ESTREPTOMETRIA: MÉTODO RECUENTO EN PLACA Práctica No.

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INTRODUCCIÓN
El grupo D de Lancefield incluye además, de los enterococos, especies menos
resistentes, tales como Streptococcus bovis y Streptococcus equinus, y a todo este
grupo se le denomina Streptococcus Fecales. Estos se encuentran normalmente en las
heces de mamíferos y humanos, como demuestran los estudios realizados por Suttiaux
y Mossel en 1961, en el que llaman la atención sobre el valor de los alimentos no
industrializados, es decir, brutos, y de la asociación entre el Grupo D de estreptococos y
las bacterias del grupo coli-aerogenes. como indicadores de la contaminación fecal.
 Streptococcus
La presencia de gran número de enterococos en un alimento, Grupo Origen Origen no
significa una calidad microbiológica dudosa (excepto en los Enterococcus no fecal
casos en que se haya utilizado cepas específicas para
Humano
fermentar el alimento), ya que su presencia indica, bien la
exposición del mismo a condiciones que pudieran haber S. faecalis S. ovis S. mitis
permitido una amplia multiplicación de muchas especies no S. faecium S. S.
deseables de microorganismos, o la deficiencia en las S. gallinarum equinus salivarius
prácticas sanitarias. Los enterococos pueden tener un papel S. avium
muy importante como indicadores de una limpieza y desinfección deficientes en las
plantas y fábricas de alimentos a causa de su gran resistencia a la desecación, a las altas
temperaturas, a los detergentes y a los desinfectantes. Debido a su mayor resistencia a
la congelación, los estreptococos se prefieren como microorganismos indicadores de la
falta de limpieza y desinfección de los alimentos congelados y de modo semejante
pueden ser muy indicativos en los alimentos que fueron tratados por el calor, o
deshidratados y por procesos que destruyen organismos indicadores mas sensibles,
tales como las Enterobacteriaceas. Justamente, esta resistencia es la razón de la
imprecisión de estos cocos como indicadores generales de la contaminación fecal, ya
que pueden sobrevivir en condiciones adversas, lo que significa que guardan escasa
relación la posible presencia de agentes patógenos mucho menos resistentes, tales como
Salmonella sp. y Shigella sp. , que aún cuando hubiesen llegado al mismo tiempo que
los cocos al alimento, posiblemente no habrían sobrevivido.

OBJETIVO
El objetivo que persigue la práctica siguiente es:
Adiestrar en los métodos y procedimientos de preparación, lectura e interpretación
de los análisis microbiológicos para estreptometria.
Conocer el procedimiento de determinación de Estreptococos a través del método
de Recuento en Placa y pruebas bioquímicas, a partir de muestras de alimentos
sospechosos.
Determinar si la muestra de alimento usado para este fin es apto o no para el
consumo humano, así como si se encuentra dentro de los parámetros permisibles
según DIGESA e INDECOPI para el caso peruano.

REACTIVOS y MATERIALES
- Incubadora - Muestra: leche, carne, pescado u otro alimento.
- Agua destilada - Caldo Infusión Cerebro Corazón (Caldo BHI)
- Autoclave - Pipetas de 1 ml. o 5 ml.
- Agitador Magnético - Bombilla Propipeta Universal u otra
- Mechero de alcohol - Agar Packer o Agar Selectivo para Estreptococos, Medio
Bilis – esculina.
- Espátula de Drigalski - Caldo Infusión Cerebro Corazón (Caldo BHI) con 6,5% de
NaCl.
- Colorante Gram. - Placa Petri esteriles (100 x 15 mm.)
- Matraces de 500 ml. - Solución de Peróxido de Hidrógeno 3%
- Medio bilis-esculina.
 - Diluyente: (agua peptonada 0,1%, Citrato de sodio 2%; Buffer fosfato o solución
salina peptonada)

