorregulan su número de copias a través de un represor
(proteína o RNA) que impide que se repliquen muchas copias del plásmido.
 Estos represores también pueden actuar sobre otros plásmidos relacionados,
excluyéndolos así de la célula.
 En general, los plásmidos se clasifican en aquellos que se encuentran en un
bajo número de copias por célula (1‐10) y los que están presentes en un alto
número de copias (10‐100).
 Los plásmidos se pueden clasificar según las propiedades que le confieren a
las células
a) Plásmidos de resistencia.

• Antibióticos (aminoglicósidos, cloramfenicol, β‐lactamas)

• Metáles pesados (Hg, Ni, Co, Pb, Cd, Bi)

• Aniones tóxicos (arsenato, arsenito, boratos, cromatos.

En general éstos plásmidos contienen genes que codifican proteínas que


inactivan al compuesto tóxico para célula o afectan su transporte hacia el interior
de la célula. Por ejemplo producción de β‐lactamasa, enzimas modificadoras de
aminoglicósidos, cloramfenicol acetil transferasa.

b) Propiedades metabólicas.

• Producción de bacteriocinas

• Metabolismo de carbohidratos

• Metabolismo de compuestos carbonados

• Fijación de nitrógeno.

c) Factores que intervienen en la interacción con hospedero.

• Enterotoxina y hemolisinas (Escherichia coli)

• δ‐ endotoxina (Bacillus thuringiensis)

• Neurotoxina (Clostridium tetani)

• Infección y nodulación de leguminosas (Bradirhizobium sp.)


La ingeniería genética ha hecho posible la construcción en el laboratorio de un
número ilimitado de nuevos plásmidos artificiales o plásmidos de diseño. Lo cual
ha permitido la tranferencia de material genetico venciendo practicamente la
barrera entre especies.

El plásmido Ti contiene toda la información necesaria para infectar a las células


de su hospedero.

Genes virales: Codifican proteínas esenciales para el mecanismo de transferencia del


T‐DNA. El T‐DNA es portador de los genes para la formación del tumor (onc) y para la
síntesis de diferentes aminoácidos modificados llamados opinas (ops).Los genes onc
codifican enzimas que intervienen en la producción de hormonas vegetales.
La región de T‐DNA del Plásmido Ti se transfiere a la célula de la planta
transformándola.

La expresión de los genes vires inducida por moléculas señal de la planta sintetizada
por los tejidos de la planta heridos. Los genes vir son los responsables de la
transferencia del T‐DNA.

Establecimiento de la interacción simbiótica Rhizobium-leguminosas .

El género Rhizobium depende de plásmidos para establecer una interacción


simbiótica con diversas leguminosas.
Genes que dirigen las etapas específicas de la nodulación.

 Genes de especificifidad, lo que restringe una cepa de Rhizobium a una


determinada planta hospedera.
 Genes reguladores, el producto del gen nodD controla la transcripción de los
demás genes.
 Genes nif, sus productos participan en el proceso de fijación de nitrógeno.

Condiciones establecidas en la simbiosis Rhizobium-leguminosas

La nitrogenasa de Rhizobium es inhibida por el oxígeno, por lo tanto sólo se puede fijar
nitrógeno en condiciones microaerofílicas dentro de los nódulos.

Las concentraciones de oxígeno son controladas por la leghemoglobina , su formación


es inducida por la interacción de ambos organismos.

5) MARCADOR GENETICO

Un marcador genético es un segmento de ADN con una ubicación física conocida


en un cromosoma. Los marcadores genéticos pueden ayudar a vincular una
enfermedad hereditaria con el gen responsable. Los segmentos de ADN que se
encuentran cerca en un cromosoma tienden a heredarse juntos. Los marcadores
genéticos se utilizan para rastrear la herencia de un gen cercano que aún no ha sido
identificado, pero cuya localización aproximada es conocida. El marcador genético en
sí puede ser parte de un gen o puede no tener ninguna función conocida.

a) Tipos de marcadores genéticos

Los marcadores genéticos se suelen dividir en dos grupos, los marcadores


bioquímicos, detectados como variaciones en la secuencia de aminoácidos para la
que codifica el marcador, y marcadores moleculares basados en el ADN, detectados
a nivel de la secuencia de nucleótidos del marcador con o sin cambios observables
en el fenotipo. Los llamados marcadores morfológicos, identificados mediante
rasgos en el fenotipo (color, tamaño, etc), son hoy en día mucho menos utilizados.

