MÉTODOS INMUNOQUÍMICOS

XIOMARA ALEJANDRA ACUÑA ANTELIZ.

MARIA ALEXANDRA MOLINA MENDEZ.
KAREN DAYAN GARCIA MARTINEZ.
DAHIAN CATHERINE HERMIDA SUÁREZ.

GRUPO B

Dr. CRISTOBAL ZAMBRANO PARADA. Bact.

UNIVERSIDAD DE PAMPLONA.
FACULTAD DE SALUD.
TERCER SEMESTRE.
2018
 Introducción

Existe una amplia variedad de técnicas en la inmunología que sirve para identificar antígenos y
anticuerpos específicos por medio de su interacción, detectar células inmunocompetentes y
evaluar la inmunidad celular. Los métodos más útiles son los que se van a basar en la
especificidad con la que se une un antígeno a un anticuerpo que son los métodos
inmunoquímicos, la especificidad de esta unión se puede observar en fenómenos de
precipitación, aglutinación y otros mecanismos que son indirectos que hacen que estos
métodos se puedan utilizar ampliamente. Gracias a que los antígenos y anticuerpos se definen
por sus interacciones mutuas, uno de ellos puede ser utilizado para cuantificar al otro. Así
tenemos técnicas de aglutinación que son Cuando los antígenos se encuentran unidos o
formando parte de células, bacterias o partículas, la reacción Ag-Ac se puede detectar y
cuantificar por el aglutinado celular o bacteriano formado; Técnicas de fluorescencia y
citometría de flujo, para la realización de estas técnicas el anticuerpo se marca con un
fluorocromo detectándose la formación del complejo Ag-Ac por la fluorescencia emitida;
Técnicas de radioinmunoensayo, en estas técnicas al anticuerpo se une un isótopo radiactivo
siendo posible la cuantificación del complejo Ag-Ac a través de la radiactividad emitida y
técnicas como la cromatografía de afinidad que miden la especificidad de la unión Ag-Ac puede
utilizarse para obtener Acs y Ags puros.
(Roberto P. Stock Silberman, 2007)

TABLA DE CONTENIDO.
Introducción
1. glosario
2. Inmunoanálisis
3. .Inmunoanálisis con reactivos no marcados
3.1. Reacción de precipitación en medio líquido
a) Precipitación en tubo
b) Floculación
c) Turbidimetría
d) Nefelometría
3.1.1. Reacción de precipitación en gel
a) Inmunodifusión doble
b) Inmunodifusión radial
c) Inmunoelectroforesis
d) Inmunofijación
e) Contrainmunoelectroforesis
f) “Rocket” inmunoelectroforesis
g) Inmunoelectroforesis cruzada o bidimensional de Laurell
3.1.2. Reacción de aglutinación
a) Aglutinación directa
b) Aglutinación indirecta
c) Aglutinación pasiva
3.1.3. Reacción con participación del complemento
a) Fijación del complemento
b) Actividad hemolítica del complemento
3.2. Inmunoanálisis con reactivos marcados
3.2.1. Inmunoanálisis fluorescente
a) Microscopía inmunofluorescente
b) Inmunoanálisis de fluorescencia polarizada
c) Inmunoanálisis de fluorescencia unida a enzima
d) Citometría de flujo
3.2.2. Enzimainmunoanálisis (EIA)
a) EIA homogéneo
b) EIA heterogéneo
c) Electroinmunotransferencia o “Western blot” o “Immunoblotting”
3.2.3. Radioinmunoanálisis (RIA)
a) RIA en fase soluble
b) RIA en fase sólida
c) Detección inmunorradiométrica para antígeno
3.2.4. Quimiluminiscencia
3.2.5. Bioluminiscencia
3. conclusión.
4. bibliografía.
 1. Glosario de términos.