PROCEDIMIENTO
A) Numeración por el
Método Recuento
en Placa
a) Preparar 5 g. ó ml. de muestra en 45 ml. de diluyente, como solución patrón.
b) 9 ml. de diluyente + 1 ml. de solución patrón corresponderá a una dilución de
10-1.
c) 9 ml de diluyente + 1 ml. de dilución 10-1 formará la dilución de 10-2.
d) 9 ml. de diluyente + 1 ml. de dilución de 10 -2 para la dilución de 10-3. Y así
sucesivamente.
e) Pipetear por duplicado a placas de Petri estériles, alícuotas de 1 ml de cada
una de las diluciones decimales de la muestra. Si la muestra se sospecha que
esta muy contaminada, efectuar diluciones mas elevadas.
f) Adicionar rápidamente a cada placa, 15 ml de Agar Packer o Agar Selectivo
de Estreptococos licuado y temperado a 44—46ºC. Mezclar las alícuotas y el
agar, por movimientos de rotación y de vaivén de las placas.
g) Después de solidificado el Agar, incubar las placas invertidas a 35-37ºC por
72 horas (Agar Packer) ó 48 horas (Agar Selectivo de Estreptococos).
h) Seleccionar las placas que contengan entre 30 y 300 colonias pequeñas de
color violeta en Agar Packer o colonias de color rosado o rojo en placas de
Agar Selectivo que contengan entre 30 y 300 colonias (Recuento presuntivo
de Enterococos).
i) Seleccionar de 5 a 10 colonias características de las placas de Agar Packer o
de placas de Agar Selectivo para Estreptococos e inocular individualmente en
tubos conteniendo Caldo infusión Cerebro Corazón (caldo BHI). Incubar a
35—37ºC por 18 a 24 horas.
j) Preparar coloraciones Gram de cada uno de los cultivos y observar la
presencia de cocos Gram positivos en pares o cadenas cortas.
k) Después de efectuar la Prueba de la Catalasa el el ítem subsiguiente, inocular
a cada uno de los tubos de caldo infusión cerebro corazón con los cultivos de
Estreptococos aislados e incubar a 44—46°C por 48 horas y observar
crecimiento. Los Streptococcus catalasa negativo que crecen a 44—46ºC y en
presencia de NaCl 6.5% confirman que el cultivo es un Enterococo (Figura 4-
1).

B) Identificación
Bioquímica: Prueba
de la Catalasa
La catalasa es una enzima que descompone el peróxido de hidrógeno en oxígeno
y agua. Químicamente, la catalasa es una hemoproteína de estructura similar a la
de la hemoglobina, excepto que los 4 átomos de hierro de la molécula están en
estado oxidado (Fe+++) en lugar de reducido (Fe++). Excluyendo los estreptococos,
la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas poseen actividad
catalasa.
 Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la
mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen
citocromo. La principal excepción es Streptococcus.
Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes
géneros:
Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+).
Bacillus (+) de Clostridium (-).
Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+), con las excepciones de C.
pyogenes y C. haemolyticum, ambos (-) de Erysipelothrix (-).

El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales del

metabolismo oxidativo aeróbico de los hidratos de carbono. Si se deja acumular,
el peróxido de hidrógeno es letal para las células bacterianas. La catalasa
transforma el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno de acuerdo a la siguiente
reacción:

H2O2  H2O + O2 (burbujas de gas)

La prueba de catalasa, llevada a cabo en portaobjetos o en tubos, es comúnmente

utilizada para diferenciar estreptococos (negativos) de estafilococos (positivos). En
esta oportunidad se efectuará a través de tubos de ensayo, el mismo es el
siguiente: Método del tubo de ensayo:
a. Tomar aproximadamente 3 ml de cada cultivo de Streptococcus
b. Mezclar en otro tubo con 0.5 ml de solución de peróxido de hidrógeno al 3%.
c. Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo). La no
aparición de burbujas (catalasa negativo) confirma la presencia de
Streptococcus en el cultivo.
Precauciones: Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre,
se debe tener la precaución de no retirar algo de agar con el asa al retirar la colonia
ya que los eritrocitos del medio contienen catalasa y su presencia dará un falso
resultado positivo.