 Marcadores bioquímicos

Los marcadores bioquímicos se basan en la observación del polimorfismo en


la secuencia de aminoácidos de una proteina. Los marcadores bioquímicos más
utilizados son los marcadores isoenzimáticos, esto es, enzimas con la misma
función pero con distinto tamaño, carga o conformación. Algunos de los
primeros marcadores de este tipo fueron los grupos sanguíneos y las
inmunoglobulinas. Este tipo de marcadores presentan bajo polimorfismo y baja
sensibilidad y por ello tienen aplicaciones limitadas en comparación con los
marcadores genéticos moleculares basados en el ADN.

 Marcadores moleculares
Estos marcadores detectan variaciones en la secuencia de nucleótidos del
ADN: inversión, inserción, duplicado o eliminación. Generalmente detectan
polimorfismo en secuencias no codificantes. Se pueden dividir en:
 Marcadores asociados a variaciones en el número de repeticiones de una
secuencia: se dividen a su vez en microsatélites y minisatélites.
 Marcadores asociados a variaciones puntuales en el genoma, detectables
o no por enzimas de restricción.
Algunos de los marcadores moleculares más utilizados son:

 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism o Polimorfismo en la longitud


de fragmentos de restricción)
 SSLP (Simple sequence length polymorphism o Polimorfismo en la longitud de
secuencias simples)
 AFLP (Amplified fragment length polymorphism o Polimorfismo en la longitud de
fragmentos amplificados)
 RAPD (Random amplification of polymorphic DNA o Amplificación aleatoria de
ADN polimórfico)
 VNTR (Variable number tandem repeat o Número variable de repeticiones en
tándem. Minisatélite)
 SSR (Simple sequence repeat o Repetición de secuencia simple. Microsatélite)
 STR (Short tandem repeat o Repeticiones cortas en tándem. Microsatélite)
 SNP (Single nucleotide polymorphism o Polimorfismo de nucleótido simple)
 SFP (Single feature polymorphism o Polimorfismos de Característica Única)
 TRAPs (Target Region Amplification Polymorphism, en español Polimorfismos
para la amplificación de regiones blanco)
 DArT (Diversity Arrays Technology, es espñaol Tecnología de Vectores, o
Matrices, de Diversidad)
 RAD (Restriction site associated DNA markers o marcadores de ADN asociados
a sitios de restricción)
b) Los marcadores genéticos ideales

Los marcadores basados en el ADN cumplen una serie de características


que los hacen, en general, más útiles que los marcadores basados en proteínas.
Las características de un marcador genético ideal se pueden resumir en:

 Elevada capacidad de detectar polimorfismo


 Hereditarios
 Capacidad para acceder a todas las regiones de genoma
 Independencia del estado de desarrollo del individuo
 Independencia del estado físico del individuo
 Independencia de las condiciones ambientales
 Facilidad de obtención
c) Aplicaciones

Los marcadores genéticos tienen incontables aplicaciones. Puede que una


de las más evidentes sea la localización y estudio hereditario de rasgos
genéticos, desde el color del pelo a enfermedades genéticas. Esta localización
es muy importante, entre otros, en el ámbito médico. Comprender el área del
genoma involucrada en la herencia de una determinada característica puede
ayudar a entenderla y en algunas enfermedades puede suponer un avance
importante en la prevención, diagnóstico y tratamiento. Por ejemplo, se conocen
algunos marcadores genéticos asociados a un mayor riesgo de padecer cáncer
de mama (estos marcadores señalan la localización de los genes BRCA1 y
BRCA2); actualmente se realizan análisis de estos marcadores en mujeres con
antecedentes familiares de cáncer de mama y en caso de que estén presentes,
estas pacientes pueden decidir por someterse a medidas de prevención más
agresivas. Los marcadores genéticos también se utilizan en las pruebas de
paternidad, medicina forense e investigación criminal. La comparación de
marcadores genéticos entre una muestra conocida y una muestra desconocida
permiten determinar si ambas muestras están relacionadas o sin son idénticas.
Para que se pueda considerar que el resultado es significativo la comparación se
realiza con numerosos alelos. Los estudios filogenéticos se basan también en
este tipo de estudios comparativos.