1. Reacción de Precipitación: Dependiente de la relación molar Ag y Ac.

2. Floculación: Es una reacción de precipitación anómala, donde la precipitación se observa
solamente en un rango muy estrecho de la proporción Ag/Ac
3. La turbidimetría y nefelometría: Determina niveles de antígeno o de anticuerpo en baja
concentración, formando pequeños agregados que producen una turbidez.
4. Inmunodifusión doble: Detección de antígenos o anticuerpos en una muestra biológica,
proceso estándar para la detección de Antígenos Nucleares
5. inmunodifusión radial: Es una técnica de análisis inmunológico de tipo cuantitativo. Se
utiliza para detectar la cantidad de anticuerpos IgG, IgM e IgA que hay en el suero de un
individuo
6. Inmunoelectroforesis: Consiste en la separación y caracterización de proteína
7. Inmunofijación: Es un análisis de sangre clínico que se utiliza para identificar proteínas o
anticuerpos en suero
8. La electroinmunotransferencia: combina la electroforesis en gel SDS-poliacrilaminada y
el enzimainmunoanálisis.
9. El radioinmunoanálisis (RIA):Utiliza antígeno o anticuerpo, generalmente marcados con
isótopos como 125
10. Inmunoanálisis quimiluminiscente: Que utiliza la emisión de luz producida
en ciertas reacciones químicas de oxidación, como por ejemplo, la oxidación del luminol
11. Inmunoanálisis bioluminiscente: Sistema natural la D-luciferina/luciferasa, en que la
luciferasa cataliza la oxidación de la D-luciferina en presencia de ATP y Mg+2 a
oxiluciferina, con emisión de luz a 546 nm.
 2. Imnunoanalisis.

Los inmunoanálisis son actualmente herramientas de amplio uso en los laboratorios para medir
diferentes analitos biológicos, como en la obtención de resultados sensibles y específicos. Los
inmunoanálisis pueden ser divididos en métodos que requieren: (Palomo , Ferreira , Sepulveda,
Rosemblatt, & Vegara , 2009)

Sistema Ag-Ac marcados: Reacciones inmunes primarias, como por ejemplo, inmunoanálisis
fluorescente y enzimainmunoanálisis
Sistema Ag-Ac no marcado: Se basan en reacciones inmunes secundarias, como por
ejemplo, precipitación y aglutinación.
Tabla numero 1: (Palomo , Ferreira , Sepulveda, Rosemblatt, & Vegara , 2009) P.g 641

Figura Nº1: Inmunoanalisis disponible en; https://www.delfi.lt/mokslas/mokslas/lietuvos-islaidos-

mokslui-praejusiais-metais-0-79-procento-bvp.d?id=50570842

3. Inmunoanálisis con reactivos no marcados

La interacción de antígenos solubles macromoleculares (polivalentes) y anticuerpos específicos

llevan a la formación de complejos (Ag-Ac) con relación variable de Ag o de Ac, que
frecuentemente llegan a ser insolubles y precipitan en solución. (Palomo , Ferreira , Sepulveda,
Rosemblatt, & Vegara , 2009)

Reacción de precipitación que es

dependiente de la relación molar Ag
y Ac.

Figura Nº2: Reacción de precipitación, disponible en disponible en

http://mesa54dinmuno.blogspot.com.co/2009/04/reaccion-antigeno-anticuerpo.html
Inmunoanalisis con reactivos no marcados
Reacción de Precipitado 1. Floculación
En el medio liquido 2. Turbidimetria
3. Nefelometría
4. Precipitación de complejos inmunes
solubles
En el gel 1. Inmunodifusión doble
2. Inmunodifusión radial
3. Inmunoelectroforesis
4. Inmunofijación
5. Contrainmunoelectroforesis
Reacción de aglutinación 1. Aglutinación directa
2. Aglutinación indirecta
3. Aglutinación pasiva
Reacción con precipitación del 1. Fijación del complemento
complemento 2. Actividad hemolítica del complemento

Tabla de ejemplos de Inmunoanaliis con reactivos (Palomo , Ferreira , Sepulveda, Rosemblatt,

& Vegara , 2009)

La interacción de antígenos
particulados, como
microorganismo o células con sus
anticuerpos específicos producen
la reacción de aglutinación

Figura Nº3: Reacción de aglutinación disponible en http://reaccionantigeno-

anticuerpo.blogspot.com.co/2010/04/reaccion-antigeno-anticuerpo-la.html

3.1 Reacción de precipitación en medio líquido.

a) Precipitación en tubo. Es un procedimiento que no se usa corrientemente en el

laboratorio, pero que es necesario conocer para apreciar las características generales
de la reacción de anticuerpo con antígeno de alto peso molecular en medio líquido.
En forma práctica se realiza en:
● Una batería de tubos que contienen un volumen fijo de antisuero (concentración fija de
anticuerpo) a los que se les añade diferentes concentraciones de antígeno, midiendo la
proteína total del precipitado formado y detectando el excedente de Ac o de Ag en el
sobrenadante, una concentración definida de anticuerpos, la cantidad de complejo Ag-
Ac precipitado aumenta con la cantidad de antígeno añadido hasta un valor máximo,
que sobrepasándolo lleva a una disminución progresiva de la precipitación. Se produce
 precipitación de una cantidad máxima de anticuerpos por una cantidad óptima de
antígeno. (Palomo , Ferreira , Sepulveda, Rosemblatt, & Vegara , 2009)