Prueba de la Bilis Esculina

La prueba de la bilis-esculina está basada en la capacidad de ciertas bacterias,
particularmente los estreptococos del grupo D, de hidrolizar la esculina en
presencia de bilis al 1 o 4%. La esculina es, químicamente, un derivado de la
cumarina (6-beta-glucósido-7-hidroxicumarina), que por su estructura pertenece a
los glucósidos. Por definición, éstos están constituídos por dos restos unidos por
un puente de oxígeno. En el caso de la esculina, uno de los restos es una glucosa
y el otro la 7-hidroxicumarina (que no es un hidrato de carbono, y es denominado
aglucona).
El principio esta en que, las bacterias capaces de desarrollar en bilis y también
hidrolizar esculina, producen glucosa y esculetina (7,7 dihidroxicumarina) y ésta
puede visualizarse en un medio con una sal de hierro, por formación de un
complejo marrón oscuro o negro.
Algunos medios bilis-esculina incluyen también azida sódica para inhibir el
desarrollo de organismos Gram negativos, transformándose en selectivos para
estreptococos. Se procede de la siguiente manera:
 a) Se estría la muestra de microorganismos en placas o tubos en pico de flauta
del Medio Bilis-esculina. b) Se incuba a 37°C durante 24 horas.
c) Interpretación
La esculetina difunde hacia el medio de agar por ser hidrosoluble. La reacción
es positiva si se observa un ennegrecimiento difuso del tubo o un halo marrón
oscuro o negro alrededor de las colonias en placa. Controles
Positivo : Estreptococo del grupo
D
Negativo : Estreptococo no del
grupo D

CUESTIONARIO
1. Diga Ud. el fundamento por la cual presenta la reacción de las pruebas catalasa y
bilis-esculina.
2. ¿Qué microorganismos incluye al grupo D de Lancefield?
3. ¿Por qué es importante los estreptococos en la salud humana?
4. ¿Quienes están considerados como estreptococos fecales o enterococos?
5. Morfológicamente, ¿que características tienen los estreptococos? Mencione.
6.Seleccionar dos placas correspondientes a una dilución que contenga entre 30 y 300 colonias
utilizando un contador de colonias.
7.Tomar la media aritmética de los 2 recuentos y multiplicar por el factor de dilución (recíproco
de la dilución utilizada). Reportar según el caso, el resultado como número de
microorganismos aerobios mesófilos por gramo o mililitro.
Ejemplo: Dilución 10-2
Placa 1 : 72 colonias x 102 = 7,200
Placa 2 : 77 colonias x 102 = 7,700
Se promedia: 7,200+7,700 = 7,450 Se reporta 7,450 colonias/g ó ml.
2
Se reporta 7,450 colonias/g ó ml.
8.Si las placas de 2 diluciones consecutivas presentan recuentos menores que 30 y mayores
que 300, tomar el promedio de los 2 recuentos.
Ejemplo: Dilución 10-2
NO. de colonias contadas: 350
Dilución 10-3
NO. de colonias contadas: 27
Se promedia: 350 x 102 = 35,000
27x 103 = 27,000
35,000 + 27,000 = 31 000
 2
Se reporta 31,000 colonias/g ó ml
9.Si el número de colonias de las placas de 2 diluciones consecutivas están dentro del rango de
30 - 300, computar el recuento para cada una de las diluciones y establecer la relación de los
2 recuentos. Si el cociente es menor que 2, reportar el promedio de los 2 valores, pero, si el
recuento mayor contiene 2 veces o más al menor, en este caso se reportará el recuento del
menor.
Ejemplo 1: Dilución 10-1
NO de colonias contadas: 290
Dilución 10-2
NO de colonias contadas: 35
Se relaciona el cómputo de los 2 recuentos:
3,500 = 1,2
2,900
En este caso se reporta el promedio
2.900 + 3.500 = 3,200
2
Ejemplo 2: Dilución 10-2
NO de colonias contadas: 170
Dilución 10-3
NO de colonias contadas: 45
Se relaciona el cómputo de los recuentos:
45,000 = 2,2
17,000
En este caso se reporta el recuento menor, es decir: 17,000 colonias por g o
mi