Otra de las aplicaciones más comunes de los marcadores genéticos es el mapeo


del genoma y la identificación de genes de interés. Como herramienta de
caracterización y diferenciación del genotipo, el análisis de marcadores genéticos
también permite diferenciar individuos sometidos a selección artificial de los que
no, lo que es utilizado por genetistas en la mejora de plantas y ganado.

6) PCR:

PCR son las siglas por las que se conoce a la reacción en cadena de la
polimerasa (en inglés Polymerase Chain Reaction), una técnica científica avanzada
que fue inventada por el bioquímico estadounidense Kary Mullis en 1985. Esta
técnica permite amplificar pequeñas regiones específicas del ADN en laboratorio.
Es decir, consigue que un pequeño segmento de ADN que pasaría desapercibido
en un análisis cualquiera se multiplique millones de veces y así sea fácil de detectar.
Gracias a esta técnica se han podido realizar estudios genéticos en cualquier campo
de la ciencia. Por ejemplo, se utiliza diariamente para la identificación de
cadáveres o en el estudio de escenas del crimen para buscar rastros del
culpable. También se emplea en la biología, para identificar cadenas genéticas de
plantas, animales o, sobre todo, microorganismos. En la medicina se reúne la
experiencia de todos esos campos y se usa principalmente para identificar
gérmenes agresores que se encuentran en nuestro organismo. Cuando se
desarrolló la prueba de la PCR por primera vez se trataba de una técnica cara y
algo engorrosa de realizar, pero pronto se generalizó su uso y se empezaron a
desarrollar equipos sencillos y muy baratos que se utilizan todavía hoy en muchos
centros diagnósticos. Además, se han diseñado PCR más específicas que se
pueden elegir según sea la muestra a estudio. Los diferentes tipos de PCR, además
de la básica, son:

 PCR anidada: consigue amplificar muestras mínimas de ADN a miles de


millones de fragmentos. Es capaz por lo tanto de detectar trazos minúsculos.
 PCR in situ: permite la detección de ADN en el mismo lugar de la muestra, sin
tener que procesarla primero con técnicas de laboratorio. Se suele utilizar para
biopsias o raspados de células.
 PCR múltiple: con este tipo de PCR se consiguen detectar varios trazos de ADN
a la vez y con una sola muestra.
 PCR con transcriptasa inversa: en este caso se utilizan cadenas de ARN para
detectar moldes de ADN. Se utiliza la enzima transcriptasa inversa, la misma
que utiliza el VIH entre otros virus.
 PCR en tiempo real o PCR cuantitativa: se añade un componente fluorescente
que permite medir la luz. A más luz, más cantidad del ADN detectado.
7) Usos de del ADNc

El ADN complementario (ADNc ) es un ADN de doble cadena producido a


partir de un ARN de cadena sencilla (por ejemplo, el ARN mensajero o
microARN). El ARN es usado como molde en una reacción llevada acabo por la
enzima transcriptasa reversa para producir el ADNc.

 Ejemplo de uso 1: El ADNc es producido naturalmente por retrovirus (como


el VIH, virus de la inmunodeficiencia humana) para crear nuevas copias de
sus genes y componentes virales para así generar nuevos virus.
 Ejemplo de uso 2: El ADNc se utiliza a menudo para clonar genes de
organismos. Los científicos han expresado genes que producen proteínas
fluorescentes (como la GFP) proveniente de medusas y las han expresado
en células de plantas o mamíferos. Para expresar dicha proteína, se
transfiere el ADNc que codifica a esa proteína a la célula receptora.

8) SONDA DE HIBRIDACIÓN

Una sonda de hibridación en Biología Molecular es un fragmento de ADN o ARN


de longitud variable (normalmente 100-1000 bases), que se utiliza en el ADN o ARN
de muestras para detectar la presencia de nucleótidos secuencias (la meta de ADN)
que son complementarios a la secuencia de la sonda. La sonda de lo que se hibrida
es una sola cadena de ácidos nucleicos (DNA o RNA) cuya secuencia de bases
permite que la sonda objetivo complete los pares de bases, debido a la
complementariedad entre la sonda y el objetivo de ING. La sonda marcada primero
es desnaturalizada (por calentamiento intenso o bajo condiciones alcalinas tales
como la exposición a la hidróxido de sodio) en el ADN de cadena sencilla (ssDNA)
y luego hibridada al ssDNA (Southern blot) o al ARN (northern blot) inmovilizado en
una membrana o in situ.

