UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS - ESPE

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA AGRICULTURA

CARRERA DE INGENIERÍA AGROPECUARIA IASA I
INFORME DE SANIDAD ANIMAL

Albuja Elizabeth*, Ayoví Francisco *, Muñoz Diego*, Ruiz Marcelo*, Simba Carlos*
Estudiantes de Practicas de campo Octubre18 –Febrero 9
Tutor: Dr. Jorge Ron
Sexto Nivel A de la Carrera de Ingeniería Agropecuaria de la Universidad de las Fuerzas
Armadas.

ELISA indirecto par IBR ( Rinotraqueitis Infecciosa Bovina )

Introducción

La rinotraqueítis infecciosa bovina (IBR) es una enfermedad infecciosa altamente contagiosa

causada por el herpesvirus-1 bovino (BHV-1). Además de causar enfermedad respiratoria, este
virus puede causar conjuntivitis, abortos, encefalitis e infecciones sistémicas generalizadas. Si
bien las manifestaciones clínicas pueden sugerir fuertemente que se trata de IBR, ningún signo
patognomónico real proporciona un diagnóstico clínico de IBR. Por tanto, es necesaria la
confirmación de laboratorio para identificar una infección por BHV-1. La confirmación de la
exposición al BHV-1 se realiza mediante la medición de anticuerpos en suero, plasma o leche.
Los países que tienen programas de control de IBR exigen certificación de libre de IBR previo al
embarque de ganado hacia sus regiones. En muchos programas de IBR europeos el
procedimiento de prueba de elección es ELISA (Martinez, 2015).

La prueba de inmunoabsorcion ligada a enzimas (ELISA), es una herramienta de diagnóstico muy

útil en la determinación serológica de anticuerpos o antígenos de manera secuencial. La técnica
de ELISA se desarrolló en 1971 y desde entonces ha sufrido modificaciones (Demmler, G. J.,
Steinberg, S. P., Blum, G., & Gershon, A. A., 1987); sin embargo, el principio de esta técnica
involucra la unión e inmovilización de un anticuerpo o antígenos en una fase solida insoluble
(Cserkinsky, C. C., et. al., 1984); en la actualidad, ha tomado gran importancia en el diagnóstico
de enfermedades infectocontagiosas, considerándola como una prueba diagnóstica de
laboratorio segura, rápida, sensible y especifica (Barrera Calva, Cordova Izquierdo, & De la O
Ramirez, 2005).

Cabe destacar que como técnica de diagnóstico, se incrementa día a día la utilización de ELISA
en el laboratorio de análisis clínico ya que esta presenta grandes ventajas respecto a otras
técnicas tradicionales. La prueba de ELISA está considerada a ser técnicamente superior a la
prueba de seroneutralización para la detección rutinaria de anticuerpos virales de la
Rinotraqueítis Infecciosa Bovina (IBR) (Barrera Calva, Cordova Izquierdo, & De la O Ramirez,
2005).

La importancia de este tipo de estudio radica en que esta prueba serológica sirve como un tamiz
para detectar focos de infección de un hato con problemas reproductivos y respiratorios,
determinado la prevalencia de la enfermedad en las distintas zonas ganaderas del país y poder
establecer las medidas profilácticas adecuadas en las unidades de producción animal.

El presente informe muestra el resultado del análisis de resultados ELISA IBR-Ab de muestras de
suero tomadas en el IASA 1 – Hacienda el Prado – Sangolquí

Marco teórico

IBR es una enfermedad causada por herpesvirus tipo 1 (BHV-1). Afecta al aparato respiratorio y
al reproductor, y como virus de la familia de los herpes que es, se caracteriza por dejar a los
animales afectados como latentes durante toda su vida, pudiendo de esta manera afectar a
animales sanos que estén a su alrededor.
El contagio de IBR, se realiza de manera directa, aunque también hay casos de infección
congénita, a través del calostro y en el momento del parto.
En algún caso puede haber animales que están infectados pero que son negativos a las analíticas.
Esto sucede cuando un ternero se infecta al nacer, este no produce anticuerpos contra la
enfermedad ya que le bastan con los adquiridos a través del calostro materno. Cuando el ternero
tenga entre 6 o 7 meses, los anticuerpos procedentes del calostro desaparecerán, pero el animal
seguirá siendo negativo hasta que el virus, que se encuentra en estado latente, se reactive
(Mantilla, 2016).

