“Universidad nacional José FaUstino sánchez

carrión”

Facultad: Ingeniería Química y Metalúrgica

E.A.P.: Ingeniería Química

Curso: Biotecnologia para ingenieros quimicos

Tema: Manejo de microscopio,tinción gran y siembra en agar nutritivo

Docente: Ing. LRobert w. ocrospoma Dueñas

Ciclo: V
Alumna: Soto calixto , jholsin kevin

Huacho - 2018
 INDICE:

NORMAS DE SEGURIDAD -------------------------------------------------------------------------------PAG3

OBJETIVO------------------------------------------------------------------------------------------ PAG4

INTRODUCCION----------------------------------------------------------------------------------PAG5

MARCO TEORICO--------------------------------------------------------------------------------PAG6

DEFINICION DE TERMINOS--------------------------------------------------------------------PAG7.

MATERIALES Y EQUIPOS-----------------------------------------------------------------------PAG8

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL ----------------------------------------------------------PAG9

CONCLUSIONES----------------------------------------------------------------------------------PAG10

ANEXOS -------------------------------------------------------------------------------------------PAG11

BIBLIOGRAFIA------------------------------------------------------------------------------------PAG12
 NORMAS DE SEGURIDAD

Antes de empezar hay algunas normas que tenemos que tomar encuenta antes de empezar la practica

1) No se puede fumar ni comer en el laboratorio

2) Es obligatorio la utilización de la bata

3) La ropa y los objetos personales no deben mantenerse cerca de las zonas de trabajo

4) Al comenzar las prácticas conviene colocar un papel de filtro sobre la zona de

manipulación, y retirarlo al terminar el día.

5) Lavarse las manos cuidadosamente antes de salir del laboratorio

 OBJETIVO:

 Aprender las partes y su correcto uso del microscopio óptico, tinción de Gram de
Bacillus thuringiensis y los tipos de siembra en agar nutritivo

 Aislar cocos Gram positivos y negativos a partir de una muestra de secreción

faríngea. Aplicar pruebas enzimáticas para su identificación.
 INTRODUCCION:

Los microorganismos se encuentran ampliamente distribuidos, pero no requieren de mayor

espacio para su continua reproducción, por lo que es sencillo crear un ambiente artificial dentro
de un tubo de ensayo, un matraz o una caja Petri. El recipiente debe estar completamente estéril
previo a la inoculación de microorganismos, y posterior a esta debe ser protegido contra
posibles factores contaminantes externos. Para ello la caja Petri cuenta con una tapa que lo hace
correctamente, que al voltearla no solo evita la contaminación externa de la muestra, sino
también la fuga de microorganismos que se encuentran en la muestra. En el caso de matraces o
tubos de ensayo, existen tapones especiales como los de algodón que evitarán la fuga o ingreso
de microorganismos, de la misma forma existen tubos de tapa rosca que son más seguros
incluso al momento de manipularlos.1 Los medios de cultivo son indispensables para el
aislamiento y separación de microorganismos, especialmente de bacterias, lo que permitirá su
correcta identificación y por lo tanto un diagnóstico asertivo. Para ello se procede a la siembra
del microorganismo que no es más que la estriación desde la muestra inoculada previamente
inoculada, lo que permitirá separar a la bacteria en colonias facilitando su estudio Los
microorganismos se encuentran ampliamente distribuidos, pero no requieren de mayor espacio
para su continua reproducción, por lo que es sencillo crear un ambiente artificial dentro de un
tubo de ensayo, un matraz o una caja Petri. El recipiente debe estar completamente estéril
previo a la inoculación de microorganismos, y posterior a esta debe ser protegido contra
posibles factores contaminantes externos. Para ello la caja Petri cuenta con una tapa que lo hace
correctamente, que al voltearla no solo evita la contaminación externa de la muestra, sino
también la fuga de microorganismos que se encuentran en la muestra. En el caso de matraces o
tubos de ensayo, existen tapones especiales como los de algodón que evitarán la fuga o ingreso
de microorganismos, de la misma forma existen tubos de tapa rosca que son más seguros
incluso al momento de manipularlos.Los medios de cultivo son indispensables para el
aislamiento y separación de microorganismos, especialmente de bacterias, lo que permitirá su
correcta identificación y por lo tanto un diagnóstico asertivo. Para ello se procede a la siembra
del microorganismo que no es más que la estriación desde la muestra inoculada previamente
inoculada, lo que permitirá separar a la bacteria en colonias facilitando su estudio.
 MARCO TEORICO:

Debido a la naturaleza química de la celula bacteriana , su afinidad por los colorantes,su

propiedad ha sido aprovechada para estudiar los diferentes tipos morfológicos y estructuras
(capsulas, esporas,flagelas ,etc) que ayudan a la identificacion de una especie o grupo en
particulas .Los colorantes de mayor aplicacio9n son:cristal violeta voleta de genciana fucsina
basica safranina azul de metileno y verde malaquta.Actuan mejor mediante la adicion de
mordientes,
Por que aumentan la permeabilidad de la pared celular y membrana citoplasmatica
 DEFINICION DE TERMINOS

1. Cristal Violeta

El violeta de metilo, comúnmente denominado cristal violeta o violeta de genciana, es el

nombre dado a un grupo de compuestos químicos empleados como indicadores de pH y
colorantes.

Los violetas de metilo son mezclas de: N-tetra, N-penta y N-hexametil p-rosanilinas. Por la
mezcla de diferentes versiones, el fabricante puede crear diferentes tonos de violeta en el
colorante final. Cuanto más metilado esté el colorante, su color será de un violeta más
oscuro
2. Lugol

El lugol o disolución de Lugol es una disolución de yodo molecular I2 y yoduro potásico

KI en agua destilada. Se preparó por primera vez en 1829 y recibe su nombre en honor
al médico francés Jean Guillaume Auguste Lugol.

Este producto se emplea frecuentemente como desinfectante y antiséptico, para la

desinfección de agua en emergencias y como un reactivo para la prueba del yodo en
análisis médicos y de laboratorio.

3. Alcohol

El alcohol es un líquido incoloro, de olor característico, soluble tanto en agua como en

grasas; se caracteriza por ser una sustancia psicoactiva, depresora del sistema nervioso
central, y con capacidad de causar dependencia.

Se calcula que 1 gramo de alcohol aporta al organismo 7,1 Kcal.; este aporte energético
no se acompaña de un aporte nutritivo como minerales, proteínas o vitaminas.

4. Safranina

La safranina (también llamada Safranina O o rojo básico 2), es un colorante biológico, de

contraste que se utiliza en la Tinción de Gram para proporcionar un color violeta más intenso
a las bacterias Gram+ y tiñe de rosa a las bacterias G- ; en histología y en citología. La
safranina se usa como líquido de contraste en algunos protocolos de tinción, coloreando
el núcleo celular de rojo.
 MATERIALES Y EQUIPOS:

PORTAOBJETO:
Lamina de vidrio rectangular de color transparente utilizada para almacenar muestras y objetos
con el fin de observarlas bajo el miscroscopio. Las dimensiones tipicas de un portaobjeto son de
75mm x 25mm, sin embargo estan pueden variar dependiendo del tipo de objeto o muestra (en
geologia suelen utilizarse portaobjetos de 75 x 50 mm).

PLACA PETRI:
La caja o placa de Petri es un recipiente redondo, de cristal o plástico, con una cubierta de la
misma forma que la placa, pero algo más grande de diámetro, para que se pueda colocar encima
y cerrar el recipiente, aunque no de forma hermética. Es parte de la colección conocida como
«material de vidrio». Se utiliza en Microbiología para cultivar células, observar la germinación de
las semillas o examinar el comportamiento de microorganismos.

