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Ionóforos:
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- Formadores de canais O canal transportador encontra-se fixo à
membrana, formando um poro hidrofílico que permite a passagem de iões, é um
transporte menos específico.
Transportadores móveis
Ex. Valinomicina:
Preferência por iões K+ relativamente a Na+. (Raio Iónico do K+ > Na+: 1,33 Ǻ e
0,95 Ǻ respectivamente)
- O raio do ião;
- A energia de dessolvatação (energia de ligação do ião às moléculas de água
que lhe permitem circular na água) ΔG associada a hidratação.
Os ionóforos do tipo móvel são mais selectivos devido a estes factores, enquanto os
outros formam apenas poros. No poro, não é necessário ter a energia de dessolvatação
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em linha de conta. Quando se utiliza um ionóforo, aumenta-se a permeabilidade da
membrana, mas o transporte dá-se sempre no sentido do gradiente.
Ex. Monensina:
Ex. X-537A:
Foi dos primeiros antibióticos a ser descoberto e um dos mais usados, embora
na actualidade não o seja.
Transporta catiões monovalentes e bivalentes, por troca com protões.
A molécula X-537A não é muito específica. Os seus grupos carboxilo são
desprotonados quando o ião se liga. No caso de um ião bivalente, são necessárias duas
moléculas de X-537A e duas desprotonações, formando-se um dímero.
Ex. A23187:
Trata-se de uma molécula aberta que se fecha quando complexa o ião, sendo
que as suas extremidades se unem através de uma ligação de hidrogénio.
É um ionóforo carboxílico móvel para catiões bivalentes, nomeadamente cálcio
2+
(Ca ).
Funciona da mesma maneira que o ionóforo anterior. Como o ião cálcio tem
duas cargas positivas, são necessárias duas moléculas do ionóforo, que realizam a
transferência electricamente neutra dos iões, ou seja, juntamente com o cálcio são
transportados dois aniões ou um catião bivalente, para o lado oposto. O objectivo final é,
sempre, manter a electroneutralidade.
A utilização de ionóforos de cálcio contribuiu decisivamente para a compreensão
do papel do Ca2+ nos processos celulares. Não é possível injectar cálcio nas células, mas
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recorrendo a este ionóforo o transporte deste ião torna-se é possível. Muitas respostas
fisiológicas normalmente accionadas pela ligação de hormonas a receptores
membranares de superfície podem ser deduzidas pela utilização de ionóforos de cálcio
que fazem elevar os níveis de Ca2+ intracelular.
Ex. Nigericina:
Conclusões:
Formadores de canais:
Estes ionóforos são muito menos selectivos para os iões a transportar, contudo
o seu transporte é bem mais rápido.
Existe um poro pelo qual ocorre transporte inespecífico.
Ex. Gramidicina:
Ex. Dinitrofenol:
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carga negativa encontra-se repartida por toda a estrutura, tendo por isso de um modo
geral baixa densidade de carga, o que lhe confere vantagem para se difundir pela
membrana.
Encontra-se na forma protonada quando o pH é
menor e na desprotonada quando é maior.
O protonóforo liga o protão na face externa da
membrana e, no interior da célula, após passar pela
membrana, desliga-o.
Funciona como desacoplador da fosforilação
oxidativa, pois dissipa o gradiente electroquímico
transportando H+ para o interior da matriz.
Ex. FCCP:
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Aplicação dos Ionóforos:
Transporte activo:
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Classes de ATPases responsáveis pela manutenção do gradiente iónico:
1. Classe P
2. Classe F
3. Classe V
4. Superfamília ABC
Classe P:
Funciona como antiporta, lançando 3 Na+ para fora e 2 K+ para dentro. É por isso
um sistema electrogénico, que cria um movimento “net” de 1+ para fora, gerando uma
carga negativa dentro da célula.