Figura Nº:4 Curva de precipitación para un complejo específico Ag-Ac (Palomo , Ferreira ,
Sepulveda, Rosemblatt, & Vegara , 2009) P.g 642

En la curva de:
● Precipitación se encuentra una zona de exceso de anticuerpos
● el sobrenadante contiene anticuerpo libre
● una zona de exceso de antígeno, el sobrenadante contiene antígeno libre
● una zona de equivalencia o punto de equivalencia
el sobrenadante está libre de anticuerpo y antígeno libre. Es importante tener presente que
en las zonas de exceso de anticuerpos y de antígenos se detectan complejos inmunes
solubles. En la zona de exceso de antígeno los sobrenadantes contienen complejos
solubles de varias composiciones como Ag4 Ac3, Ag3 Ac2 y Ag2 Ac. En el extremo de esta
zona los complejos que principalmente se forman son Ag2 Ac que se atribuye a los dos
sitios activos o a la divalencia de la molécula de anticuerpo IgG. (Palomo , Ferreira ,
Sepulveda, Rosemblatt, & Vegara , 2009)

● De acuerdo a la teoría del enrejado de Heidelberger, Kendall y Marrack. Ellos

sugirieron que la precipitación puede ser consecuencia del crecimiento del agregado
antígeno-anticuerpo de tal manera que la molécula del antígeno se une a más de una
molécula de anticuerpo y cada molécula de anticuerpo se une a más de una de
antígeno en que participan activamente interacciones Fc-Fc, de manera que cuando el
agregado excede un volumen crítico, precipita espontáneamente El precipitado
formado puede disociarse y volver al equilibrio con adición de Ag fresco. Cuand se
produce un exceso suficiente se forman pequeños (Palomo , Ferreira , Sepulveda,

Rosemblatt, & Vegara , 2009)

Figura Nº5: Heidelberger disponible en: https://www.rrnursingschool.biz/immune-
response/history-of-immunology.html

b). Floculación. Es una reacción de precipitación anómala, donde la precipitación se

observa solamente en un rango muy estrecho de la proporción Ag/Ac. Los agregados
insolubles se forman en una relativa gran cantidad de Ag. Estas reacciones se dan sólo con
algunos antisueros, como por ejemplo, sueros de caballos antitoxina diftérica, antitoxina
tetánica y antitoxinas estreptocócicas y suero humano anti-tiroglobulina. (Palomo , Ferreira,
Sepulveda, Rosemblatt, & Vegara , 2009).

FiguraNº6: Floculacion disponible en:

https://es.slideshare.net/LabInmunoBUAPGConde/floculacin-48775329

C. Turbidimetría: La turbidimetría cuantifica la nubosidad o turbidez de una solución en que

reacciona el antígeno con el anticuerpo en baja concentración. (Palomo, Ferreira, Sepulveda,
Rosemblatt, & Vegara , 2009)

d) Nefelometría: La nefelometría es una técnica que permite determinar niveles de antígeno o

de anticuerpo en soluciones a muy baja concentración. (Palomo, Ferreira, Sepulveda,
Rosemblatt, & Vegara , 2009)

3.1.1. Reacción de precipitación en gel

Los métodos de precipitación en gel permiten detectar la presencia y/o concentración de

antígenos y/o anticuerpos presente, por la formación de bandas opacas de precipitado que
corresponden a complejos antígenos-anticuerpos en la zona de equivalencia (Palomo , Ferreira
, Sepulveda, Rosemblatt, & Vegara , 2009)

a) Inmunodifusión doble: Se basa en la difusión del Ag y el Ac en un medio semisólido

(gel de agar), formando bandas de precipitación donde los reactantes están en
proporciones equivalentes. (Palomo, Ferreira, Sepulveda, Rosemblatt, & Vegara, 2009)

Técnica: La técnica se basa en preparar un gel uniforme de agar en una placa Petri o
portaobjeto. En el agar se practica perforaciones de un diámetro y esquema previamente
establecidos. Las soluciones que contienen el antígeno y el anticuerpo se colocan en
perforaciones adyacentes y se deja difundir hasta formar líneas o bandas de precipitación. La
intensidad, nitidez y posición de estas bandas es dependiente de la concentración del Ag y Ac.
La inmunodifusión doble se utiliza para análisis de antígenos y anticuerpos. Permite determinar
la relación inmunoquímica entre dos antígenos a través de componentes idénticos o de
reactividad cruzada. Se distinguen tres patrones de reactividad:
 ➢ Reacción de identidad,
➢ De no identidad y
➢ De identidad parcial o cruzada
También, puede utilizarse para determinar mono especificidad de un antisuero y para conocer
el título de los anticuerpos. (Palomo , Ferreira , Sepulveda, Rosemblatt, & Vegara , 2009)

