UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE

SAN MARCOS
Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA

FACULTAD DE INGENIERÍA GEOLÓGICA, MINERA, METALÚRGICA Y

GEOGRÁFICA.
EAP INGENIERÍA AMBIENTAL
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL Y BIOCTENOLOGIA DE LA
F.C.B

CULTIVO DE MICROORGANISMOS,
PRÁCTICA #04
MÉTODOS DE SIEMBRA.

 AUTORES:
BALDERA OLIVOS LILIANA ESTEFANY 17160300
GUTIERREZ AQUISE ROXANA 17160316
RODRIGUEZ LAUREANO FERNANDO 17160308

 PROFESOR: Mg. TITO LIBIO SÁNCHEZ ROJAS

 FECHA DE REALIZACIÓN DEL INFORME: 03/09/ 2018
 FECHA DE ENTREGA DEL INFORME: 10 /09/2018

2018
 I. INTRODUCCIÓN
En la naturaleza encontramos diversos tipos de microorganismos, algunos de estos
se encuentran en ambientes de elevadas temperaturas, otros en lugares fríos. Sin
embargo, también se han encontrado lugares donde no se ha demostrado la
presencia de los mismos, como los volcanes en ebullición.
En el presente informe desarrollaremos los distintos métodos de siembra en medios
nutritivos naturales o artificiales, para poder aislar un tipo de microorganismo
específico de una fuente natural o también llamado cultivo monoxénico.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

Aislamiento de microorganismos
En la naturaleza (muestras ambientales), existen muchos organismos diferentes, incluyendo
los microorganismos, quienes viven juntos como una población mixta (que tiene más de una
clase de microorganismo) en la que cada uno contribuye a numerosas actividades y proceso
en su medio ambiente. En el laboratorio, si se quiere estudiar las funciones de un
microorganismo en particular, hay que aislar al microorganismo, es decir, separarlo del resto
de la población acompañante para de esa manera obtener un cultivo puro.

Para aislar un microorganismo en laboratorio, primero se debe inocular en materiales

nutritivos denominados medios de cultivo. Inocular significa adicionar microorganismos
(inóculo) al medio de cultivo. Estos microorganismos pueden proceder de diversas muestras
(ambientales o biológicas) o de otro cultivo.

Cultivos puros
En primer lugar, el recipiente de cultivo debe estar inicialmente estéril (libre de
microorganismos vivos). Si se inocula una muestra en un medio de cultivo sólido en una placa
Petri se podrá obtener un cultivo puro, es decir un cultivo que contiene una única clase de
microorganismo. En un cultivo puro la población de microorganismos desciende una sola
célula. Se estima que solamente el 1% de los procariontes pueden ser cultivados in vitro, entre
los cuales se encuentra la mayoría de los microorganismos de importancia clínica.La vasta
mayoría de microorganismos ambientales no son cultivables.

Técnicas asépticas de siembra

Para evitar la presencia de microorganismos contaminantes en un cultivo, se requiere
practicar las técnicas asépticas, que consisten en realizar una serie de pasos para prevenir la
contaminación durante la manipulación de cultivos y de medios de cultivo estériles. La fuente
primaria de contaminación externa es la atmosfera, que siempre contiene microorganismos
en suspensión, es por ello que las placas Petri, las pipetas, micropipetas, los tubos de ensayo
u otros recipientes, deben ser manipulados de tal manera que no entre aire contaminante en
ellos. Es indispensable que los estudiantes adquieran destreza en las técnicas asépticas para
ser exitosos en el laboratorio de microbiología porque no solo protege al cultivo del ingreso de
contaminantes sino también protege al personal y al medio ambiente de la contaminación.
Obtención de cultivo puro a partir de las placas de aislamiento
primario
La población microbiana existente en nuestro entorno es grande y compleja. Cientos de
especies microbianas habitan normalmente en distintos hábitats. Para estudiar
ordenadamente a estos microorganismos es necesario aislarlos y mantenerlos en cultivo puro.
Un cultivo puro consta de una población de células derivadas todas ellas de una célula
parental.