SINTOMATOLOGÍA
El herpesvirus tipo 1 (BVH-1), puede presentar dos formas clínicas:
1. IBR (rinotraqueitis infecciosa bovina):
Los síntomas que presenta son oculares y respiratorios: fiebre, descarga nasal, conjuntivitis,
descarga ocular, aumento de la frecuencia respiratoria, tos, depresión, anorexia, problemas de
fertilidad, y en algunos casos, abortos en hembras gestantes.
2. IPV (Vulvovaginitis Pustular Infecciosa) en hembras o IPB (Bulbopostitis Infecciosa) en machos:
En estos casos los síntomas se reflejan en su mayoría en el aparato reproductor, se dan por
transmisión sexual, lo que lo convierte en una forma muy común en los animales que acuden a
pastos comunales. Observaremos una disminución de las tasas de concepción, abortos,
nacimiento de animales débiles.
Lamentablemente no tenemos técnicas serológicas para diferenciar un tipo del otro.

CONTROL DE LA ENFERMEDAD

Se hace a través del control de los animales nuevos en la explotación (libres de IBR) y la
vacunación, que nos sirve para proteger a los animales jóvenes de la infección, y para reducir la
diseminación de la misma a partir de los animales adultos ya infectados. La vacunación se debe
hacer con vacunas marcadas que nos permitan diferenciar animales vacunados de enfermos. En
las vacunas marcadas se ha llevado a cabo una elección de la glicoproteina E, por lo que en un
test ELISA de IBRgE, los animales libres de enfermedad obtendrán un resultado negativo a pesar
de estar vacunados. Sin embargo, los que han adquirido la enfermedad en campo, si que
obtendrán un resultado positivo. Con la vacunación de animales positivos, conseguimos reducir
los síntomas de la enfermedad y lo que más nos interesa en nuestro proceso de erradicación,
reducimos la diseminación de la enfermedad (Mantilla, 2016).

IMPORTANCIA DE LA LUCHA FRENTE A IBR

LA IBR es una enfermedad que, aunque no sufre una gran mortalidad, si que produce perdidas
en la producción, por lo que en algunos países de Europa se están llevando planes para su
erradicación desde hace ya unos años. Una de las medidas que conlleva estos planes, es la
prohibición de exportar animales que tengan una serología positiva a IBR, lo que impide e
impedirá más aún en un futuro el comercio de ganado español con otros países comunitarios,
excepto de las ganaderías que consigan la calificación de oficialmente indemne a IBR.
Objetivo general

 Determinar muestras que contengan anticuerpos contra IBR mediante ELISA indirecto.

Objetivos específicos

 Interpretar los resultaos en base a los rangos propuestos por el kit de Elisa para
confirmación de presencia de anticuerpos de IBR en el suero
 Conocer el modo de acción de las pruebas ELISA.

Materiales y Métodos

Ubicación

Se realizó en la Hacienda el Prado, en la provincia de Pichincha, Cantón Rumiñahui, sector San

Fernando a 2748 msnm. Esta georreferenciada con las coordenadas 78°24´44´´ (O) y 0°23´20´´
(S) (Sarmiento, 2011).

Materiales

 Kit ELISA SVANOVIR ® IBR-Ab

 Pipetas de precisión
 Puntas de pipetas desechables
 Agua destilada, desionizada o cualquier otra agua altamente purificada.
 Botella de enjuague, sistema de enjuague de placas multicanales.
 Recipiente de 1 a 2 litros para PBS-Tween
 Fotómetro para microplacas, filtro de 450 nm

Preparación de reactivos

Tampón PBS-Tween:
Diluir la solución PBS-Tween 20 x en una proporción de 1/20 en agua destilada. Preparar
500 ml por placa añadiendo 25 ml de solución de PBS-Tween a 475 ml de agua destilada
y mezclar muy bien.
Procedimiento

1. Antes de su uso debe dejarse que los reactivos alcancen una temperatura ambiente de
18-25°C. Marcar cada tira con un número.
2. Añadir muestras.
3. Añadir 90 μl de la solución PBST-Tween a cada pocillo que use para las muestras de
sueros y controles.
4. Añadir 10 μl de suero control positivo (Reactivo A) y 10 μl de suero control negativo
(Reactivo B) respectivamente a los pocillos seleccionados recubiertos con antígeno IBR.
Para confirmación, se recomienda correr los controles de suero por duplicado.
5. Añadir μl de la muestra de suero a un pocillo recubierto con antígeno IBR. Las muestras
pueden ser procesadas individualmente o en duplicado. Sin embargo, para propósito de
confirmación se recomienda correr las muestras en duplicado.
6. Agitar la placa bien pero cuidadosamente. Sellar la microplaca / tiras e incubar a 37°C
por 1 hora o / durante la noche (16-20 horas) a 2-8°C
7. Enjuagar las placas / tiras 3 veces con solución PBS-Tween: en cada ciclo de enjuague,
rellenar los pocillos, vaciar la placa y golpearla sobre una superficie cubierta con material
absorbente para eliminar todo resto de líquido.
8. Añadir 100 μl de conjugado a cada pocillo. Sellar la microplaca/tiras e incubar 37°C
durante 1 hora
9. Repetir el Paso 7
10. Añadir 100 μl de la solución substrato a cada pocillo e incubar por 10 minutos a
temperatura ambiente (18-25°C). Activar el cronómetro una vez que haya llenado el
primer pocillo.
11. Interrumpir la reacción añadiendo 50 μl de solución frenadora a cada pocillo y mezclar
bien. Añadir la solución frenadora en el mismo orden que con la solución de substrato
en el paso 7
12. Medir la densidad óptica (DO) de las muestras y controles a 450 nm con un fotómetro
para microplacas. Medir la densidad óptica (DO) dentro de 15 minutos después de haber
agregado la solución frenadora para así prevenir la fluctuación de valores OD.
El desarrollo de color se debe a la interacción del conjugado con el substrato. El cambio de color
indica un resultado positivo que se lee con un fotómetro (Lector ELISA) que mide la densidad
óptica OD, con un filtro de 450nm.