Figura Nº7: Inmunodifusion doble (Palomo , Ferreira , Sepulveda, Rosemblatt, & Vegara , 2009)
P.g 643

b) Inmunodifusion radial. La inmunodifusión radial es una técnica de precipitación en

gel, en que el agar se ha mezclado con un antisuero mono específico sobre un
portaobjeto o placa de Petri. Se hacen perforaciones cilíndricas que se llenan con
volúmenes fijos de soluciones de referencia de antígeno para el cual el antisuero es
específico y con soluciones o muestras problemas. La difusión del Ag en el agar
permite la formación de anillos de precipitación, cuya área es proporcional a la
concentración inicial del Ag. Al término de 16 a 48 horas de difusión en cámara.
(Palomo, Ferreira, Sepulveda, Rosemblatt, & Vegara , 2009)

Figura Nº8: Inmunodifusion radial, IgG Humana (Palomo , Ferreira , Sepulveda, Rosemblatt, &
Vegara , 2009)P.g 644

c) Inmunoelectroforesis. La inmunoelectroforesis (IEF) desarrollada por Grabar y

Williams, es una técnica cualitativa que permite la identificación de diferentes antígenos
en mezclas complejas, que pueden tener semejante movilidad electroforética y peso
molecular, pero diferentes determinantes antigénicos. Esta técnica se realiza en geles
de agar o agarosa y se distinguen dos etapas:
1) la solución de proteínas se somete a separación electroforética y
2) terminada la electroforesis, las proteínas son analizadas con antisueros poli o
mono específicos en el agar en un canal paralelo al eje de migración. Luego de
un período de difusión en cámara húmeda, se observan arcos de precipitación
cuyaforma y posición dependen de las característica inmunoquímicas y de la
concentración de cada antígeno. La IEF es de gran utilidad para el análisis e
 identificación de componentes monoclonales que caracterizan las
enfermedades asociadas con gammapatías monoclonales (Palomo , Ferreira ,
Sepulveda, Rosemblatt, & Vegara , 2009)

Figura Nº9: Electroforesis e inmunoelectroforersis del suero de un paciente con gammapatia

monoclonal IgG (Palomo , Ferreira , Sepulveda, Rosemblatt, & Vegara , 2009)P.g 645

d) Inmunofijación. La inmunofijación es un procedimiento que utiliza, en una primera

etapa, la electroforesis de proteína en gel de agarosa y luego, la inmunoprecipitación.
Sobre la placa de agarosa en que se han separado las proteínas por electroforesis se
aplican antisueros monoespecíficos y la presencia del antígeno complementario forma
complejos antígeno anticuerpo que precipitan. La inmunofijación y la
inmunoelectroforesis son técnicas complementarias en la identificación de una
gamapatía monoclonal. (Palomo , Ferreira , Sepulveda, Rosemblatt, & Vegara , 2009)

e) Contrainmunoelectroforesis. La contrainmunoelectroforesis se realiza en gel agar,

donde el pH del tampón de electroforesis permite que el anticuerpo de cargue
positivamente y el antígeno negativamente. La sensibilidad del método es
aproximadamente 20 veces mayor que la doble difusión. Actualmente el uso más
importante es en el diagnóstico de enfermedades infecciosas cuyos antígenos migran
hacia el polo positivo en el agar (Palomo , Ferreira , Sepulveda, Rosemblatt, & Vegara ,
2009)
Figura Nº10: Contrainmunoelectroforesis para la determinación del antígeno de superficie del
virus hepatitis B (Palomo , Ferreira , Sepulveda, Rosemblatt, & Vegara , 2009) P.g 646

f) “Rocket” Inmunoelectroforesis. El “rocket” inmunoelectroforesis es la combinación

de la electroforesis y la inmunodifusion radial que han proporcionado un método rápido
para medir concentración de antígenos. El Ag migra por electroforesis (aplicado en un
pequeño pozo) en un agar que contiene antisuero (anticuerpos en exceso). El tiempo
requerido para la precipitación es de aproximadamente 2 horas. La altura de la zona
de precipitación que tiene la forma de un “rocket” es proporcional a la concentración de
antígeno. El antígeno debe migrar hacia el polo positivo en la electroforesis, por tanto,
es conveniente para albúmina, transferrina y ceruloplasmina, pero para
inmunoglobulina es más conveniente la inmunodifusión radial.

Figura Nº11: "Rocket" inmunoelectroforesis para la determinación de albúmina humana.