Es necesario obtener un cultivo puro a partir de una placa de aislamiento primario, que
suele ser un cultivo mixto. En algunas ocasiones es fácil seleccionar las colonias aisladas
para su subcultivo (volver a sembrar la colonia previamente aislada a partir de una muestra),
pero en otras pueden presentarse muy amontonadas de tal manera que es difícil elegir
colonias individuales aisladas.

Estrategias de aislamiento de cepas microbianas

El subcultivo directo, que consiste en tocar con cuidado la superficie de la colonia deseada
con el asa de siembra en punta o en aro (en punta si las colonias están muy cercanas entre
sí) y estriar una nueva placa para el aislamiento.

El uso de medios selectivos, que consiste en subcultivar la colonia de interés sobre un agar
que inhibirá el crecimiento de las colonias no deseadas; por ejemplo, subcultivar un bacilo
gramnegativo sobre un agar MacConkey para separarlo de cocos grampositivos.

El uso de sustancias químicas inhibitorias incorporadas dentro del agar (análogo a un medio
selectivo), que consiste en subcultivar la colonia de interés sobre un agar que contenga
antibióticos o sustancias químicas que inhibirán el crecimiento de las colonias no deseadas.

Mantenimiento y conservación de cepas

En muchas situaciones en un laboratorio de microbiología es importante conservar con
viabilidad durante un periodo de tiempo las cepas microbianos aisladas sobre todo en los
laboratorios en los que se hacen trabajos de investigación .Se denomina cepario a la colección
de cultivos de un laboratorio o de una institución.

Los cultivos de microorganismos con determinadas características son esenciales para la

mayoría de los ensayos microbiológicos. Los cultivos de referencia o controles de alta calidad
son utilizados en un amplio número de determinaciones. Por toda una colección de cultivos
bien mantenida es un requisito indispensable para las buenas prácticas del laboratorio. Los
microorganismos tienen una tendencia inherente a mutar cuando se les subcultiva con
frecuencia. La conservación está encaminada al mantenimiento de las cepas durante largos
periodos de tiempo sin que se produzcan cambios en estas.

Hay varios métodos para conservar microorganismos dependiendo del tiempo que se les
desea mantener viables y sus características fisiológicas. Se tienen métodos a largo plazo,
métodos a corto plazo y métodos alternativos.
Métodos de conservación a largo plazo
 Conservación por congelación
Se congelan las células en suspensión en un líquido o caldo de cultivo crecido joven con un
agente crioprotector(50% de glicerol para congelar a -20oC y al 14-20% para congelar a -70
o 80oC). Los críoprotectores más usados son el glicerol y el dimetilsulfóxido (DMSO).
Mediante este método las células no disponen de agua en forma líquida, por tanto no hay
crecimiento. Cuando se quiere trabajar con las células así conservadas, se recuperan
subiendo la temperatura. Este es el mejor método de conservación desde todos los puntos de
vista, la viabilidad de los microrganismos es de varios años. Las desventajas son la de requerir
congeladores que sean costosos y el riesgo de que haya algún fallo del sistema eléctrico que
produzca una subida no deseada de la temperatura durante el almacenamiento.

 Conservación por liofilización

La liofilización consiste en la eliminación del agua de una sustancia congelada por sublimación
del hielo al vacío. Este proceso consta de tres etapas, la pre congelación del producto para
asegurar una estructura completamente congelada; el secado primario con el que se elimina
la mayor parte del agua por sublimación; y el secado segundario con el que se remueve el
agua que queda ligada. En las células conservadas por este método no hay crecimiento
puesto que la actividad agua es cero igual que en la congelación pero a diferencia de la
primera, los aparatos denominados liofilizadores. Este es un método muy recomendable por
su comodidad en el almacenamiento, pues una vez liofilizadas las cepas, estas se pueden
almacenar a una temperatura ambiente de 18 oC-20oC o bien en refrigeración a 4 oC-6oC.

El éxito de la liofilización para la preservación de los microorganismos no solo depende de los

pasos de esta técnica (congelación y deshidratación) sino también de las características
fisicoquímicas del medio de suspensión, el tipo de microorganismo, el estado fisiológico del
cultivo, las condiciones de cultivo, la concentración de microorganismos, entre otros.