MECHERO:
Mechero de uso habitual en laboratorios de química o biología ideal para el calentamiento
de instrumentos de vidrio (tubos de ensayo, matraces, etc) o la esterilización de material
metálico. Es una fuente de calor de baja intensidad que funciona con alcohol metílico
(alcohol de quemar).
 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Preparación de muestra y tinción Gram

a) PRIMER PASO
Se tiene un portaobjetos en la cual se hecha una gota de cristal violeta (colorante inicial) por
1 minuto.

b) SEGUNDO PASO
Se lavara con agua destilada.

c) TERCER PASO
Luego en este mismo portaobjetos se hecha una gota de lugol (mordiente) por 1 minuto.

d) CUARTO PASO
Luego se decolora con alcohol de 95° (decolorante).

e) QUINTO PASO
Se lavara con agua destilada.

f) SEXTO PASO
Luego en este mismo portaobjetos se hecha una gota de safranina (colorante contraste)
por 1 minuto.

g) SEPTIMO PASO
Se lavara con agua corriente, y luego se secara suavemente.

Siembra de agar nutritivo

1. PRIMER PASO
En las placas Petri con A. nutritivo se toma una muestra

2. SEGUNDO PASO
Luego se procede a colocar la muestra tomada en otra placa petri vacía

3. TERCER PASO
Se procede a marcar con un plumón indeleble cuatro cuadrantes por la placa.

4.CUARTO PASO
Por lo marcado p0asamos la bacteria y luego lo tapamos bien para que se estresen y asi
poder reproducirse
 CONCLUSIONES

- La tinción de gram es una prueba potente y rápida que nos permite diferenciar dos clases
de bacterias: Grampositivas y las Gramnegativas.

- Las grampositivas se tiñen de morado ya que el colorante se queda atrapado en la capa

gruesa de peptidoglucanos que rodea a la celula.

- Las gramnegativas tienen una capa de peptidoglucano mucho mas delgado es por ello
que no retiene el violeta cristal y por esto las células se tiñen con safranina y las
observamos rojas.

- El uso del mechero fue fundamental para la creación de un diámetro de seguridad al

momento de manipular los medios de cultivo. Las reacciones de hemólisis permite
identificar el tipo de bacteria con la que se está tratando, por ende asegura un mejor
diagnóstico.

- El uso de los medios de esterilización debe ser preciso caso contrario se contaminaría el
personal y el entorno en donde se encuentra manipulando muestras.
ANEXOS:

En la fig.1 se puede observar un

microscopio óptico del laborratorio

En la fig.2 se observa un
portaobjetos
 Bibliografía
1. Villanueva, J. Microbiología. 2ª Edición. España: Reverté. 1992. p. 18, 19, 20, 21. Disponible
en:
http://books.google.com.ec/books?id=2u6Q2XCMDgC&pg=PA18&dq=aislamiento+de+micro
organismos&hl=en&sa=X&ei=oWN
nUvGxHYnskQeIhYDQBA&ved=0CDUQ6AEwAg#v=onepage&q=aislamiento%20de%20
microorganismos&f=false
2. Rodriguez, E. Bacteriología General: Principios y Prácticas de Laboratorio. 1ª Edición. Costa
Rica: Universidad de Costa Rica. 2005. p. 107,108, 109, 152-18. Disponible en:
http://books.google.com.ec/books?id=vwB0fgirgN0C&printsec=frontcover&dq=micro
biologia+general+rodriguez&hl=es&sa=X&ei=OQRoUuySJ8GkQfu6YHABA&ved=0CD8Q6
wEwAw#v=onepage&q=microbiologia%20general%20rodri guez&f=false
3. Montero, C. Manual de Técnicas de Histoquímica Básica. México: Universidad autónoma de
San Luis Potosi. 1997. p 114.
4. Nelson, P. Física Biológica: energía información y vida. New York: Freeman and Company.
2004. p 143.
5. Forbes, B. Diagnóstico Microbiológico. 12ª Edición. Buenos Aires: Medica Panamericana.
2009. p 257, 258, 259.
6. Faddin, M. Pruebas Bioquímicas para la identificación de Bacterias de Importancia Clínica.
3ª Edición. Buenos Aires: Médica Panamericana. 2003. p 86
7. Laboratorios Britania. Argentina: Laboratorios Britania. 2010. [actualizado 2010, citado 23
de octubre de 2013]. Disponible en:
http://www.britanialab.com/productos/236_hoja_tecnica_es.pdf
8. Laboratorios Britania. Argentina: Laboratorios Britania. 2010. [actualizado 2010, citado 23
de octubre de 2013]. Disponible en:
http://www.britanialab.com/productos/231_hoja_tecnica_es.pdf
9. GARCIA, P. FERNANDEZ DEL BARRIO, M. Microbiología Clínica Práctica. 2nda Edición
.Cádiz: Respeto-Cadiz. 1994. p. 50, 51, 52, 53, 54, 55. Disponible en:
http://books.google.com.ec/books?id=4N8qVKckrUUC&pg=PA51&dq=medios
+de+cultivo&hl=en&sa=X&ei=YUBVUttM08TgA6mXgdgJ&ved=0CDcQ6wE
wAg#v=onepage&q=medios%20de%20cultivo&f=false
 CUESTIONARIO