Para detectar la hibridación de la sonda con su secuencia diana, la sonda se marca


(o etiqueta) con un marcador molecular de moléculas fluorescentes o radiactivas o
(más recientemente). Los marcadores utilizados son: P 32 (un isótopo radioactivo
de fósforo incorporado en el enlace fosfodiéster en el ADN de la sonda) o
digoxigenina, que no está basada en anticuerpos radiactivos marcados. Las
secuencias de ADN o ARN transcritos que tienen de moderada a alta similitud de
secuencia con la sonda son detectadas mediante la visualización de la sonda
hibridada por autorradiografía u otras técnicas de imagen. Normalmente, ya sea
imágenes de rayos X se toman del filtro o el filtro se coloca bajo luz ultravioleta. La
detección de las secuencias con similitud moderada o alta depende de lo estrictas
que fueran las condiciones de hibridación aplicadas:si son de alto rigor, tales como
temperatura de hibridación alta y baja salinidad de los tampones de hibridación, sólo
permiten la hibridación entre ácidos nucleicos con secuencias muy similares,
mientras que si son de baja severidad, como la reducción de la temperatura y alta
concentración de la sal, la hibridación permite que las secuencias sean menos
similares.

Algunos tipos de sondas

 Sondas Scorpion®
 Sondas Molecular Beacon
 Sondas TaqMan®
 Sondas LNA® (Locked Nucleic Acid)
 Cycling Probe Technology (CPT)
9) ELECTROFORESIS EN GEL

La electroforesis en gel es una técnica utilizada para separar fragmentos de ADN


(u otras macromoléculas, como ARN y proteínas) por su tamaño y carga. La
electroforesis consiste en aplicar una corriente a través de un gel que contiene las
moléculas de interés. Con base en su tamaño y carga, las moléculas se desplazarán
por el gel en diferentes direcciones o a distintas velocidades, con lo que se separan
unas de otras. Todas las moléculas de ADN tienen la misma cantidad de carga por
masa. Debido a esto, la electroforesis en gel separa los fragmentos de ADN
únicamente por su tamaño. La electroforesis nos permite ver cuántos fragmentos
diferentes de ADN están presentes en una muestra y cuán grandes son unos con
respecto a otros. También podemos determinar el tamaño absoluto de un fragmento
de ADN examinándolo junto a una "escala" estándar de fragmentos de tamaño
conocido.

a) ¿Qué es un gel?

Como su nombre lo indica, en la electroforesis en gel participa un gel: un


bloque de material similar a la gelatina. Los geles para separar ADN suelen estar
hechos de un polisacárido llamado agarosa, que se consigue como hojuelas
secas pulverizadas. Cuando la agarosa se calienta en una solución
amortiguadora (agua mezclada con algunas sales) y deja enfriar, se forma un gel
sólido ligeramente blando. A nivel molecular, el gel es una matriz de moléculas
de agarosa que se mantienen unidas por puentes de hidrógeno y que forman
pequeños poros.En un extremo, el gel tiene muescas en forma de ranuras
llamadas pozos, que son donde se colocarán las muestras de ADN:
Antes de agregar las muestras de ADN, el gel debe colocarse en una cámara.
Uno de los extremos de la cámara se conecta a un electrodo positivo y el otro
extremo se conecta a un electrodo negativo. El cuerpo principal de la cámara,
donde se coloca el gel, se llena con solución amortiguadora con sales que puede
conducir la corriente. Aunque tal vez no puedas verlo en la imagen superior
(gracias a mis fabulosas habilidades artísticas), la solución amortiguadora llena
la cámara hasta un nivel en el que apenas cubre el gel. El extremo del gel que
tiene los pozos se coloca hacia el electrodo negativo. El extremo sin pozos (hacia
donde migrarán los fragmentos de ADN) se coloca hacia el electrodo positivo.

b) ¿Cómo se mueven los fragmentos de ADN a través del gel?

Una vez que el gel está en la cámara, cada una de las muestras de ADN que
queremos analizar (por ejemplo, cada reacción de PCR o cada plásmido
digerido con enzimas de restricción) se transfiere cuidadosamente a uno de los
pozos. Un pozo se reserva para el marcador de peso molecular, un estándar de
referencia que contiene fragmentos de ADN de longitudes conocidas. Los
marcadores de ADN comerciales cubren diferentes intervalos de tamaños, por
lo que trataremos de usar uno con buena "cobertura" en el intervalo de tamaños
en el que esperamos encontrar nuestros fragmentos.

