UNIVERSIDAD TÉCNICA PARTICULAR DE LOJA

CULTIVOS CELULARES “A”

PRÁCTICA DE LABORATORIO

CULTIVO DE EXPLANTE PRIMARIO

Jiménez Torres Karol Sulay 1, Padilla Rojas Barbara Marisol 2, Ramos Bastidas
Katherine Estefany 3, Sinche Espinosa Soraya Melania 4.

FECHA: 13 de Julio de 2018

*Profesionales en Formación, Ciencias de la Salud, Titulación de Bioquímica y Farmacia,
Universidad Técnica Particular de Loja, San Cayetano Alto s/n C.P. 11 01 608; Loja, Ecuador

RESUMEN
El cultivo de explante primario es el más utilizado, se obtiene a partir de la disgregación de
células de un tejido o de órganos (embrión de pollo), el cual se coloca en la interface sólido-
líquido de un soporte de vidrio o de plástico, dónde las células se adhieren a la superficie y las
células de la periferia pueden migrar y proliferar por la superficie del soporte. El explante fue
sembrado en medio RPMI suplementado con SFB AL 10%, y se incubó a una temperatura de 37
°C y 5 % de CO2. Posteriormente se procedió a observar y monitorear el crecimiento y estado de
las células mediante microscopia invertida y realizando los adecuados cambios de medio,
finalmente se procedió a la tinción de los explantes con cristal violeta para observar su
crecimiento y morfología.
Palabras clave: Explante primario, Embrión de pollo, RPMI, SFB, cristal violeta.