Método

El procedimiento del kit se basa en un ELISA indirecto en donde la muestra se expone a un

antígeno inactivado de IBR inmovilizado en pocillos de microplacas/ tiras. Si las muestras
contienen anticuerpos contra IBR, estos reaccionarían con el antígeno inmovilizado en la
microplaca. El conjugado de HRP (peroxidasa de rábano picante) agregado posteriormente,
formará un complejo con los anticuerpos contra IBR. Los reactivos en exceso se lavan antes de
agregarse la solución substrato.

Cálculo

Valores positivos porcentuales (PP)

Todos los valores de DO de las muestras y controles negativos se relacionan con el valor DO del
control positivo.

𝐷𝑜𝑀𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑜 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜

𝑃𝑃 = 𝑥100
𝐷𝑜𝑀𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑜 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜

Interpretación de los resultados

- Criterios de validez
Para confirmar la validez, los valores duplicados de DO del control positivo no deben
diferir mas de un 25% del valor medio de los dos duplicados. Además, los valores de
control (de suero y leche) deben encontrarse entre los siguientes límites.

DO Control positivo ≥ 0.9

PP Control negativo < 15

Si no cumple con ninguno de estos criterios la prueba no se considerará valida.

Resultados

H C+ 6

G C+ 6

F C- 9

G C- 9

D 8 4

C 8 4

B 5 7

A 5 7

1 2

En las pruebas de criterios de Validez se encontró que las pruebas positivas no diferían más del
25%, en tanto al control negativo si difirió con más del 25%.

Conclusiones

 La prueba ELISA se confirmó como no valida y esto es debido a que se encontraba

caducada además de una alteración en los pocillos de Negativos y Positivos con efecto
didáctico.
 La prueba ELISA SVANOVIR ® IBR-Ab en condiciones y bajo las normas establecidas de
trabajo en laboratorio, permite la detección de anticuerpos de IBR y es recomendable
debido a su alta sensibilidad.
 Se encontró además falsos positivos debido a una falla en la máquina de lavado, que
poseía uno de los conductos tapados impidiendo el lavado correcto de los pocillos en la
fila D
Recomendaciones
 Seguir a detalle las instrucciones del fabricante, para una correcta práctica.
 Al momento de poner el substrato se mantenga en un lugar oscuro, ya que tiene
influencia directa la luz.

Bibliografía

Barrera Calva, E., Cordova Izquierdo, A., & De la O Ramirez, F. d. (2005). Diagnostico de
Rinotraqueitis Infecciosa Bovina mediante Inmunoperoxidasa. Revista Electronica de
Veterinaria REDVET. , VI (11), 7.

Cserkinsky, C. C., Tarkowski, A., Nilsson, L. A., Ouchterlony, O., Nygren, H., & Andgretzer, C.
(1984). Reverse enzyme-linked immunospot assay (RELISPOT) for the detection of cell
screting immunoreactive substances. Journal Imnulo. Meths (72), 489.

Demmler, G. J., Steinberg, S. P., Blum, G., & Gershon, A. A. (1987). Rapid. enzymelinked
immunosorbet assay for detecting antibody to varicella zoster virus. Journal Infect. Dis. ,
157 (1), 211.

Mantilla, A. (3 de 12 de 2016). SAAMENS. Obtenido de

https://sameens.dia.uned.es/Trabajos11/Trab_Publicos/Trab_7/Ruiz_Mantilla_7/IBR.htm

Martinez, M. (28 de 05 de 2015). AMMVET. Obtenido de

http://www.ammveb.net/clinica/ibr.pdf
Anexos

Imagen1. Kit de ELISA Imagen 2. Proceso de

SVANOVIR ® IBR-Ab incubación de la placa

Imagen 3.Sintomatología
Imagen3. Pipeteo de suero en
los heces
pocillos de la placa ELISA
oscuras Imagen 4. Seguimiento de
pasos por medio de la guía del
KIT