(Palomo , Ferreira , Sepulveda, Rosemblatt, & Vegara , 2009) P.g 647

g) Inmunoelectroforesis cruzada o bidimensional de Laurell. La inmunoelectroforesis

cruzada requiere inicialmente la separación electroforética de una mezcla de antígeno
en una dirección perpendicular al fenómeno final de precipitación o de etapa “rocket”.
Esta es capaz de resolver mezcla de antígenos altamente complejas y cuantificar cada
uno de ellos
Por ejemplo, se ha utilizado para estimar el grado de conversión de tercer componente
del complementario (C3) a la forma inactivada C3c.

Figura Nº12: Inmunoelectroforesis cruzada o bidimensional de Laurell. (Palomo , Ferreira ,

Sepulveda, Rosemblatt, & Vegara , 2009) P.g 647

3.1.2. Reacción de aglutinación

Los antígenos particulados, como microorganismos y suspensiones celulares son
corrientemente aglutinados cuando se mezclan con sus antisueros. Los anticuerpos son
dirigidos contra determinantes antigénicos de superficie que permiten un adecuado
entrecruzamiento con el Ag particulado permitiendo la reacción de aglutinación. (Palomo ,
Ferreira , Sepulveda, Rosemblatt, & Vegara , 2009)
 a) Aglutinación directa. La aglutinación directa se utiliza cuando el antígeno particulado
posee suficientes determinantes antigénicos en su superficie permitiendo que el
antisuero (Ac) correspondiente produzca espontáneamente el fenómeno de
aglutinación. Se usa regularmente en la serotipificación bacteriana. (Palomo , Ferreira ,
Sepulveda, Rosemblatt, & Vegara , 2009)

b) Aglutinación indirecta. La aglutinación indirecta se utiliza para células que tienen un

número reducido de determinantes antigénicos o que existe una cantidad insuficiente
de anticuerpos que dificultan los procedimientos de aglutinación, para lo cual es
necesario disponer de otro reactivo que es el anticuerpo anti-inmunoglobulinas. Por
ejemplo, determinación del antígeno D (Rh) de los glóbulos rojos. (Palomo , Ferreira ,
Sepulveda, Rosemblatt, & Vegara , 2009)

Figura Nº13: Aglutinación directa e indirecta disponible

https://es.slideshare.net/LabInmunoBUAPGConde/grupos-sanguneos-47005952

c) Aglutinación pasiva. La aglutinación pasiva se utiliza para antígenos solubles que se

absorben en forma covalente a la superficie de las partículas. Se han usado partículas
como glóbulos rojos (hemaglutinacion pasiva) o polímeros sintéticos tal como el
poliestireno o un coloide mineral como la bentonita. La determinación del factor
reumatoídeo utiliza partículas de poliestireno de aproximadamente 0.20 a 0.25 μm de
diámetro recubiertas con gammaglobulina humana. La aglutinación es considerada
más sensible que la precipitación para detectar anticuerpos, debido básicamente a que
grandes partículas cubiertas con Ag sirven para amplificar la reacción. (Palomo ,
Ferreira , Sepulveda, Rosemblatt, & Vegara , 2009)

3.1.3. Reacción con participación del complemento.

a) Fijación del complemento: La fijación del complemento permite detectar

anticuerpos por la formación de complejos inmunes que fijan complemento por la vía
clásica y que por una reacción secundaria, lisis de un sistema indicador glóbulos rojos-
anti glóbulos rojos permite determinar la cantidad de antígeno o de anticuerpo presente
en la reacción.(Palomo , Ferreira , Sepulveda, Rosemblatt, & Vegara , 2009)
 Figura Nº14:fijación del complemento disponible en:
https://www.google.com.co/search?hl=es&tbm=isch&source=hp&biw=1366&bih=637&ei=q
RXJWrbyN4qc5gL235-
4Bg&q=fijacion+por+complemento&oq=fijacion+por+complemento&gs_l=img.3...4690.1795
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b) Actividad hemolítica del complemento (CH50): La determinación de la actividad

hemolítica del complemento (CH50) permite conocer la actividad funcional del sistema
complemento y se basa en determinar la cantidad mínima de suero (complemento) que
lisa el 50% de glóbulos rojos indicadores que han sido previamente sensibilizados en
forma óptima con su anticuerpo (hemolisina). La hemólisis se produce por la activación
de la vía clásica del complemento.

3.2. Inmunoanálisis con reactivos marcados.

Los inmunoanálisis con reactivos marcados se clasifican en: homogéneos y heterogéneos y

existen dos tipos básicos: competitivo y no competitivo.