O mecanismo pelo qual esta bomba actua é simples: Os iões de Na+ e o ATP
ligam-se ao transportador quando este se encontra na conformação E1 (face citosólica da
membrana). O ATP é desfosforilado e o fosfato resultante vai fosforilar um resíduo de
aspartato do transportador, induzindo uma alteração conformacional da forma E1 para a
E2. Os iões de Na+ são libertados para o espaço extracelular, ligando-se de seguida dois
iões de K+ ao transportador (face exoplasmática). Esta ligação promove a remoção do
grupo fosfato, levando a nova alteração conformacional. Finalmente os iões de K+ são
libertados completando o transporte de iões.
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A ouabaína e a digoxigenina são duas drogas capazes de inibir a função desta
bomba. Ligam-se à face exoplasmática, competindo directamente com o K+ pelo local de
ligação ao transportador e inibindo deste modo a desfosforilação do resíduo de aspartato
e consequentemente a função da ATPase.
Experiências realizadas em proteoliposomas com Na+/K+ ATPases na membrana
provaram que é possível sintetizar ATP. Ao induzirmos um interior celular com elevada
concentração de K+ e um exterior rico em Na+, verifica-se que o transporte se efectua no
sentido oposto ao observado nas células, dissipando-se o gradiente gerado
artificialmente. O resultado é a produção de ATP a partir de ADP + Pi. Isto vem provar
que as ATPases podem também funcionar como ATP sintetases.
Nota: Bactérias, fungos e plantas não possuem esta bomba iónica. Nestes
organismos o Δψ de membrana é gerado por outras proteínas.
Bactérias anaeróbias possuem H+ ATPases, que usam o ATP resultante da glicólise
para gerar um gradiente de protões. A energia é então conservada num gradiente iónico
sendo utilizada para transportar solutos contra o gradiente de concentração (transporte
activo secundário).
Bactérias aeróbias e mitocôndrias funcionam de forma semelhante. Na cadeia
respiratória ocorre transporte de electrões, e associado a este a expulsão de H+. A
energia libertada no processo de transferência de electrões é armazenada num gradiente
de H+ sendo depois utilizada na síntese de ATP.
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Experiência de Mitchell – Reversibilidade das ATPases:
Calmodulina (CaM):
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Inibidores da Calmodulina:
H+ ATPases:
Classe F:
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Classe V:
A acidificação (pH baixo) provocada por estas bombas permite uma melhor acção
de clivagem de enzimas digestivas, pois causa desnaturação.
São importantes no crescimento dos ossos.
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Em suma existem três grandes tipos de transportadores nas membranas
vacuolares: Bombas protónicas, canais proteicos, e transportadores antiporta.
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Permeases da Membrana Plasmática de Bactérias:
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Possível modelo de acção da MDR1 – Modelo Flipase:
Mutações no gene codificante para esta proteína podem ter os seguintes efeitos:
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Qualquer um dos casos resulta num canal de Cl- não funcional.
Normalmente, as células epiteliais que revestem a superfície interna dos pulmões
secretam uma substância mucosa, que aprisiona e mata as bactérias invasoras, sendo
estas expelidas para o exterior com a ajuda do movimento dos cílios das células do trato
respiratório.
Em indivíduos saudáveis, o muco é uma solução com baixa concentração de
NaCl, infelizmente em pacientes com fibrose cística a concentração de NaCl é elevada, o
muco é mais espesso e as trocas gasosas são mais difíceis (eficiência grandemente
reduzida).
Existe um trocador Cl-/CO3-. Sendo a CFTR um canal de Cl-, se esta proteína não
estiver a funcionar correctamente (mutada), não há exportação deste anião. Não ocorre
saída de cloreto, logo os gradientes de Cl- e Na+ ficam alterados (no muco). A capacidade
bactericida do muco é diminuída.
Antiporta H+/Na+:
Antiporta Cl-/HCO3-:
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A actividade destes três transportadores
(Co-transportador Na+ HCO3-/Cl-, Antiporta H+/Na+
e Antiporta Cl-/ HCO3-) depende do pH do meio. As
células encontram-se assim equipadas com
mecanismos bastante eficientes para regular o seu
pH.
