CAPITULO 6 MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO Y AIRE

Esterilización

Eliminación de toda forma de vida de un medio o material, lo que se lleva a acabo generalmente por
medios físicos (filtración) o muerte de organismos por calor, productos químicos u otra vía. Esta
definición excluye por lo tanto cualquier técnica que resulte solamente en un daño de los
microorganismos.

Desinfección

Remoción o destrucción por cualquier vía de organismos vivos que pueden causar daño o infección.
No destruye todos, sólo los que producen resultados no deseados. Ejemplo antiséptico.

Asepsia

Es la exclusión continuada de microrganismos contaminantes. El medio es esterilizado para luego

ser inoculado en laboratorios y fermentaciones industriales.

Objetivo de esterilización en microbiología industrial:

“Evitar la competición por los nutrientes en medio de cultivo y permitir así el cultivo de
microrganismos específicos que utilizan en un proceso de fermentación de los rendimientos
esperados en biomasa o metabolitos específicos”.

Evitar efectos adversos de la presencia de organismos extraños, que podrían:

a) Consumir nutrientes, rebajando el rendimiento.

b) Producir sustancias inhibidoras a proceso.
c) Formar compuestos que descomponen el producto.

Métodos de esterilización

Destrucción total de Eliminación con

Muerte o inactivación
microrganismos medios físicos
Calentamiento seco o Esterilización de
Proceso violento
húmedo gases líquidos
Filtración:
Aplicación de llama Radiaciones - filtros
absolutos
Agentes oxidantes, - Filtros
Agentes químicos
empleo restringido fibrosos

Para poder llevar a cabo una fermentación con éxito es imprescindible y obligatorio tener en todas
las etapas cultivos libres de contaminantes, desde el cultivo preliminar hasta el fermentador de
producción. Por lo tanto, el fermentador y su equipamiento, así como el medio de cultivo deben estar
estériles antes de la inoculación. Además, el aire que se suministra durante la fermentación debe ser
estéril y no deben existir roturas mecánicas en el fermentador que podrían permitir la entrada de
microorganismos. También se deben esterilizar los aditivos (antiespumantes), sin embargo los ácidos
y bases concentrados no es necesario esterilizarlos.
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Un biorreactor puede ser esterilizado, destruyendo los microorganismos, con algún agente letal como
calor, radiación o un producto químico o bien separando los organismos viables mediante un
procedimiento físico como la filtración. Durante la fermentación se deben observar dos puntos para
asegurar la esterilidad:

- Esterilidad en el medio de cultivo.

- Esterilidad del aire que entra y sale.

Para lo cual es necesaria una construcción apropiada del biorreactor que facilite la esterilización así
como la prevención de la contaminación durante la fermentación.

1. Esterilización del medio de cultivo

El medio nutritivo que se prepara inicialmente contiene una variedad de células vegetativas diferentes
y de esporas que proceden de los constituyentes del medio, del agua y del recipiente. Estos
microorganismos deben ser eliminados por un procedimiento adecuado antes de la inoculación.
Existen un conjunto de procedimientos para la esterilización, pero en la práctica, para instalaciones a
gran escala, el calor es el principal mecanismo utilizado.

La esterilización por filtración se utiliza frecuentemente para todos los componentes de la solución
de nutrientes que son sensibles al calor y que serían por tanto desnaturalizados durante el proceso de
esterilización por vapor utilizado normalmente en fermentación industrial.
A.- Esterilización discontinua
La mayor parte de los medios de cultivo se esterilizan en la actualidad en volúmenes discontinuos en
el biorreactor a 121°C. Los tiempos de esterilización aproximados pueden ser calculados a partir de
la naturaleza del medio y del tamaño del fermentador. No solamente debe ser esterilizado el medio
nutritivo, sino también las uniones, válvulas y electrodos del propio fermentador.
Un método de esterilización es inyectar vapor en la camisa del fermentador o en los serpentines
interiores (esterilización indirecta). Otro método es inyectar vapor en la propia solución de nutrientes
(procedimiento directo), en cuyo caso un pre-requisito es tener vapor puro (libre de aditivos
químicos).
B.- Esterilización continua.