INTRODUCCIÓN normales. Adicionalmente, se vio la

necesidad de utilizar técnicas de cultivo
La historia de los cultivos celulares
celular para estudiar el comportamiento
comenzó hace más de 100 años, cuando
de las células animales libres de
en 1885 Wilhelm Roux cultivó células
influencia sistémica, tanto en
de embrión de pollo en solución salina
condiciones normales como en
durante algunos días, demostrando que
condiciones de estrés. El zoólogo
las células embrionarias pueden
estadounidense R.G. Harrison es
sobrevivir por fuera del cuerpo del
considerado el iniciador de los cultivos
animal de origen. A principios del siglo
de tejidos animales. Fue el primero
XX, el interés por desarrollar cultivos
(1907) que empleó técnicas in vitro para
celulares fue promovido por la necesidad
el estudio de fenómenos in vivo,
de entender los eventos fisiológicos
realizando cultivos de médula espinal
embrionaria de anfibios. (Monsalve, p.
29-46)
Considerando que un cultivo celular es el
conjunto de técnicas que permiten el
mantenimiento y crecimiento de las
células in vitro bajo condiciones
controladas, conservando al máximo sus
propiedades fisiológicas, bioquímicas y
genéticas, se puede dividir en tres grupos
de técnicas: • Cultivo de órgano • Cultivo
de explante primario • Cultivo celular.
(García, 2013)
El cultivo de explante primario consiste
en fragmentos de tejidos o de órganos
que se adhieren a una superficie,
quedando en la interfase sólido-líquido,
y en la que las células de la periferia
pueden proliferar o migrar. (Cepeda,
2008).
Como sabemos en un cultivo se pueden
controlar las condiciones físico-
químicas como pH, temperatura, presión
osmótica, presión parcial de O2 y CO2,
de la misma manera fisiológicos entre las
que tenemos hormonas, factores de
crecimiento, densidad celular, entre
otras. En esta práctica utilizamos células
de embrión de pollo, las cuales van a
requerir cuidados específicos, mientras
más joven sea el embrión, mayor
estabilidad y adaptación tendrá este en el
medio de cultivo, el embrión de pollo ha
sido utilizado como un modelo del
desarrollo de vertebrados por su
adaptabilidad en la manipulación de
estudios experimentales además de tener
una accesibilidad a diferentes tejidos que
crecen en cultivo, por lo que han hecho
de los huevos embrionados la opción
más indicada. (Freshney, 2010).
El objetivo principal en esta práctica es
la obtención de un cultivo celular
primario, a partir de células de algunos
órganos de un embrión de pollo, el
mismo que tiene que tener un mínimo de
9 días o máximo 14 días, sabiendo que a
medida que el pollo crece los líquidos
extracelulares de este disminuyen (Islas,
Rojas & León, 2011).
MATERIALES Y MÉTODOS
MATERIALES:
 Bisturí.
 Pinzas
 Pipeta de 10 ml, 5 ml y 1 ml.
 Cajas Petri.
 Frasco de desechos.
 Lámparas de alcohol.
Material biológico:
Embrión de pollo (7 a 10 días)
Reactivos:
 Medio suplementado HAM F-
12/ RPMI al 10%.
 PBS con antibiótico-antimicotico
 Metanol
 Cristal violeta
Equipos:
 Microscopio invertido.
 Incubadora.
METODOLOGÍA
Día 1
1. Desinfectar la cascara del huevo
con alcohol al 70%.
2. Romper y sacar la cascara con la
pinza de diente de ratón, con la
pinza punta roma, romper la
membrana coclear y sacar el
 embrión deforma estéril, tratando 3. Eliminar el medio de la caja y
de no tocar la yema. lavar con 5mL de
3. Colocar el embrión en una caja PBS+antibiótico-antimicotico al
Petri estéril y lavarlo con 10mL 10% y eliminar (evitar llevar los
de PBS+antibiótico-antimicotico explantes).
al 10%. 4. Añadir 5mL de medio fresco
4. Descartar, con el bisturí: cabeza, suplementado al 10% SFB.
alas y patas. 5. Llevar a la incubadora de CO2
5. Pasar el cuerpo a otra caja estéril
Día 3 y 4
y diseccionar longitudinalmente
y rescatar los órganos principales 1. Sacar de la incubadora de CO2 la
(corazón, hígado, riñón) caja, monitorear las células.
6. Pasar el material limpio a una 2. Si es necesario cambiar el medio.
caja Petri estéril que contenga
Día 5
PBS+antibiótico-antimicotico al
10%, cortar en trozos muy Parte NO estéril
pequeños.
1. Retirar el medio de la caja y lavar
7. Tomar los pedazos pequeños con
con 5mL de PBS y descartar.
una pipeta de 10mL previamente
2. Adicionar 5mL de PBS/metanol
humedecida
frío 1:1, dejar reposar por 2
8. Colocar alrededor de 15
minutos y retirar.
expelentes en una caja Petri con
3. Colocar 5mL de metanol frío por
5mL medio suplementado al
las paredes de la caja por
10% de SFB homogenizar y
5minutos, eliminar el metano y
etiquetar.
dejar secar a temperatura
9. Llevar la caja Petri con los
ambiente antes de tinción.
expelentes a la incubadora 5%
4. Teñir con cristal violeta por 20
CO2 y 90% humedad a 37ºC.
minutos (reciclar el colorante).
Día 2 5. Sumergir la caja en una fuente
con agua y dejar secar.
1. Retirar de la incubadora de CO2
6. Observar al microscopio
y observar el aspecto y color del
invertido e identificar el tipo de
medio.
células que han crecido.
2. Observar al microscopio
invertido si se han adherido los
explantes y el cultivo está libre
de contaminación.
RESULTADOS
DÍA RESULTADOS
2 Se observan ciertos explantes
grandes y pequeños en el
microscopio invertido (Fig.1),
tratando de adherirse a la
superficie sólida de la caja Petri,
no hay presencia de
contaminación.

3 Se observa gran número de

explantes tanto grandes como
pequeños y algunos restos
celulares a través del microscopio
(Fig.2), las células están más
agrupadas, adheridas y fijas. No
se observa contaminación alguna.
4 Se observaron células
Figura 3. Explante primario
pertenecientes al tejido
de embrión de pollo, células
embrionario de pollo. (Fig.93
totalmente adheridas.
5 Después de la tinción, se observan
fibroblastos (Fig.4) del tejido
embrionario.

Figura 1. Explante primario Figura 4. Fibroblastos de tejido

al primer día de incubación. embrionario de pollo, tinción
Cristal violeta.