O seu nome deriva do facto de ser a terceira banda a aparecer num gel de um
eritrócito.
Existe nos eritrócitos, mas também nas células parietais do estômago.
É um transportador essencial ao nosso organismo, pois permite o eficiente
transporte de CO2 pelos eritrócitos.
Este transportador promove um antiporta electroneutro, com saída e entrada de
1 anião monovalente, mas é também capaz de efectuar a reacção inversa, dependendo a
direcção do transporte apenas do gradiente de concentração.
a) Capilares Sistémicos:
b) Capilares Pulmonares:
O estômago dos mamíferos contém uma solução 0,1 M de ácido clorídrico (HCl).
Este ácido elimina muitas bactérias ingeridas e desnatura proteínas, que depois vão ser
degradadas por enzimas proteolíticas actuantes a pH ácido (Ex. Pepsina).
As células parietais têm como função secretar HCl para o lúmen do estômago,
tornando-o ácido, pois as enzimas que aqui actuam, só funcionam neste pH. No entanto,
o pH destas células dever ser mantido em valores fisiológicos.
O transporte de K+ é cíclico, uma vez que ele é transportado para o citosol, pela
ATPase, saindo de novo para o lúmen, pelos canais proteicos. Assim, o K+ entra para o
citosol por troca com H+ (ATPase), que sai para o lúmen. No entanto o Cl- que entra no
citosol (por troca com HCO3-) volta a sair, saindo também um K+ (pelo canal proteico)
para compensar as cargas, mantendo-se a electroneutralidade.
O pH do interior mantém-se constante, porque saem iões H+, mas também
grupos OH- (CO2 + OH- HCO3- , por acção da anidrase carbónica). Se estes últimos
não saíssem, o pH tornar-se-ia básico. Daí a importância do antiporta Cl-/HCO3-.
Assim, a combinação dos diferentes transportes, com a acção da anidrase
carbónica, permite acidificar o lúmen do estômago, mantendo o pH das células parietais
electroneutro.
Inibidores Cardiotónicos:
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Concentrações elevadas deste ião (no citosol) promovem um aumento da força
de contracção muscular.
Devido à acumulação de cargas positivas no interior celular, o potencial eléctrico
ao longo da membrana diminui e o Cl- extracelular entra (em condições normais o
potencial eléctrico sobrepõem-se à sua entrada, mas neste caso essa barreira é desfeita).
Com a entrada destes iões, a concentração iónica intracelular é elevada e a água tende a
entrar para contra-balançar a osmolaridade. Por esta razão as células que revestem os
vasos sanguíneos aumentam de volume e consequentemente dá-se um aumento da
pressão arterial. Os glicosídeos são, por este motivo, utilizados com agentes terapêuticos
em casos de insuficiência cardíaca. No entanto podem funcionar como um veneno em
casos de hipertensão (elevados níveis de glicosídeos).
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Em E. coli a lactose é acumulada no interior através de uma permease Lactose/
+
H simporta, constituída por 12 α-hélices transmembranares, que formam um canal
central, permitindo a passagem de H+ e lactose. Ocorre um influxo (entrada) de H+
segundo um gradiente de concentração acoplado ao transporte de lactose na mesma
direcção. Trata-se de um transporte activo secundário.
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Contrariamente, em bactérias alguns nutrientes são modificados enquanto se
processa o transporte para o interior (da bactéria) por um processo denominado
translocação de grupo.
Outra diferença que se verifica neste tipo de transporte é a utilização de PEP
(Fosfo-enol-piruvato) em vez de ATP como molécula dadora de grupo fosforil. Isto
justifica-se porque a ΔG resultante da hidrólise desta molécula é maior, favorecendo a
ocorrência de reacções mais endotérmicas em simultâneo, e, porque o PEP é um
intermediário do catabolismo da glicose a piruvato, podendo tornar-se um ponto de
regulação.