1. ¿El diámetro del campo visual es directo o inversamente proporcional al poder de aumento

del objetivo?

Se denomina campo visual a lo que se observa a través de algo. También podemos

definirlo como la proporción del plano visible observando a través del microscopio. Si el

aumento es mayor, el campo disminuye, lo cual quiere decir que el campo es inversamente

proporcional al aumento. Para medir el diámetro del campo del microscopio con

cualquiera de los objetos de utiliza el micrómetro.

2. ¿Por qué es importante conocer el tamaño de un organismo microscópico?

Para saber su verdadero tamaño y para saber cómo funciona cada parte de lo que lo

conforma, además para saber que microscopio podríamos usar.

3. ¿Qué relación existe entre el poder de aumento de los objetivos y el área del campo

visual?

La única ventaja sería la gran observación en el microscopio en cuánto al tamaño del

microorganismo de cualquier tipo, sin esa parte importante no tendríamos pruebas claras
ni siquiera conclusiones acerca de relatar información de las bacterias.

4 ¿Qué relación existe entre el poder de aumento de los objetivos y el área del campo

visual? Explique.

 Tenemos dos formas de relacionar entre sí los diámetros con los poderes de aumento. Por

esas únicas formas aparecen a continuación en donde a es el poder de aumento menor. a

es el poder de aumento mayor, d es el diámetro del campo visual con menor aumento y

de es el diámetro del campo visual con mayor aumento. Hay dos formas de relacionar

entre sí los diámetros con los poderes de aumento. Esas dos formas aparecen a

continuación en donde a es el poder de aumento menor, a2 es el poder de aumento mayor,


 de es el diámetro del campo visual con menor aumento y d2 es el diámetro del campo

visual con mayor aumento.

7.-Describa con sus propias palabras el procedimiento de las técnicas realizadas en esta práctica,

los materiales y equipos utilizados.

 Técnicas:

-Técnicas de cuadrantes

-Siembra por estrías

-Siembra por estrías por desplazamiento

-Siembra por segmento o cuadrante

 Materiales:

- Asa de Siembra

-Mechero

-Placas de Vidrio

-Placa Petri

-Colorantes

-Pisceta

 Equipos:

Microscopio OpticO

9.- ¿Las bacterias aparecen aisladas o agrupadas?

Nosotros la vimos agrupadas y según el tipo de Gram que usamos con los colorantes nos indico

que las bacetias Bacilus Turigense es una gran positiva.

10.-Como son aplicables estos conocimientos en su profesión?

Estos conocimientos nos podrían ayudar cuando queremos producir a escala un sembrado de

bacterias ya sea para que los cultivos no sean afectados por las plagas de los insectos, siempre y

cuando nos enfoquemos en una rama de biología o referentes a plantas y suelos (ahí se

encuentran las bacterias).

12.-Describa las formas de incubación, que son ambientes aerofilicos y anaerofilicos, según las
temperaturas en que se pueden clasificar los microorganismos.
-Aerofilicos:
Su medio de incubación principalmente consiste en tener oxígeno para poder vivir, ya puede ser en un
ambiente normal ventilado o en un ambiente donde halla atmosfera.
-Anaerofilicos:
Consiste en tener tanto un poco de oxigeno como no tener oxigeno en ambos lados se reproducen es
como no tener mucho de los dos sino un poco de los dos puede estar en una incubadora con una
pecheña cantidad de oxigeno como en una cámara donde se pueda extraer el oxigeno.