Las dos desventajas principales de la esterilización discontinua, daño al medio de cultivo y alto
consumo de energía, pueden ser evitadas en gran parte mediante el uso de un procedimiento de
esterilización continua. Aunque la esterilización continua es la etapa preliminar lógica en una
fermentación continua a escala industrial, también se puede utilizar en la fermentación discontinua
obteniendo posibles mayores rendimientos en el tiempo y el espacio asignados.
En el proceso continuo que utiliza intercambiadores de calor, la solución de nutrientes, en el primer
intercambiador de calor, se precalienta a 90-120° C durante 20-30 segundos por la solución nutritiva
previamente esterilizada que sale. Luego, en el segundo intercambiador de calor, se calienta
indirectamente con vapor a 140° C. Esta temperatura se mantiene durante 30-120 segundos en una
tubería de mantenimiento antes de que sea colocada en el primer intercambiador mediante
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enfriamiento preliminar y posteriormente en un tercer cambiador para refrigeración a la temperatura

del fermentador. La fase de enfriamiento es sólo de 20-30 segundos.

2. Esterilización del aire de fermentación

A 121ºC durante 30-60 minutos y se deja enfriar. Para conseguir que la temperatura sea asi de elevada
se inyecta vapor de agua. Hay dos maneras de inyectar el vapor:
- Indirecta: alrededor del fermentador, con lo que se calienta este. Inyectar vapor en la camisa del
fermentador o en los serpentines interiores.
- Directa: inyectar el vapor de agua en el interior del fermentador, es la peor porque se altera la
composición del medio, hay que usar vapor de agua puro sin aditivos que son tóxicos y se quedan en
el medio de cultivo y al inocular el microorganismo no va a crecer.
Inconvenientes: alteración del medio de cultivo, alto consumo de energía, el tiempo es muy largo ya
que tarda mucho tiempo en calentarse lo que se une al tiempo en si de la esterilización, al final 5
horas.

La mayor parte de las fermentaciones industriales operan en condiciones de agitación vigorosa y el

aire que se suministra al fermentador debe ser esterilizado. El número de partículas y
microorganismos en el aire varía en gran medida dependiendo de la localización de la planta, el
movimiento del aire y el tratamiento previo del aire. Como media, el aire exterior tiene 10 - 100.000
partículas por m3 y 5 - 2.000 microorganismos por m3. De estos, el 50% son esporas de hongos y el
40% son bacterias G (-). Los fermentadores funcionan generalmente con velocidades de aireación de
0,5 - 1,0 vvm (volumen de aire/volumen de líquido por minuto).
Un fermentador que tenga un volumen de trabajo de 50 m3 con una velocidad de aireación de 1 vvm
necesita 3.000m3 de aire estéril por hora.
Actualmente, en los sistemas industriales el aire se esteriliza por filtración. En los sistemas más
antiguos se instalaban filtros en profundidad como los de lana de vidrio en los que las partículas son
atrapadas por una combinación de efectos físicos (inercia, bloqueo, difusión, gravedad y atracción
electrostática).
El aire que sale del fermentador también debe ser esterilizado, sobre todo si se trabaja con organismos
recombinantes. No sólo como medida de seguridad, sino también para prevenir que las cepas
industriales se liberen al medio ambiente y por lo tanto estén disponibles de una forma gratuita para
los competidores. De nuevo, se utiliza la filtración.

Métodos de esterilización de gases:

1. Filtración
2. Inyección de gas (ozono)
3. Depuración de gas
4. Radiación (UV)
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5. Calor

- Filtros en profundidad, como la lana de vidrio se retienen las partículas por distintas propiedades
físico químicas de las partículas que hacen que se retengan. se usan para cosas gruesas

- Filtros de membrana (en microbiología) son filtros absolutos, consisten en una membrana con
poros que podemos determinar el tamaño de estos, si tenemos un tamaño de poro inferior a dos
micras que pueda medir una bacteria, esa bacteria no va a atravesar el agujero y queda retenida.
Podemos obtener tamaño de poros de todos los tamaños y se suelen usar esteres de células,
polisulfona o lynon. En industria es muy importante que se filtre el aire que salga, el agotado, ya q
puede llevarse el MO que nos interesa.