Métodos de conservación a corto plazo

Son los que se utilizan cuando no se requiere la viabilidad por mucho tiempo o cuando no se
puede emplear los métodos anteriores por falta de los equipos necesarios o porque la cepa
microbiana no resiste dichos tratamientos. Conviene tener en cuenta que nunca se debe usar
un único método de conservación, sino varios.

 Conservación por transferencia periódica o subcultivos

La cepa microbiana se guarda en forma de cultivo activo en un medio adecuado como, por
ejemplo, el TSA o el Agar sangre bifásico. Los medios para conservación de cepas no deben
tener carbohidratos. El medio se dispone en tubos con tapa de rosca en plano inclinado. El
método consiste en la transferencia del cultivo a un medio fresco a intervalos que aseguren la
viabilidad del mismo. Estos intervalos varían dependiendo de las características del
microorganismo en cuestión. Algunas especies requieren ser transferidas a nuevos medios
después de días o semanas (como las bacterias nutricionalmente exigentes), y otras después
de meses o años (como los hongos filamentosos). Esta frecuencia puede reducirse con el
almacenamiento del subcultivo a temperaturas relativamente bajas, en un refrigerador a 4 °C.
Otra manera de conservar las cepas por varios meses en el caso de bacterias es
sembrándolas en viales con medio de cultivo semisólido (con agar al 0,5%). La siembra se
realiza haciendo varias punturas en profundidad en la columna del medio. Luego estos viales
se sellan herméticamente.
  Métodos alternativos de conservación
En este grupo se engloban métodos no empleados habitualmente, pero a los que es necesario
recurrir a la hora de conservar determinados grupos de microorganismos muy especiales que
no resisten bien la liofilización o la congelación.

Estos métodos se basan en la paralización del crecimiento y reducción drástica del

metabolismo por eliminación del agua disponible para las células mediante el secado. Estos
métodos de secado son particularmente útiles para conservar microorganismos productores
de esporas. Sin embargo, no todos los microorganismos sobreviven a estos métodos de
secado, por lo que se hace necesario añadir agentes protectores (leche descremada,
glutamato sódico al 10%). Una vez secos es importante mantener el producto sellado para
evitar el contacto con el aire ya que son higroscópicos. Estos métodos se diferencian en el
sustrato inerte que utilizan, así tenemos que existe la desecación en papel de filtro, desecación
en suelo, arena, sílicagel, desecación en bolitas de alginato y se desecación en sal para
halobacterias.

Métodos de siembra
 Método de siembra de la placa estriada o agotamiento por
estrías
Es el método más comúnmente utilizado para aislar bacterias. El procedimiento de estriado
para aislar microorganismos fue ideado por Loeffer y Gaffky en el laboratorio de Koch.
Implica la separación de bacterias física y espacialmente estriándolas sistemáticamente
sobre una superficie de agar en una placa Petri. Si una célula microbiana única se encuentra
un punto de la superficie del medio sólido esta se multiplicará hasta alcanzar una masa de
millones de células que forman una colonial, la cual puede verse fácilmente a simple vista.
Este método permite tener colonias aisladas en la placa.
El éxito en obtener colonias aisladas está en función de la cantidad y densidad (población
microbiana) del inóculo, lo cual a veces es difícil de juzgar, y de la manera de hacer el
estriado. La destreza en esta técnica se adquiere solo con la práctica. Hay varias maneras
de hacer un estriado la placa Petri: en uno, dos, tres, o cuatro cuadrantes.
Recomendamos este último porque es el que probablemente dará mejores resultados con
suspensiones que tengan un amplio rango en densidad microbiana.

Para el procedimiento del estriado se usa un asa de siembra en aro estéril o, en algunos
casos, un hisopo estéril para inocular el medio de cultivo. Se hace una ligera presión con el
asa en la superficie del medio y se procede a estriar como se observa en las ilustraciones.