A continuación, se aplica energía


eléctrica a la cámara y empieza a fluir
corriente a través del gel. Los grupos
fosfato de su esqueleto de azúcares-
fosfato le otorgan una carga negativa a
las moléculas de ADN, por lo que
comienzan a moverse a través de la
matriz de gel hacia el polo positivo.
Cuando el sistema está encendido y
pasa corriente por el gel, se dice que el
gel está corriendo.
Conforme corre el gel, los fragmentos más cortos de ADN viajarán más rápido a través
de los poros de la matriz del gel que los fragmentos más grandes. Después de un rato
que ha corrido el gel, los fragmentos más cortos de ADN estarán más cerca del
extremo positivo del gel y los más largos se mantendrán cerca de los pozos. Los
fragmentos de ADN muy pequeños podrían correr hasta salirse del gel si lo dejáramos
corriendo por demasiado tiempo (¡algo de lo que definitivamente he sido culpable!).

10) SECUENCIACIÓN DEL ADN

La secuenciación del ADN significa determinar el orden de los cuatro


componentes básicos químicos, llamados "bases", que forman la molécula de ADN.
La secuencia les informa a los científicos la clase de información genética que se
transporta en un segmento específico de ADN. Por ejemplo, los científicos pueden
usar la información de las secuencias para determinar qué tramos de ADN
contienen genes y qué tramos transportan instrucciones regulatorias, que activan o
desactivan genes. Además, y de manera muy importante, los datos de las
secuencias pueden resaltar los cambios en un gen que pueden causar
enfermedades.

En la doble hélice de ADN, las cuatro bases químicas se unen siempre con la
misma pareja para formar "pares de bases". Adenina (A) siempre forma pareja con
timina (T); citosina (C) siempre forma pareja con guanina (G). Este emparejamiento
es la base para el mecanismo mediante el que las moléculas de ADN se copian
cuando las células se dividen, y también es la base para los métodos usados en la
mayoría de los experimentos de secuenciación de ADN. El genoma humano
contiene alrededor de tres mil millones de pares de bases que detallan las
instrucciones para crear y mantener a un ser humano.

a) ¿Hay tecnologías de secuenciación más nuevas en desarrollo?

Una nueva tecnología de secuenciación implica observar moléculas de ADN-


polimerasa a medida que copian el ADN (las mismas moléculas que producen
nuevas copias de ADN en nuestras células) con un microscopio y una cámara
cinematográfica muy rápida, e incorporar distintos colores de tintes brillantes, uno
para cada una de las letras A, T, C y G. Este método ofrece información muy
valiosa y diferente de la que proporcionan los sistemas instrumentales más
frecuentemente utilizados.Otra nueva tecnología en desarrollo implica el uso de
nanoporos para secuenciar el ADN. La secuenciación del ADN basada en
nanoporos implica ensartar hebras de ADN monocatenario a través de poros muy
diminutos en una membrana. Las bases de ADN se leen una a la vez a medida
que pasan apretadamente por el nanoporo. Las bases se identifican al medir las
diferencias en el efecto que producen en los iones y la corriente eléctrica que fluye
a través del poro.

El uso de nanoporos para secuenciar ADN ofrece muchas posibles ventajas en


comparación con los métodos actuales. El objetivo es que la secuenciación coste
menos y sea más rápida. A diferencia de los métodos de secuenciación utilizados
hoy en día, la secuenciación de ADN por nanoporos significa que los
investigadores pueden estudiar la misma molécula una y otra vez.
LINKOGRAFIA
https://es.wikipedia.org/wiki/ADN_ligasa
http://decs.bvs.br/cgi-bin/wxis1660.exe/decsserver/?IsisScript=../cgi-
bin/decsserver/decsserver.xis&task=exact_term&previous_page=homepage&interfac
e_language=e&search_language=e&search_exp=ADN%20Ligasa%20(ATP)
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/UNIDAD_4_PLASMIDOS_2X_23144.pdf
https://curiosoando.com/que-es-un-marcador-genetico
https://www.webconsultas.com/pruebas-medicas/pcr-13299
http://conogasi.org/diccionario/adnc/
https://es.wikipedia.org/wiki/Sonda_de_hibridaci%C3%B3n
https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-sequencing-
pcr-electrophoresis/a/gel-electrophoresis
https://www.genome.gov/about-genomics/fact-sheets/Secuenciacion-del-ADN