Este sistema para além das funções de transporte tem também funções
reguladoras. De facto a abundância de açúcares acumulados por este sistema (PTS –
Phosphotransferase System) vai inibir outros sistemas de transporte activo de açúcares.
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gradiente electroquímico de H+, sendo este utilizado para sintetizar ATP ou para
transportar substâncias para o interior celular.
É composta por 7 α-hélices transmembranares. Possui um grupo retinal
(cromóforo fotossensível envolvido no processo de absorção de luz) localizado na zona
mediana interior da proteína, rodeado pelas 7 hélices. Este grupo está ligado a uma lisina
da cadeia polipeptídica, através de uma Base de Shiff protonada. Quando o grupo retinal
absorve luz, sofre uma isomerização, passando de retinal all-trans (protonado) para
retinal 13-cis (desprotonado), libertando-se um H+ para o meio extracelular. Esta forma
(retinal 13-cis) volta a receber um protão do citoplasma, regressando ao isómero inicial
(por cada ciclo de isomerização é libertado um H+).
Resumindo:
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transporte, sendo todas as outras proteínas membranares excluídas da vesícula
endocitada.
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As partes esféricas fundem-se com
lisossomas, onde a apoproteína-B é degradada
em aminoácidos, e os ésteres de colesterol
hidrolisados a colesterol e ácidos gordos. Os
receptores de LDL retornam à superfície
celular. O colesterol é incorporado na
membrana plasmática ou re-esterificado e
armazenado como lípido dentro da célula, para
uso posterior. Os ácidos gordos são utilizados
para fabricar fosfolípidos e triglicerídeos.
Hipercolesterolémia Familiar:
Caracteriza-se por:
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- O receptor está distribuído uniformemente na membrana plasmática, não
estando presente em grande quantidade nos poços.
Nos heterozigóticos:
Sinalização Celular:
Em organismos multicelulares, nenhuma célula é capaz de viver isolada. A
sobrevivência depende de uma complexa rede de comunicações intercelular que coordena
o crescimento, diferenciação e metabolismo das células dos diversos tecidos e órgãos.
É frequente que, em pequenos grupos de células, estas comuniquem por
contacto directo célula-a-célula. Algumas recorrem a junções especializadas da membrana
plasmática que lhes permite a passagem de pequenas moléculas e a coordenação de
respostas metabólicas. Outras junções entre células adjacentes determinam a forma e a
rigidez de determinado tecido.
Entre diferentes tipos de células, a comunicação dá-se quando uma certa
proteína de uma célula se liga a uma proteína receptora, na superfície de outra célula,
desencadeando a sua diferenciação. Este processo é essencial para a organização de novos
tecidos.
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O processo de sinalização envolve normalmente 6 passos:
(a) Endócrina;
(b) Parácrina;
(c) Autócrina;
(d) Sinalização directa por proteínas ligadas à membrana plasmática.
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(c) Sinalização Autócrina:
As hormonas:
Especificidade do receptor:
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O receptor tem alta afinidade pelo ligando (1º mensageiro) e a ligação entre eles
desencadeia uma resposta celular, determinada pelo tipo de receptor (especificidade
efectora) e pelas reacções desencadeadas pela ligação do complexo ligando-receptor.
A ligação do ligando ao seu receptor específico causa uma alteração conformacional
no receptor que é activado, sendo responsável por iniciar um programa molecular que leva
à resposta celular específica. Assim, a resposta celular a uma hormona específica é
determinada por:
1. Tipo de receptor;
2. Reacções intracelulares iniciadas pelo complexo L – R.
Exemplo: Acetilcolina
A acetilcolina liga-se a:
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Explicação do caso:
A activação quer dos receptores de epinefrina quer dos de glucagina nas células
hepáticas induz a síntese de cAMP (2º mensageiro), o qual regula uma dada resposta
metabólica.