En el primer cuadrante, debido a que se depositan muchos microorganismos, se observa

un crecimiento confluente, que es un crecimiento sobre todo en el área estriada. Sin
embargo, debido a que la asa es flameada antes de estriar cada uno de los siguientes
cuadrantes, cada vez se depositan menos microorganismos, resultando en el crecimiento de
colonias aisladas en el tercer o cuarto cuadrante dependiendo de la0 población microbiana
de la muestra.
 Figura 1. Método de siembra por estría en placa.

 Método de siembra por diseminación

Este método consiste en colocar 0,1 ml del inóculo en el centro de la placa de Petri con
medio de cultivo. Se extiende con espátula de Drigalsky hacia delante y atrás, mientras se
hace girar la placa, se tapa, se invierte la placa y se lleva a incubar.

Cuando se tiene un inóculo medio, y sabiendo que la colonia procede una sola célula, se
puede saber el número de colonias que pueden crecer sobre el medio cultivo, entonces se
habla de unidades formadoras de colonias (UFC).

 Método de siembra por incorporación

Esta técnica tiene la ventaja de permitir el cálculo de microorganismos presentes en la
muestra, si se trabaja con exactitud. Se coloca 1 ml de la muestra y a continuación se añade
el medio de cultivo fundido y atemperado (entre 45 a 50°C), mezclando por rotación suave
de la placa. De esta forma los microrganismos se distribuirán homogeneizándose en el
medio de cultivo, permitiendo el desarrollo de colonias separadas por todo el agar.

Las colonias aparecen distribuidas por toda la masa del agar. Aquella que está en la
superficie tendrá distintas características, dependiendo del tipo microbiano, mientras que las
colonias que se desarrollan en el interior, bajo la superficie del agar, tiene forma lenticular,
aunque los microorganismos que formen las distintas colonias sean de distinto tipo. Por
tanto, las colonias que aparecen en la profundidad del agar son siempre biconvexas y no
se diferencian unas de otras por su morfología. Aunque con esta técnica se obtiene colonias
aisladas, generalmente solo se utiliza para determinar el número de microorganismos
viables en una muestra cuando estos son anaeróbicos facultativos o microaerófilos.
 Figura 2. Método de siembra por incorporación.

 Método de siembra por puntura

Se utiliza un tubo de ensayo estéril que contenga un medio de cultivo semisólido, se usa
para determinar el comportamiento de los microorganismos en presencia oxígeno para
observar su crecimiento y movilidad, como para la preservación de los cultivos bacterianos
durante más tiempo.

En esta siembra, se procede de la siguiente manera:

1. Tomar un inóculo con el asa de siembra.

2. Introducir el inóculo en el tubo haciendo una punción en el centro del medio de cultivo
y en fondo se hace un giro de 180° para asegurar que la muestra quede en el medio.
3. Retirar la aguja con cuidado.
4. Flamear la boca del tubo, y taparlo.
5. Incubar a una temperatura de acuerdo al microorganismo que se quiere aislar por 24
a 48 horas.

 Método de siembra por puntura en placa

Se utiliza siembra para hongos filamentosos a partir del cultivo puro, el crecimiento se da
a partir del punto de siembra donde las hifas y las conidias que se desarrollarán con un
crecimiento en forma radial.

1. Picar la superficie de una colonia de hongos filamentoso

2. Tomar una caja Petri con medio de cultivo sólido, estéril y frío.
3. Sembrar con el asa de siembra mediante punción en el centro a la superficie de
cultivo.
4. Flamear el asa de siembra.
5. Tapar, incubar a una temperatura de acuerdo el microorganismo que se quiere aislar
por 24 a 48 horas.
III. DETALLES EXPERIMENTALES
Es obligatorio y de suma importancia que todo el procedimiento se realice en
condiciones de asepsia, es decir con la superficie de trabajo limpia y frente a un
mechero.

