MÉTODO DE LA CIANOMETAHEMOGLOBINA

La hemoglobina es una proteína conjugada contenida en el interior de los eritrocitos a

razón de 300000000 moléculas de hemoglobina por cada eritrocito en los humanos. Sirve
como vehículo para el transporte de oxigeno de los pulmones, donde la tensión de O2 es
elevada, hacia los tejidos, donde es baja.
Una molécula de hemoglobina es un tetrámero que consta de dos pares de cadena de
polipéptidos, dos subonidades alfa y dod beta que está enfrentadas entre sí en torno a una
cavidad en el centro de la molécula. Cada subunidad contiene un grupo hemo (región
ligante de oxígeno, que contiene un átomo de hierro ferroso), por lo cual una molécula de
hemoglobina puede unir 4 moléculas de oxígeno.
La hemoglobina reducida es hemoglobina con hierro no asociado al oxígeno. Cuando
cada grupo hem se asocia con una molécula de oxígeno, la hemoglobina toma la forma
de oxihemoglobina.
Tanto en la hemoglobina reducida como en la oxihemoglobina, el hierro permanece en
estado ferroso (Fe ++. Con el hierro oxidado al estado férrico se forma Meta hemoglobina
y la molécula pierde su capacidad para transportar oxígeno y dióxido de carbono.
El método que se utilizara para realizar esta determinación se denomina Método de la
Cianometahemoglobina y se fundamenta en que al combinar un volumen determinado de
sangre con una solución que contiene k3fe (CN)6 y KCN (solución de Drabkin), el
ferrocianuro convierte el hierro ferroso de las hemoglobinas en férrico, para formar
metahemoglobina y la molécula pierde su capacidad para transportar O2. Luego la meta
hemoglobina se combina con el cianuro de potasio para formar cianometahemoglobina
de color rojo anaranjado brillante, apto para la determinación calorimétrica.
El objetivo es determinar la concentración de hemoglobina en una muestra de sangre
utilizando el método espectrofométrico o método de cianometahemoglobina.
MATERIALES
 10 tubos de ensayo
 1 gradilla
 alcohol rectificado
 algodón
 jeringas desechables
 torniquete
 pipeta automática (20 ul)
 pipetas graduadas de 5 a 10 ml
 puntas amarillas adaptables para pipeta automática
 guantes
 tubos de espectrofotómetro
 espectrofotómetro spectronic 20
REACTIVOS
A) Solución de Drabkin:
- Bicarbonato de sodio---- 1g
- Cianuro de potasio-------0,05g
- Ferrocianuro de potasio---0,2g
- H20 deshilada-------------1000 ml
Esta solución tiene un pH de 8,6. Debe ser de color amarillo y transparente y al medir su
densidad óptica contra agua como blanco, esta debe ser cero. La solución debe
guardarse en frasco oscuro y debe descartarse si esta turbia o decolorada. El reactivo es
un poco toxico pero debe manejarse con cuidado.
a) Muestra de sangre total con anticoagulante (EDTA)
b) Anticoabulante (EDTA)
c) Patrón de hemoglobina.

PROCEDIMIENTO
Parte 1: realización de la curva patrón o curva de calibración
a) Realizar un espectro de absorción abs. vs. longitud de onda para una muestra de
sangre de concentración conocida (12 a 14 mg %) Para ello se toma con la pipeta
automática 20 ul de la sangre y se diluye en ml de la solución de Drabkin. Se lee
luego a diferentes longitudes de onda (400 a 600) y se grafica en papel
milimetrado.
b) Realizar 6 disoluciones de la sangre de concentración conocida utilizando siempre
un volumen constante de sangre de 20 ul con pipeta automática variando solo el
volumen de solución de Drabkin en cada tubo. Podrían ser volúmenes de 4, 5,7,10
y 12 ml. Luego, para graficar la curva patrón, medir las absorbancias de cada una
de las diluciones y realizar un gráfico de abs. Vs. Concentración de hemoglobina.
Parte 2: determinación de una concentración de hemoglobina desconocida
- Encender el espectrofotómetro
- Chocar 5 ml de solución de Drabkin en un tubo
- Mezclar suavemente la mezcla de sangre (agitar el frasco 20 veces)
- Con la pipeta automática tomar 20 ul de la sangre, limpiando cuidadosamente la
parte exterior de las puntas de las pipetas
- Introducir la pipeta y mezclar la sangre con el reactivo de Drabkin contenido con
el tubo
- Mezclar bien y esperar 5 minutos
- Leer la absorbancia utilizado como blanco un tubo con solución de Drabkin
- Para el cálculo de los resultados (concentración de Hb) extrapolar en la curva
patrón
- Sacar conclusiones