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1. Hormonas lipofílicas com receptores intracelulares:
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As prostaglandinas só são conhecidas em animais, tendo as primeiras sido
descobertas por Ulf von Euler (Suécia) em 1930. Muitas hormonas desta família estão
envolvidas na sinalização Parácrina e Autócrina, degradando-se perto do local de síntese.
A prostaglandina endoperoxidase sintetase (PES) é uma enzima existente no retículo
endoplasmático, que vai actuar sobre o ácido araquidónico, convertendo-o em
prostaglandinas através uma dupla actividade enzimática, ciclooxigenase e peroxidase.
Receptores Superficiais:
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2. Receptores que são canais iónicos:
Estes receptores são referidos como “Superfamília dos Receptores das Citocinas”.
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Segundos Mensageiros:
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2. Proteínas cinases:
3. Proteínas adaptadoras:
Vias de sinalização:
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As proteínas cinases, têm um papel fundamental em todas as vias de sinalização,
visto que na fase final fosforilam uma ou mais proteínas substrato. Estas podem ser
enzimas, microtúbulos, histonas e factores de transcrição, e desempenham um papel
importante na determinação da resposta celular específica.
Regulação hormonal:
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Identificação e Purificação de Receptores de Superfície:
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Receptores associados a proteínas G e seus efectores:
A ligação do ligando ao receptor activa a proteína G que, por sua vez, activa ou
inibe uma enzima que produz um segundo mensageiro específico (nem sempre isso
acontece) ou modula um canal iónico.
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- Ligada a receptores α-adrenérgicos, das células do músculo liso que revestem os
vasos sanguíneos no aparelho intestinal, na pele e nos rins, provoca vasoconstrição das
artérias, cortando a circulação para órgãos periféricos.
Agonistas e Antagonistas:
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Curiosamente, a constante de dissociação (KD) do agonista de epinefrina, o
isoproterenol, para os receptores β-adrenérgicos é 10 mais baixa do que o KD para a
epinefrina, com consequente indução da síntese de AMPc.
Tenhamos em conta:
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receptores β e α é ainda menor. Conclui-se que será a sequência de aminoácidos que
determina a especificidade da ligação ao ligando e que tipo de proteína G interage.
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2. O receptor activado liga-se à subunidade Gα;
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Amplificação do Sinal Hormonal:
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Os níveis de c-AMP aumentam cerca de 100x. Este aumento, ao nível das células
epiteliáis do intestino, leva a que certas proteínas permitam o fluxo massivo de água do
sangue para o lúmen do intestino, dando-se uma elevada perda de água (desidratação)
por diarreia.
A toxina Pertussis é secretada pela bactéria Bordetella pertussis e afecta o tracto
respiratório, provocando tosse convulsa. Esta toxina tem uma subunidade S1, que cataliza
a adição de ADP-ribose à subunidade Giα (de inibição), no estado GDP-ligado. Assim Giα
deixa de inibir a adenilato ciclase, podendo esta produzir uma grande quantidade de AMPc.
O aumento continuado da produção deste segundo mensageiro leva à perda de
fluidos e electrólitos no muco nasal.
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Estrutura química e funcionamento das proteínas G triméricas:
Pode ainda acontecer que, em vez de Gα, seja Gβγ a regular a actividade em
algumas isoformas de adenilato ciclase. Neste caso, admite-se que o local de ligação com a
adenilato ciclase seja diferente dos locais utilizados pela Gi e a Gs.
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as células mesmo na ausência do factor de crescimento, originando proliferação
descontrolada de certos cancros da mama.
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As proteínas Ras mutadas estão associadas a vários tipos de cancro humano.
Ligam GTP, mas não o conseguem hidrolisar, ficando permanentemente no estado activo
(“on”) e causando a transformação neoplásica.
A GRB2 funciona como uma proteína adaptadora para o receptor de EGF (factor
de crescimento).