3.2.1 Inmunoanálisis fluorescente

a) Microscopia inmunofluorescente: La inmunofluorescencia es una técnica

inmunohistoquímica que permite la localización de antígenos en las células y tejidos,
nos permite también la detección y titulación de anticuerpos específicos. La
fluorescencia es un fenomeno que se produce cuando las células estan excitadas y
producen radiación, energía o luz que terminara cuando no se este en la presencia de
luz excitante. Las moléculas que poseen estas características se llaman fluorocromos.
Los fluorocromos son un tipo de moléculas coloreadas que tienen la capacidad de
absorver radiación y luego son excitadas emitiendo maxima energía a una longitud de
onda. Los fluorocromos máas utilizados son el isotiocinato de fluoresceina, nodamina B
 y ficoeritrina. Hay 2 tipos de inmunofluorescencia que son utilizados en el laboratorio:
(Palomo , Ferreira , Sepulveda, Rosemblatt, & Vegara , 2009)

a. 1) Inmunoflurorescencia directa (IFD) : En esta técnica se utiliza un

anticuerpo específico conjugado con el fluorocromo que se apicara
directamente sobre el sustrato con lo que se permite identificar la estructura
que va a ser responsable de la especificidad. Es especialimente util para
tipificar células e identificar microorganismos.(Palomo , Ferreira , Sepulveda,
Rosemblatt, & Vegara , 2009)

b. 2) Inmunofluorescencia indirecta (IFI) : En esta técnica un anticuerpo que no

está marcado se aplica directamente sobre el sustrato y se visualiza la
reactividad con un conjugado antiinmunoglobulinas-fluorocromo. Es útil para
identificar autoanticuerpos.(Palomo , Ferreira , Sepulveda, Rosemblatt, &
Vegara , 2009).

a) Inmunoanálisis de fluorescencia polarizada: Es un inmunoanálisis homogéneo y

competitivo que utiliza un antigeno marcado con fluoróforo y polarizado, que tiene
un sistema que va a estar basado en la flurometría. Es util para detectar pequeñas
moleculas como drogas y hormonas.(Palomo , Ferreira , Sepulveda, Rosemblatt, &
Vegara , 2009)

b) Inmunoanálisis de fluorescencia unida a enzima: Es un inmunoanálisis

heterogeneo y puede ser tanto de tipo competitivo como de tipo no competitivo, en
el que el inmunoreactante marcado con enzima esta unido a esta unido a un
sustrato flurógenico que permite la detección por flurometría. Utiliza como la
enzima marcadora la fosfatasa alcalina y como sustrato el flurogénico el 4 metil
umbeliferona. Es uno de los métodos más sensibles que se utilizan en el
laboratorio clínico.(Palomo , Ferreira , Sepulveda, Rosemblatt, & Vegara , 2009)

c) Citometría de flujo: Esta técnica permite medir la cantidad de anticuerpo

monoclonal fluorescente que esta unido a cada célula individual, con lo que se
facilita la identificación y la tipificación de distintos subgrupos de poblaciones
celulares conuna rapidez y sensibilidad impresionante.(Palomo , Ferreira ,
Sepulveda, Rosemblatt, & Vegara , 2009)

3.2.2 enzimainmunoanalisis (EIA)

Se introdujo en 1966 por Avrameas y Uriel. Este método se basa en dos fenómenos biológicos:
alta especificidad del anticuerpo por un antígeno (reacción inmunológica) y la amplificación por
reacciones químicas llevadas a cabo por enzimas que actúan sobre sustratos que originan
productos coloreados (reacción indicadora).
La técnica de EIA es utilizada rutinariamente para localización de antígeno o anticuerpo sobre
tejidos o células, para la detección de antígeno o anticuerpos inmovilizados en una fase sólida,
para la titulación de anticuerpo y para la medición de antígeno.
Las enzimas que se utilizan corrientemente para marcar anticuerpo o antígeno son:
 fosfatasa alcalina, cuyo sustrato es el p-nitrofenil-fosfato y la lectura de absorbancia se
lleva a cabo a 405 nm.
 peroxidasa que puede utilizar tres sustratos diferentes: o-fenilendiamina (oPD)/H202;
3,3',5,5'- tetrametilbenzidina (TMB)/H202 y 2,2'-di-azino(3-etilbenzotiazolina 6-ácido
sulfónico (ABTS)/H202 con lecturas de densidad óptica a 492, 450 y 415 nm
respectivamente y beta-galactosidasa, cuyo sustrato es el o-nitrofenil-beta-D-
galactopiranósido (oNPG) y la lectura se realiza 420 nm.
  En los EIA automatizados se usa corrientemente la fosfatasa alcalina como enzima
marcadora y como sustrato el 4-metilumbeliferil fosfato (MUP). El MUP es catalizado a
un producto fluorescente (metilumbeliferona) que es medido por fluorometría.
 El EIA, también puede ser amplificado utilizando la interaccion avidina (estreptavidina)-
biotina. Se utiliza los conjugados anticuerposbiotina y avidina-enzima.(Palomo ,
Ferreira , Sepulveda, Rosemblatt, & Vegara , 2009)

a) EIA homogéneo.