Siembra de Agotamiento por estrías

 Medio YPG- Pichya (levadura)

1. Flameamos el asa de siembra y esperamos que se enfrié un poco.

2. Cerca al mechero, quitamos el tapón al tubo con el cultivo de pychia.
3. Flameamos el borde del tubo e introducimos el asa de siembra del tubo con
cultivo, obteniendo un inóculo.
4. Colocamos el inóculo en uno de los extremos del medio de cultivo (YPG) que
se encuentra en la placa Petri.
5. Extendimos la muestra en forma continua, hasta una cuarta parte del medio.
6. Flameamos de nuevo
7. Enfriamos el asa de siembra y procedimos a hacer 4 estrías formando un
ángulo recto con el origen, no se debe chocar con ningún estriamiento.
8. Rotulamos correctamente la placa Petri
9. Incubamos la placa Petri invertida a una temperatura de 37 oC por 24 a 48
horas.

Figura 3. MedioYPG-Pichia-Método por estrías

 Siembra por diseminación

Se emplea este método, con el fin de adelgazar la muestra para que en la superficie
del agar queden las colonias separadas y para esparcir la muestra se utiliza una
espátula de Drigalsky, previamente esterilizada.

Figura 4. Espátula de Drigalsky.

 Medio Agar Nutritivo-Bacillus(Bacteria)

1. Inoculamos entre 0,1ml de muestra previamente homogenizada sobre la placa
Petri con el respectivo medio de cultivo.
2. Esterilizamos la espátula de Drigalsky, introduciéndola en alcohol y luego
pasarla por la llama.
3. Enfriamos la espátula pasándola por la tapa de la caja Petri.
4. Pasamos suavemente la espátula sobre la muestra, hasta que quede
completamente absorbida sobre la superficie del medio Agar Nutritivo.
5. Flameamos de nuevo la espátula y descartarla
6. Incubamos la placa Petri invertida a una temperatura de 37°C por 24 a 48
horas.

Figura 5. Medio Agar Nutritivo-

Bacillus-Método por diseminación
Siembra de cultivo en tubo con agar inclinado (Punción)
Se utiliza un tubo de ensayo estéril que contenga medio de cultivo semisólido, se usa
para determinar el comportamiento de los microorganismos en presencia de oxígeno,
para observar su crecimiento y movilidad, como para la preservación de los cultivos
bacterianos durante más tiempo.

 Medio YPG-Trichoderma (Hongo)

1. Tomamos el tubo de ensayo estéril con el agar inclinado de manera que el bisel
o pico de flauta quede al frente destapándose del modo ya explicado
anteriormente.
2. Introducimos el asa de siembra mediante punción en el medio contenido en la
parte inferior del tubo.
3. Retiramos el asa de siembra con cuidado.
4. Flameamos la boca del tubo, y taparlo.
5. Incubamos la placa Petri a una temperatura de 37°C por 24-48 horas.

Figura 6. Medio YPG-Bacillus-Método por punción.

Inocular de un medio de cultivo en caldo a otro caldo

 Medio YPG-Pichia (Levadura)

1. Rotulamos cada uno de los tubos con la fecha, medio de cultivo y nombre de
la cepa.
2. Realizamos las siembras cerca al mechero.
3. Flameamos el asa de siembra y quitamos los tapones a los tubos con cultivo y
a los que contienen el caldo que será incubado, evitando el contacto con la
llama.
4. Flameamos los bordes de ambos tubos e introducir el asa dentro del tubo con
cultivo, obteniendo un inóculo.
5. Introducimos y sumergimos el inóculo dentro del tubo con el medio de caldo de
cultivo estéril (siembra).
6. Sacamos el asa y la pasamos por las paredes internas del tubo para eliminar
cualquier exceso de inóculo.
7. Flameamos de nuevo los bordes de los tubos, colocándoles los tapones o tapas
a los mismos.
8. Flameamos el asa.
 9. Incubamos la placa Petri invertida a una temperatura de 37°C por 24 a 48
horas.

Figura 7. Medio YPG-Pichia-Método de cultivo en

caldo a otro caldo.