A Sos funciona como uma GEF, que ajuda a converter Ras-GDP (inactiva) para a
forma Ras-GTP (activa).
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A análise de mutantes (relativamente aos olhos) de Drosophila melanogaster,
bloqueados num determinado estádio de diferenciação, forneceu informação importante
acerca das vias de sinalização por RTKs.
O olho destes insectos tem 800 omatídios (olhos individuais), e cada um deles
possui 22 células, das quais 8 são neurónios fotossensíveis (retínulas ou células R). Um
RTK destas células é o Sev (sevenless), que regula especificamente o desenvolvimento da
célula R7. A observação de omatídios através de uma técnica especial permite-nos
distinguir os fotorreceptores. Cada omatídio do tipo selvagem apresenta 7 fotorreceptores,
já os mutantes possuem apenas 6, não têm o R7 (responsável pela observação da luz
ultravioleta).
Na superfície da célula R8 expressa-se a proteína Boss, que, ligada à membrana,
sinaliza o RTK Sev da célula vizinha percursora de R7, induzindo produção de um neurónio
fotossensível. Mutantes sem Sev RTK funcional (mutante sev- forma recessiva) não
induzem a formação destes neurónios, pois a proteína Boss não estabelece o contacto com
a célula precursora de R7. Se tivermos um duplo mutante (sev- e RasD), a proteína Ras
mantém-se continuamente activa e produz-se o neurónio.
Além da via Sev RTK, estas três proteínas também aparecem em outras vias de
transdução de RTK, utilizadas em tempos e locais diferentes do desenvolvimento das
moscas.
Existem outros resíduos sem prolina que também têm um papel importante na
especificidade da ligação.
Ligação RasGDP-Sos:
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3. A RasGTP ao produzir uma conformação específica dos “Switchs” (I e II) activa
moléculas efectoras.
Todas os RTKs parecem usar uma via geral em que o sinal induzido por ligação
ao ligando é comunicado através de GRB2 e Sos, sendo activada a via de transducção de
sinal. A Ras induz uma cascata de cinases que finaliza na activação de uma MAP cinase.
Existem duas proteínas que não foram referidas que podem ainda participar na
cascata MAP cinase a partir da Ras, a 14-3-3 e a Ksr:
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- A Ksr contêm locais de ligação para a Raf, 14-3-3, MEK e MAP cinase. Portanto,
mesmo depois da dissociação da ligação Raf – RasGDP, a Ksr fornece uma base de ligção
para manter funcional o grande complexo de sinalização.
A MAP cinase tem um local catalítico Lip (lábio de fosforilação), que altera a sua
conformação. Quando a MEK liga à MAP cinase:
Nas leveduras, esta via é independente de RTKs, uma vez que estes não existem
nestes organismos, a via MAP cinase está associada a receptores GPCRs.
Por acção das diferentes vias MAP cinase obtêm-se diferentes respostas celulares:
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Especificidade das vias MAP cinase:
As cascatas das MAP cinases podem possuir proteínas em comum. Por exemplo,
Ste11, esta proteína é comum à sinalização que conduz a respostas celulares de
conjugação, proliferação de hifas e osmorregulação. Todo o complexo enzimático confere
especificidade a cada uma das vias de sinalização.
Exemplo: Osmorregulação
Uma MAP cinase pode substituir outra que esteja ausente. Por exemplo, um
mutante “Sem Fus3” tem a capacidade de induzir conjugação apesar da sua ausência, a
cascata ocorre normalmente, sendo Fus3 substituído por Kss1 (actua na formação de
hifas). Esta é mobilizada para o local onde iria actuar o Fus3, sendo capaz de promover
factores de conjugação, pelos quais não teria afinidade. Para o mutante “Fus3 morta”, há
produção de Fus3 mas inactivo, este liga-se na mesma a Ste5 (impedindo a substituição
por Kss1), levando ao bloqueamento da via de sinalização e consequentemente à não
ocorrência de conjugação.
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