El “enzyme-multiplied immunoassay technique” (EMIT) es un EIA homogéneo y competitivo que

usa una enzima marcadora y el sistema de detección es espectrofotométrico. La enzima
marcadora es unida covalentemente al antígeno en una posición cercana al sitio activo de la
enzima. Durante la reacción inmunológica, cuando el antígeno marcado con la enzima se une
al anticuerpo, el sitio activo de la enzima es bloqueado físicamente y la enzima es inhibida
funcionalmente.
En la forma libre del antígeno marcado con la enzima, la enzima permanece activa
funcionalmente y actuará sobre el sustrato que se añade generando un producto coloreado. El
cambio de color resultante es proporcional a la cantidad de antígeno marcado libre disponible y
debido a la naturaleza competitiva del inmunoanálisis, será proporcional a la cantidad de
analito (antígeno) presente en la muestra. El EMIT se ha automatizado fácilmente y es usado
principalmente en la detección de drogas.(Palomo , Ferreira , Sepulveda, Rosemblatt, & Vegara
, 2009)

b) EIA heterogéneo.

Los procedimientos EIA heterogéneos son en general más sensibles que los homogéneos. El
"enzyme-linked inmunosorbent assay (ELISA) se realiza sobre una fase sólida (placas de
poliestireno u otro similar) y es un EIA heterogéneo, no competitivo y su detección
preferentemente es por espectrofotometría. Es ampliamente utilizado en el laboratorio clínico
en la detección y medición de autoanticuerpos y varias otras proteínas.
Existe una variedad que se realiza sobre papel de nitrocelulosa que se ha llamado
inmunofijacion en punto o "immuno blot, "dotimmunobinding" o "dot"
El "microparticle enzyme immunoassay" (MEIA) es un método heterogéneo, no competitivo y
de tipo “sandwich”. Utiliza una enzima marcadora y el sistema de detección es por fluorometría
o espectrofotometría. Incorpora micropartículas que permiten aumentar el área en la cual
ocurre la reacción antígeno-anticuerpo.(Palomo , Ferreira , Sepulveda, Rosemblatt, & Vegara ,
2009)
Figura N 15. Esquema de enzimainmunoanálisis en fase sólida (ELISA) para detección y
cuantificación de anticuerpos específicos.(Palomo , Ferreira , Sepulveda, Rosemblatt, & Vegara
, 2009) P.g 651.

c) Electroinmunotransferencia ("Western blot" o "Immunoblotting").

Permite estudiar cualitativa y cuantitativamente las reacciones antígenoanticuerpo. Los

antígenos son separados en gel SDS-poliacrilamida y transferidos a una membrana de
nitrocelulosa uniéndose inespecíficamente e identificados con procedimientos
inmunoenzimáticos.
La electroinmunotransferencia se utiliza en el diagnóstico viral (confirmacion de anticuerpos
anti-HIV), tipificación de bacterias (Neisseria meningitidis), detección de autoanticuerpos
(anticuerpos anti-antígenos nucleares extractables), etc.(Palomo , Ferreira , Sepulveda,
Rosemblatt, & Vegara , 2009)

figura N 16. tecnica de western blotting. recuperado de:

http://www.onlinebiologynotes.com/western-blotting-technique-principle-procedure-application/.

3.2.3 radioinmunoanalisis.

El radioinmunoanálisis (RIA) utiliza antígeno o anticuerpo generalmente marcados con isótopos

como, 125I o eventualmente 131I.

a) RIA en fase soluble.

El RIA en fase soluble permite determinar la capacidad de unión de un anticuerpo, por adición
de un moderado exceso de antígeno marcado a un antisuero, los anticuerpos forman
complejos solubles y se precipitan. En el precipitado se mide la radiactividad dando una
estimación de la capacidad de unión del anticuerpo específico por su antígeno. Este
inmunoanálisis en fase soluble, también permite determinar antígeno (RIA clásico) por adición
de un antígeno marcado a una cantidad fija y limitada de anticuerpo, cuya unión puede ser
parcialmente inhibida por la adición de antígeno no marcado. La extensión de esta inhibición
puede ser usada como una medida del antígeno no marcado.
figura N 17. tecnica de inmunoanalisis, recuperado de;
http://www.assignmentpoint.com/science/medical/about-radioimmunoassay-ria.html

b) RIA en fase sólida.