Figura 2. Explante primario de

embrión de pollo, células adheridas.
DISCUSIÓN diferenciados, esto se puede deber al
método de disgregación (mecánico) que
Las aves representan varios beneficios
se usó, es decir la capacidad de las
en cuanto al desarrollo científico, los
células para sobrevivir a éste y por otra
huevos de aves fertilizados son de fácil
parte tiene que ver el nivel de adherencia
acceso debido a su economía (Contreras,
de las células al sustrato. En un estudio
Martínez, Santos y Rojo,2017). En este
similar realizado por Armijos, Carrión,
caso se utilizaron embriones de pollo
Gordillo y Veintimilla (2017),
como material de partida por diversas
concluyeron que existen varias causas
razones como la gran disponibilidad de
para que no se puedan cultivar
los mismos, el hecho de que son más
correctamente las células embrionales de
grandes que los embriones de ratón en
pollo entre ellas están la muerte del
esta etapa y es posible diseccionar algún
embrión, la edad de éste ya que mientras
rudimento de órgano en particular de ser
más joven sea las células presentarán
necesario para cultivar un tipo celular
mayor viabilidad, como ya se mencionó
específico y dan buen rendimiento de
y las condiciones de asepsia que se deben
células en cultivos primarios (Quilmes,
aplicar correctamente. En nuestro ensayo
2013). Se desarrollan dentro de 20 a 21
observamos restos celulares pudo
días, se pueden mantener en incubadoras
deberse a que no se lavó adecuadamente
artificiales, el embrión es fácilmente
con PBS, en comparación con un estudio
manipulable, además las diferentes
realizado por Sergio Calvo García el cual
células y tejidos del pollo son factibles
menciona que el principal inconveniente
de llevar a condiciones de cultivo celular
es la pérdida de heterogeneidad celular
(Contreras, Martínez, Santos y
de partida, ya que la población se hace
Rojo,2017) debido a que presentan
uniforme y homogénea. Además, se
pluripotencia y características que
pierden las interacciones célula-célula y
permiten una diferenciación in vitro.
las interacciones de la célula con la
En nuestros resultados se observan matriz extracelular. A pesar de todo esto
bastante adherencia de explantes tanto las células son capaces de proliferar y la
grandes como pequeños en contraste con población celular crece notablemente
otros resultados de compañeros que no (García, 2017).
se observaron explantes totalmente
CONCLUSIÓN contaminación a pesar de que
presentaron restos celulares que no tuvo
La presente práctica para que sea
mayor importancia.
realizada con los resultados esperados
debe tener en cuenta todas las medidas
de asepsia al igual que el embrión de
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
pollo debe ser lo más joven posible, esto
nos da una mejor proliferación de Contreras, J., Martínez, P., Santos, I., y
células. En nuestro estudio se aprecian Rojo, C. (2017). El embrión de
un tipo marcado de células, fibroblastos pollo como modelo de
que nos da a entender que se trata del experimentación: ven y descubre
tejido embrionario del pollo, no hubo la embriología. Recuperado de:
 http://www.lcsanpablo.es/mange
l/pollo.pdf.
García, S. C. (2013). Cultivo de células
en 3D: la nueva dimensión de los
cultivos celulares. Cuadernos del
Tomás, (5), 215-232.
Cultek. (2007). Cultivos Celulares.
Recuperado de
http://www.cultek.com/inf/otros/
soluciones/Cultivos%20Celulare
s/Aplica_Cultivos_Celulares_20
07.pdf.
Monsalve, M. E. C. Cultivos celulares.
Fondo Editorial Biogénesis, 29-
46.
García, S. C. (2017). Cultivo de células
en 3D, La nueva dimensión de
los cultivos celulares. Dialnet,
217-220.
Quilmes, A. (2013). Cultivo primario
de embrión de pollo. Buenos
Aires: Biología celular y
molecular.
uciones/Cultivos%20Celulares/Aplica_
Cultivos_Celulares_2007.pdf.
Freshney, I. (2010). Culture of Animal
Cells: A Manual of Basic
Technique and Specialize
Applications (six ed.).
WileyBlackwell Editorial. New
Jersey.
Cepeda, L. & Lozano, K. (2008).
Estandarización de la técnica de
cultivo de fibroblastos en
Universidad Autónoma de
Occidente. Facultad de ingeniería
departamento de automática y
electrónica programa ingeniería
biomédica. Colombia. Santiago
de Cali.
Islas, L., Rojas, M., León, P., et al.
(2011) Embrión de Pollo.
Universidad Nacional Autónoma
de México. Facultad de Estudios
Superiores Saragoza.
 ANEXOS

Extracción del embrión de pollo de Embrión de pollo en caja Petri con

su cascarón. PBS+antibiótico-antimicotico.
Fuente: Autores Fuente: Autores

Explante primario adherido a la caja Explante teñido con cristal violeta.

Petri, se observa proliferación de las Se observa predominancia de
células. fibroblastos.
Fuente: Autores Fuente: Autores