IV. RESULTADOS

MEDIO DE
MÉTODO DE SIEMBRA MICROORGANISMO CULTIVO

INOCULAR DE UN MEDIO DE CULTIVO Pichia (Levadura) Medio YPG

EN CALDO A OTRO CALDO

SIEMBRA DE CULTIVO EN TUBO CON Medio YPG

AGAR INCLINADO (PUNCIÓN) Trichoderma (Hongo)

Medio Agar
SIEMBRA POR DISEMINACIÓN Bacillus(Bacteria) Nutritivo

Pichia (levadura)
Medio YPG
SIEMBRA DE AGOTAMIENTO POR
ESTRÍAS
Medio Kin B
Pseudomona(Bacteria)
 V. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
 Una vez que ya tenemos los medios de cultivo preparados, hay que inocularlos, y para
ello se necesita:
Medio de cultivo.
Condiciones óptimas de incubación como temperatura, pH, presión, condiciones
atmosféricas (concentración de O2). Estos medios de cultivo son sólidos (cultivos en
reposo), o líquidos (para cultivos en agitación)
 Se debe tener en cuenta el tiempo de incubación, para bacterias es de 24 a 48 horas
y para levaduras es hasta más de 48 horas.
 El método de siembra por puntura es el más indicado en cuanto a hongos, ya que más
adelante se pudo observar el crecimiento radial.
 Con respecto a la incubación de los microorganismos, para bacterias y levaduras la
placa Petri se voltea, en cambio para los hongos la placa Petri no se voltea.

VI. CONCLUSIONES
 Podemos concluir a partir de los conocimientos adquiridos en esta experiencia que los
procesos de desinfección, esterilización y demás son importantísimos en la
microbiología ya que son la puerta para la siembra y aislamiento de colonias de
microorganismos.
 Para realizar esta práctica tenemos que tener en cuenta que para cada
microorganismo existe un medio en particular donde está se puede desarrollar.
 El objetivo principal de esta práctica, adquirir habilidades necesarias para realizar las
principales técnicas de siembra, ha sido cumplido de forma exitosa.
 Para el método por estriamiento se necesita mucha técnica en cuanto a la
manipulación de la placa Petri y el asa de siembra en simultáneo.

VII. RECOMENDACIONES
 Se recomienda, antes de cualquier uso de laboratorio, utilizar los métodos de asepsia
con el fin de no contaminar las muestras.
 Se recomienda, al momento de hacer la respectiva siembra, no alejarse de la flama
que nos proporciona el mechero bunsen, con la finalidad de mantener la muestra
alejada y aislada de otros microorganismos.
 Se recomienda, en todo momento, utilizar guantes y mascarillas para no contaminar
la muestra.

VIII. CUESTIONARIO
1. ¿Existen otros tipos de cultivo aparte del monoxenico, de acuerdo al número de
microorganismos?
De acuerdo al número de microorganismos existen:
a) Cultivo Axénico: Cultivo de una sola especie no contaminado ni asociado
con algún otro organismo viviente.
b) Cultivo Monoxénico: Cultivo que contiene una especie que crece en
presencia de otra especie.
c) Cultivo mixto: Existen muchas y diferentes especies de forma conjunta.
 2. ¿Cuáles son otros tipos de Crioprotectores?
El método de siembra utilizado dependerá del organismo que se quiere aislar, por
ejemplo si se quiere aislar bacterias, se utiliza mayormente el método de siembra de
placa estriada. Si se quiere cultivar hongos utilizará el método de siembra por puntura
en placa, donde se utiliza un tubo de ensayo estéril con medio de cultivo semisólido.

3. ¿Qué criterios se utilizan para los diferentes tipos de siembra?

Al realizar una siembra de microorganismos, debemos tener en cuenta que técnica se

va utilizar, debido a que estas varían respecto a las características del microorganismo
a tratar. También debe tenerse en cuenta la forma, espacio y el objetivo al que
se quiere llegar, pues dependiendo de esto la técnica de siembra es diferente. Un
microorganismo se puede sembrar en un medio líquido o en la superficie de un medio
sólido de agar .Un cultivo de bacterias o de hongos es con el fin de aislarlas en el
medio para lograr un mejor estudio de ellos.

IX. BIBLIOGRAFÍA
 United States Department of Agriculture (National Agriculture Library)
 Pérez, María.2004.Laboratorio Microbiología General.1ra edición. Universidad
Autónoma Metropolitana.México.pp.36-40
 Montoya, I.O. (1999).Manual de Microbiología. Universidad Nacional de Colombia.