El RIA en fase sólida permite medir un anticuerpo a través de su capacidad de unión al

antígeno que ha sido insolubilizado por adsorción física a un soporte plástico. La
inmunoglobulina unida puede ser estimada por la adición de un anticuerpo
antiinmunoglobulinas radiomarcada producida en otra especie. Este procedimiento se ha
utilizado en la prueba RAST ("radioallergosorbent test") para la determinación de IgE específica
en pacientes alérgicos.

c) Detección inmunorradiométrica para antígenos.

En las pruebas inmunorradiométricas el reactivo marcado es utilizado en exceso. Para la

determinación de antígeno, los anticuerpos están absorbidos sobre un soporte sólido al que se
le agrega la solución de antígeno. Luego el soporte es lavado y la cantidad de antígeno unido
puede ser estimado por la adición en exceso de un anticuerpo radiomarcado.
La aplicación clásica de esta prueba es el RIST ("radioimmunosorbent test") para la
determinación de IgE total, donde el anticuerpo anti-IgE se ha unido covalentemente a
microcristales de celulosa y se le adiciona el suero del paciente y los sueros controles. La IgE
total unida es medida por la adición de un anticuerpo anti-IgE radiomarcado.
Figura N 18. Test radio inmunoabsorbente, recuperado de: https://biology-
forums.com/index.php?action=gallery;sa=view;id=31637

3.2.4. Quimiluminiscencia

La quimiluminiscencia es la emisión de luz producida en ciertas reacciones químicas de

oxidación. La mayoria de las reacciones quimiluminiscentes son de oxidación debido a que la
producción de luz visible requiere reacciones altamente energéticas. La reacción
quimiluminiscente más estudiada ha sido la oxidación del luminol. Los marcadores más
populares son los derivados de isoluminol y ésteres de acridina. Para detectar un marcado
quimiluminiscente se usa una amplia variedad de luminómetros que miden la emisión de luz.
En este último tiempo se está usando como marcador la fosfatasa alcalina que reacciona con
sustratos basados en el adamantil 1,2-dioxetano aril fosfato, que los desfoforila para producir
un fenóxido intermediario y éste al descomponerse produce emisión de luz a 470 nm.
Actualmente, los inmunoanálisis quimiluminiscentes son utilizados por varios analizadores
automatizados. En ellos se determinan drogas, hormonas, marcadores tumorales y otras
proteínas.

Figura Nº16: Esquema de reacciones que producen luminiscencia, disponible en:

https://www.google.com.co/search?hl=es&biw=1366&bih=637&tbm=isch&sa=1&ei=5SLJWr6vN
_KG5wLTrKioDw&q=quimioluminiscencia&oq=quimiolu&gs_l=psy-
ab.3.0.0l10.1407616.1412714.0.1414059.27.13.0.1.1.0.312.1637.0j4j3j1.8.0....0...1c.1.64.psy-
ab..19.8.1457...0i24k1j0i67k1.0.QGiWTvdNFas#imgrc=iJ9G_Knb40OF-M:

3.2.5 Bioluminiscencia

Es un fenomeno natural que se puede encontrar en las formas inferiores de vida. Un sistema
es la luciferina/luciferasa, en la que la lusiferasa va a catalizar la oxidación de la D-luciferina.
En los inmunoanálisis luminiscentes se esta utilizando conjugado anticuerpo-fosfatasa o
conjugado analito-fosfatasa alcalina que va a reaccionar D-luciferina-o-fosfatasa con lo que se
liberara D-luciferina. La D-luciferina es oxidada por la luciferasa con lo que se va a emitir luz.
Esta técnica aun no está disponible en los laboratorios clínicos.
 4. conclusiones.

Debido al avance científico y a la alta tecnología que se emplea actualmente se han diseñado y
creado diversas técnicas que nos permiten y brindan un análisis detallado de la unión del
antígeno o hapteno con el anticuerpo, permitiéndonos estudiar más a fondo esta interacción,
ya que así se conoce si es una reacción específica, de alta afinidad o irreversible.

Una de las técnicas más usadas en la actualidad es el inmunoanalisis, que utiliza como base
sistemas Ag-Ac, base que será clave en todas las subdivisiones que esta técnica posee y por lo
tanto en los diferentes estudios y pruebas que se realicen.
 5. Bibliografía

Palomo , I., Ferreira , A., Sepulveda, C., Rosemblatt, M., & Vegara , U. (2009). Fundamentos de
Inmunologia Basica y Clinica. Editorial Universidad de Talca.